Name: Méthode diagonale à mesure synergie entre n’importe quel nombre de médicaments (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Apprenez la méthode diagonale pour mesurer les synergies médicamenteuses selon l'additivité de Loewe. Cette technique efficace permet d'étudier les interactions entre plusieurs agents antibiotiques et d'identifier les combinaisons synergiques ou antagonistes.

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Ce travail a été financé par NIGM Grant P50GM107618. Les auteurs remercient Zohar B. Weinstein pour des observations perspicaces et suggestions sur le manuscrit.

Remarque : Toute petite molécule qui inhibe la croissance de bactéries e. coli peut être utilisée pour la méthode diagonale. Dans le présent protocole, la lévofloxacine (LEV), l’acide nalidixique (NAL) et la pénicilline G (PNG) serviront à titre d’exemple, car ces médicaments démontrent une synergie de trois voies principales. Le flux de travail de ce protocole est montré comme la Figure 6. Effectuer toutes les étapes à la température ambiante. Utiliser des aliquotes frais des bactéries et des médicaments chaque jour. Réaliser l’expérience selon les niveaux de biosécurité appropriées pour e. coli.
1. étapes de préparation
<ol><li>Préparer les médias Luria-Bertani (LB) en ajoutant les 25 g de bouillon LB à 1 L d’eau distillée et mélanger. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min et stocker les médias stérilisés à l’autoclave à température ambiante.</li>
	<li>Préparer des stocks de glycérol d’e. coli en mélangeant des volumes égaux de glycérol stérile à 50 % et des cellules bactériennes dilués à OD600 = 1 dans le bouillon LB et geler 150 µL d’extraits dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL à-80 ° C.</li>
	<li>Dissoudre 20 mg d’antibiotiques, LEV, NAL et PNG dans 1 mL de diméthyl sulfoxyde (DMSO). Diluer LEV solution x 100 à 0,2 µg/mL en mélangeant 10 µL de solution LEV 990 µl de DMSO. Utilisez LEV de 0,2 mg/mL et 20 mg/mL NAL et PNG dans les étapes de la procédure.</li>
	<li>Aliquote 50 µL de chaque antibiotique pour tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et gel à-20 ° C.</li>
	<li>Quantité de prendre un 150 µL d’Escherichia coli de-80 ° C. Dégel.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de stock de glycérol d’e. coli dans 5 mL de médias LB dans un tube à culture 14 mL.</li>
	<li>Secouer les tubes dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit à 200 tr/min.</li>
</ol>2. les dilutions Dose-Response Experiment
<ol><li>Prélever une partie aliquote de médicaments LEV, NAL et PNG de-20 ° C, les laisser à température ambiante pendant 10 min à décongeler et préparer des dilutions successives de ces médicaments.</li>
	<li>Préparer les 1100 µL de LB - 10 % sol en mélangeant 990 µL de milieux LB et 110 µL de solvant (DMSO).</li>
	<li>Préparer 500 µL de LEV LB - 10 % en mélangeant 450 µL des médias LB et 50 µL de LEV.</li>
	<li>Sol LB - 10 % Vortex pendant 5 s au réglage plus élevé. Ajouter 20 µL de sol LB - 10 % pour les rangées de quatre principaux de puits dans une microplaque 96 puits.</li>
	<li>Vortex LEV LB - 10 % pour 5 s au réglage plus élevé. Ajouter 20 µL de LEV LB - 10 % dans le premier puits en ligne A.</li>
	<li>Préparer la dilution en série double pour LEV LB - 10 % en prenant 20 µL du premier puits, ajoutant à la deuxième puits, pipetage et descendre cinq fois. Répétez cette opération pour tous les puits dans l’ordre jusqu’au puits, 11 qui se termine avec 40 µL (Figure 7 a).</li>
	<li>Retirez et jetez 20 µL du contenu du 11 Eh bien, à l’aide d’une micropipette.</li>
	<li>Répétez les étapes 2,3 à 2,7 pour les médicaments NAL et PNG à l’aide des deuxième et troisième rangées de la microplaque, respectivement.</li>
	<li>Répétez les étapes 2,3 et 2,7 pour la drogue LEV encore au quatrième rang comme contrôle positif interne.</li>
	<li>À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer l' OD600 d’un 01:10 dilution de la culture (étapes 1,5 à 1,7).</li>
	<li>Diluer les cellules dans 5 mL de médias LB à une OD600 de 0,01. Versez dans un réservoir.</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette multicanaux, ajouter 80 µL des cellules dilués pour les dilutions en série médicament préparées à l’étape de 2,4 à 2,9. Les concentrations de médicament final dans chaque puits est illustrée à la Figure 7 a. Sceller la plaque pour empêcher l’évaporation.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 16 h à 37 ° C.</li>
	<li>Démarrez une nouvelle culture bactérienne à utiliser à l’étape 3 (répétez les étapes 1,5 à 1,7).</li>
</ol>3. expérience de relation Dose-effet de Dilution linéaire
<ol><li>Mesurer l’absorbance de600 OD pour plaque de dose-réponse de dilution en série de l’étape 2 en utilisant un lecteur de plaque (Figure 7 a droite) et interpréter les résultats selon les étapes suivantes.</li>
	<li>Normaliser la croissance en divisant la croissance de chaque puits avec la croissance sans le contrôle des drogues pour chaque ligne et calculer le pourcentage de croissance en normalisant OD600à aucune condition de médicament.</li>
	<li>Pour chaque médicament, localiser les puits qui ont environ 50 % inhibition de la croissance (CI50), illustrée en orange dans la Figure 7 a droite. Affecter la concentration dans ces puits comme « serial IC50 » pour chaque médicament.</li>
	<li>Décongeler les aliquotes de drogue douce, préparer 1 mL de sol LB - 10 % en mélangeant des médias LB et solvant (DMSO) dans un rapport de 9:1 et une drogue LB - 10 % en mélangeant LB médias et la drogue dans un rapport de 9:1, où la concentration du médicament est 100 x d’IC50 de série de chaque médicament avant d’ajouter le support de la LB , choisi à l’étape 3.3.</li>
	<li>Préparer linéairement croissante de doses de médicaments LEV, NAL et PNG 11 concentrations, en mélangeant la drogue LB - 10 % et sol LB - 10 % en volumes, illustré à la Figure 7 b.</li>
	<li>Préparer des doses linéairement croissantes de LEV au quatrième rang comme contrôle positif interne.</li>
	<li>Mesurer l' OD600 de la 01:10 dilution de la culture a commencé à l’étape 2.14.</li>
	<li>Diluer les cellules dans 5 mL de médias LB à une OD600 de 0,01. Versez dans un réservoir.</li>
	<li>Ajouter 80 µL des cellules dilués sur les dilutions linéaire de médicament préparées à l’étape 3.6 à l’aide d’une micropipette multicanaux. Les concentrations de médicament final dans chaque puits est illustrée à la Figure 7 b. Remarque : Le milieu bien dans la relation dose-réponse recevra l’IC50 série pour ce médicament. Flasque pour éviter l’évaporation.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 16 h à 37 ° C.</li>
	<li>Commencer à deux cultures bactériennes fraîches à utiliser à l’étape 4 (répétez les étapes 1,5 à 1,7).</li>
</ol>4. diagonale Drug Interaction Experiment
<ol><li>Mesurer l’absorbance de600 OD pour dilution linéaire dose-réponse de l’étape 3 (Figure 7 b).</li>
	<li>Pour chaque médicament, choisir la concentration qui a abouti à la CI50 et prépare des drogues LEV, NAL et PNG 100 x IC50 concentrations.</li>
	<li>Décongeler les drogues douce, préparer 100 x IC50 pour chaque médicament et préparer des mélanges de drogues de 1:1 en volume de LEV + NAL, LEV + PNG et NAL + PNG et 1 : mélange 1:1 en volume de LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Préparer deux plaques pour des expériences d’interaction médicament tel qu’illustré à la Figure 8.</li>
	<li>Mesurer l' OD600 de la 01:10 dilution des cultures a commencé à l’étape 3.11.</li>
	<li>Préparer l’OD600 = 0,01 dilutions de deux cultures en deux 10 mL des médias LB.</li>
	<li>Ajouter 80 µL des cellules de culture 1 et 2 sur les plaques 1 et 2, respectivement. Sceller les plaques pour empêcher l’évaporation. Incuber les boîtes pendant 16 h à 37 ° C.</li>
</ol>5. diagonale Drug Interaction Scores
<ol><li>Mesurer l’absorbance de600 OD pour interaction médicamenteuse diagonale expérimenter des plaques de l’étape 4.</li>
	<li>Normaliser la croissance en divisant la croissance de chaque puits avec la croissance dans le contrôle des drogues aucun bien pour chaque ligne.</li>
	<li>Pour chaque ligne, recherchez la colonne qui a inhibition de la croissance plus proche de la CI50, ci-contre en orange sur la Figure 8 . Assigner l’IC50 basée sur la concentration relative des drogues dans ce puits.</li>
	<li>Pour LEV + NAL, LEV + PNG et NAL + PNG et LEV + NAL + PNG doses-réponses, calculer IC50 attendus par une moyenne de la CI50 de la drogue unique dans chaque combinaison. Notez qu’en moyenne est une approximation simple pour calcul exact d’IC50 attendu comme décrit avant le12.</li>
	<li>Calculer les scores de la Concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) en divisant l’IC50 observée par l’IC50 attendues dans chaque combinaison.</li>
</ol>

<ol><li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+therapeutics%3A+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li>
<li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+synergy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">What is synergy?</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li>
<li>Cokol, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23237673">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li>
<li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li>
<li>Lehár, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-order+combination+effects+and+biological+robustness%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215(2008).</li>
<li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Arzneimittelforschung%22%5BJournal%5D)">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li>
<li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+drug+combinations%3A+current+methodological+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 3 (3), (2015).</li>
<li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li>
<li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li>
<li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644(2017).</li>
<li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li>
<li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881(2017).</li>
<li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872(2016).</li>
<li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li>
<li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li>
<li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800(2016).</li>
<li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’utilisation de combinaisons de médicaments contre les agents pathogènes ou des tumeurs est une perspective attrayante, en particulier dans les circonstances de l’oléoduc antibiotique séchage. Cependant, ce potentiel est entravé par au moins deux difficultés. La première difficulté est le nombre astronomique de combinaisons possibles. Il y a, par exemple, 4950 combinaisons par paires possibles parmi 100 antibiotiques. Toutes les combinaisons possibles entre 100 antibiotiques (2100) est sur le même ordre de grandeur avec le nombre de bactéries sur la terre (~ 1030). Comment prévoir les combinaisons fortement synergiques parmi ces possibilités, a fait l’objet de nombreuses études computationnelles. La deuxième difficulté est la mesure des interactions médicamenteuses d’ordre élevé. Considérer qu’une plateforme de calcul peut suggérer qu’une certaine combinaison de 10 drogues est fortement synergique contre un certain agent pathogène. Les méthodes traditionnelles pour tester les interactions est trop coûteux de vérifier ou d’infirmer cette hypothèse, c’est pourquoi l’étude de la synergie entre les nombreux médicaments a été en dehors des limites de la recherche scientifique. La méthode diagonale, ce qui a été proposée il y a près de 30 ans et a été utilisée dans quelques écrans de synergie récentes fournissent une base solide pour le premier problème, en permettant l’analyse de l’interaction entre plusieurs paires. Il résout le problème de la second par un échantillonnage informatif des analyses traditionnelles et permet l’étude des interactions médicamenteuses d’ordre élevé.
Ce qui est important, nous notons que notre protocole utilise un dosage linéaire pour les mesures d’interaction médicamenteuse, de fournir la sensibilité pour la détection des interactions faibles même. Portant création de la gamme de concentration juste pour le dosage linéaire est une tâche difficile. D’abord une dilution en série, nous prendre une décision éclairée sur l’espace de recherche pour le dosage linéaire. Toutefois, le protocole peut être modifié pour utiliser 2 fois ou des dilutions plus élevées pour drug interaction stable. Une telle modification serait de raccourcir le temps de l’expérience et permettra de tester des interactions plus ; Cependant, il aurait la sensibilité pour détecter des interactions seulement fortement synergiques ou antagonistes.
Le protocole que nous décrit montre la mesure des interactions par paires ou trois voies. Un aspect essentiel du protocole est que les agents simples sont sur la même assiette que la combinaison, à minimiser le biais dû aux variations de la plaque. Par conséquent, le protocole peut être réglé pour mesurer les interactions jusqu'à 7 voies combinaisons par des modifications triviales. Combinaisons de médicaments plus de 7, il faudra plus d’une microplaque 96 puits et d’autres considérations doivent être prises pour assurer l’intégration des données correctes, comme inter inter-plaques réplicats.
Une restriction notable de la méthode diagonale est la restriction que chaque médicament à l’essai doit inhiber le phénotype d’intérêt. Par conséquent, la méthode diagonale n’est pas utile pour la compréhension des interactions entre les principes actifs et adjuvants inertes. Ces interactions « potentialisateurs » peuvent être étudiées sous des modèles alternatifs tels que les modèles Bliss ou plus élevé en monothérapie.
Une considération importante pour l’analyse des interactions médicamenteuses de poids fort est le choix de modèle nul pour les « IC50 attendu ». Lorsqu’on combine les deux médicaments, effet de la combinaison ne peut être comparé aux effets des drogues simples. Lorsque trois médicaments sont combinés, effet de la combinaison peut être comparé à effets seul ou par paire. Par exemple, si toutes les combinaisons deux à deux des trois médicaments sont synergiques, alors on peut escompter que ces médicaments montreront une synergie de trois voies. Déviation par rapport d’une interaction de trois voies à ce qui est attendu d’interactions par paire a été récemment surnommée « interaction émergente »16,17. Pour plus de simplicité, notre protocole décrit la mesure de trois voies combinaison « net interactions » qui définit le modèle nul comme les effets des médicaments seul. Toutefois, les données qui sont obtenues à partir du protocole peuvent également servir à calculer l’interaction émergente de la combinaison de trois voies. Dans notre analyse, nous avons défini l’IC50 attendue de la combinaison de trois voies comme la moyenne de la drogue unique IC50s. Par ailleurs, la CI50 attendue peut être définie comme la moyenne de la IC50s de combinaisons par paires (~1.1-1.2). L’IC50 observée est divisée par cette alternative IC50 attendue, la FIC obtenu fournit la FIC émergente pour la combinaison de trois voies, comme précédemment décrit12. Cet examen révèle que LEV + NAL + PNG est plus synergique que ce qui devrait partir des interactions par paires parmi trois médicaments, démontrant que LEV + NAL + PNG a synergie émergente.

Combinaisons de médicaments peuvent présenter un effet étonnamment élevé ou bas sur un phénotype étant donné les effets des médicaments constitutifs, correspondant à des interactions synergiques ou antagonistes drogue, respectivement1,2,3. L’utilisation de combinaisons synergétiques peut permettre à doses progressives pour l’augmentation de l’efficacité et la réduction de la dose pour le soulagement des effets secondaires. Traitements combinés peuvent également s’appliquer plusieurs revers de la machinerie cellulaire, bloquant ainsi les mécanismes potentiels d’évasion évolutive à résistance4. Donc, combinaisons de trois ou plusieurs médicaments servent régulièrement à l’agent pathogène ou cancer du traitement5.
Synergie et antagonisme sont définis par une comparaison entre l’effet observé d’une combinaison contre un effet attendu, compte tenu des effets des médicaments individuels. Parmi les modèles d’interactions médicamenteuses, Loewe additivité est le plus rigoureux et dispose d’un modèle bien défini nullFigure 1)6 (), et l’interaction de synergie/antagonisme inféré est indépendante de la concentration du médicament utilisée 6 , 7. Toutefois, le modèle Loewe est expérimentalement coûteux même pour un test d’interaction par paire. Essais d’interaction médicamenteuse se composent traditionnellement d’une matrice 2D de concentration des associations de médicaments (un essai de damier) ()Figure 2). Si 5 doses sont utilisés pour chaque médicament, 25 combinaisons sont nécessaires, correspondant à un semestre d’une microplaque si des expériences sont menées à répliquer. Le coût de cette approche interdit la mesure de la synergie par le modèle d’additivité Loewe pour les combinaisons de plusieurs médicamentsFigure 3) (). Par exemple, pour tester une interaction 10 broches, méthodes traditionnelles nécessiterait plus de 100 mille microplaques, sauf mesure expérimentale des synergies d’ordre élevé par le modèle d’additivité Loewe strict, bien sous-jacents et concentration indépendante 8.
Les traitements cliniques actuels utilisent seulement une fraction des associations médicamenteuses possibles. Par exemple, le traitement standard de tuberculose évolutive est une combinaison de trois antibiotiques. Il y a environ 20 antibiotiques utilisés dans le traitement de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Il y a 1140 combinaisons de 3 voies possibles parmi 20 médicaments, chacune avec la possibilité d’avoir une forte synergie contre VTT. Comme il n’y a eu aucune méthode rentable pour mesurer les interactions entre plusieurs médicaments, sauver la vie des combinaisons synergétiques restent non testés.
Nous décrivons ici un protocole simple permettant de mesurer les deux à deux et trois voies interactions par échantillonnage seulement la diagonale d’un test de damier ()Figure 4 et Figure 5). Le concept sous-jacent de l’échantillonnage de la diagonale d’une experience en damier a été théorisé par Berenbaum dans son ouvrage en 1978,9. Encore, cette approche a été appliquée seulement récemment à drogue synergy écrans10,11,12. Nous présentons notre protocole avec Escherichia coli (e. coli) et le phénotype de la croissance. Cependant, nous notons que le protocole est indépendant de l’espèce biologique et le phénotype d’intérêt et par conséquent peut être appliqué à la mesure de la synergie de la drogue d’ordre élevé dans d’autres contextes biologiques.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Semi Micro Cuvette&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf&nbsp ; Tubes de microcentrifugation</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro ; L Tips</td><td>Geneseesci</td><td>24830</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Tube de culture cellulaire respirant</td><td>VWR</td><td>60819-761</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro ; L</td><td>Pointes Geneseesci</td><td>24804</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; L Tips</td><td>Geneseesci</td><td>24815</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C Incubateur</td><td>Panasonic</td><td>MIR-262-PA</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C Agitateur</td><td>Incubateur Thermo Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Culture cellulaire Pipette sérologique</td><td>VWR</td><td>53300-421</td><td></td></tr><tr><td>Microplaques 96 puits</td><td>VWR</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Film d’étanchéité respirant</td><td>USA Scientific</td><td>2920-0010</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41647</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td></td><td></td>700926</tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon en poudre</td><td>RPI</td><td>L24065</td><td></td></tr><tr><td>Levofloxacine</td><td>Sigma</td><td>28266</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>PIPETMAN Classic</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette multicanaux</td><td>VistaLab</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Acide nalidixique</td><td>Sigma</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G</td><td>Sigma</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à pipette</td><td>Drummond&nbsp ;</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de réactif</td><td>VWR</td><td>89094-658</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>BIO-RAD</td><td>1702525</td><td></td></tr><tr><td>mélangeur vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-320-807</td><td></td></tr></tbody></table>

méthode diagonale à mesure synergie entre n’importe quel nombre de médicaments

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Une combinaison synergique de médicament a une efficacité supérieure par rapport aux effets des médicaments individuels. Essais de damier, où les médicaments sont combinés à des doses beaucoup, permettent de mesurer sensible des interactions médicamenteuses. Cependant, ces essais sont coûteuses et n’évoluent pas bien pour mesurer les interactions entre plusieurs médicaments. Plusieurs études récentes ont rapporté dosage des interactions médicaments auprès d’un échantillon de diagonal d’obtenir un damier traditionnel. Cette méthode alternative a considérablement réduit le coût des expériences d’interaction médicamenteuse et permet la mesure d’interaction pour les combinaisons avec de nombreux médicaments. Nous décrivons ici un protocole permettant de mesurer les trois interactions par paires et une interaction de trois voies entre trois antibiotiques en double exemplaire, en cinq jours, à l’aide de seulement trois Microplaque 96 puits et matériel de laboratoire standard. Nous présentons des résultats représentatifs, montrant que la combinaison de trois antibiotiques de la lévofloxacine, l’acide nalidixique + pénicilline G est synergique. Notre protocole évolue vers le haut afin de mesurer les interactions entre plusieurs médicaments et dans d’autres contextes biologiques, permettant des écrans efficaces des synergies de plusieurs médicaments contre les agents pathogènes et les tumeurs.

Auparavant, nous avons rapporté les interactions par paires parmi trois médicaments : LEV, NAL et PNG reposant sur des tests dans des tests miniaturisés damier, où les deux médicaments ont été regroupées dans une 4x4 matrice13,14. NAL et LEV étaient synergiques, PNG a été signalé à être antagoniste avec LEV et NAL13,14. Ici, nous avons vérifié ces interactions par paires et mesurer l’interaction de trois voies entre ces trois médicaments à l’aide d’un test de diagonal. Nos résultats démontrent que LEV + NAL + PNG est une association d’antibiotiques 3 voies synergique. Les représentations schématiques pour les résultats des sections individuelles de procédure expérimentale ont été données sur le côté droit de la Figure 7 et Figure 8. Nous présentons ici et d’interpréter les résultats bruts représentatifs de trois lectures de plaque, qui sont donnés à la Figure 9. La lecture de la plaque supérieure correspond à une dilution en série et linéaire expériences menées aux étapes 2 et 3. Les lectures de plaque deux bas sont plaques double interaction réalisées à l’étape 4.
Les données brutes à la Figure 9 montrent qu’épigées sont d’environ 0,55, mais il y a une densité optique 0,05 des médias lui-même, tel qu’observé dans l' OD600 des concentrations élevées de médicaments où il n’y a pas de croissance. Par conséquent, nous définissons l’IC50 comme (0.55-0.05)/2 = 0,25. Pour chaque dose-réponse, les puits situés le plus près possible de cette valeur sont affichés avec orange.
La moitié supérieure de la Figure 9 montre les résultats de l’étape 2, expérience de série dose-réponse. Les puits d’IC50 pour LEV est à répétitions de 10 en deux colonnes, qui correspondent à 4 ng/mL. La CI50 pour NAL et PNG sont à 3 µg/mL et 25 µg/mL, respectivement. Ces concentrations correspondent à la concentration de 1 x illustrée à la Figure 7 b. La moitié inférieure de la Figure 9 montre les résultats de l’étape 3, expériences linéaire dose-réponse. LEV, NAL et IC50 de PNG sont trouvent à 0,4 x, x 0,8 et 1,2 x, respectivement. Ces concentrations sont affectées comme la 1 X IC50 pour l’étape 4.
Deux plaques correspondant à reproduire deux expériences sont indiquées dans la Figure 9 b, où l’IC50 puits sont indiqués avec orange. En plaque 1, tous les médicaments simples ont leurs IC50 à concentration de 1 x. L’IC50 attendus pour la combinaison deux à deux ou trois voies est calculé par la moyenne arithmétique des médicaments constitutifs, faisant IC50 attendus pour la concentration d’également 1 x toutes les combinaisons. En plaque 2, LEV et PNG ont leurs IC50 à la concentration de 1 x, mais NAL IC50 est à 1,2 x. La CI50 attendus pour chaque combinaison est définie à l’aide de la moyenne arithmétique de ces valeurs d’IC50. Par exemple, la CI50 attendus pour LEV + NAL et NAL + PNG est de 1,1 x. L’interaction médicamenteuse score (FIC) pour chaque combinaison est calculé en divisant observé IC50 avec l’IC50 attendus, comme indiqué sur le côté droit des plaques. Inspection des scores des deux plaques FIC montre que LEV + NAL et LEV + NAL + PNG sont synergiques, tandis que LEV + PNG et NAL + PNG sont antagonistes. Notes FIC obtenues dans les deux plaques sont en accord, soutenant la fiabilité du protocole.
<img alt="Diagramme d’interaction médicamenteuse avec enregistrement du phénotype pour l’analyse de l’effet additif, à l’aide d’un dosage cellulaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Null définition de modèle pour le modèle d’interaction médicamenteuse Loewe additivité. 5 x deux 5 matrices sur une microplaque, où le médicament A augmente linéairement dans un axe comme illustré à gauche, et une concentration supérieure de drogue inhibe un phénotype quantifiable (en haut à droite). L’ajout de ces matrices est montré dans le milieu, où les lignes de raccordement aussi puissante drogue une concentration dans chaque seul médicament ont la même concentration que la drogue A. Lorsque les cellules sont ajoutées sur ce « damier » concentration des associations de médicaments, il est prévu que le phénotype enregistré sur cette ligne sera équivalent pour les puits, qu'il se connecte. Dans cette expérience d’interaction de drogue auto-auto, l’isobole représentant un phénotype (indiqué par une ligne pointillée verte) devrait être linéaire, définissant le modèle nul de l’additivité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme d’analyse matricielle des interactions médicamenteuses ; Montre une synergie, une additivité, un antagonisme dans les réponses cellulaires." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : interactions de médicaments par paire selon le modèle d’interaction médicamenteuse Loewe additivité. Lorsque les deux médicaments sont combinés dans un essai de damier comme dans la Figure 1, le contour de l’isophenotypic observée peut être droit, convexe ou concave. A droite, isophenotypic possible des contours (pointillés verts) sont superposent sur les dosages de damier. Combinaisons de médicaments avec des contours isophenotypic droites sont additives Loewe, comme les contours ne sont pas différents des interaction médicamenteuse auto-auto, qui est Loewe-additif par définition. Lorsque le contour de l’isophenotypic est nettement concave ou convexe, la combinaison est synergique ou antagoniste, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse des interactions médicamenteuses ; Les diagrammes 3D montrent des effets additifs, synergiques et antagonistes sur les cellules." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : interactions médicamenteuses trois voies selon le modèle d’interaction médicamenteuse Loewe additivité. Comme pour le dosage de damier d’interactions par paires, trois médicaments sont combinés dans une grille 3D (un « checkercube »), où chaque médicament augmente linéairement dans un seul axe. Si les trois médicaments étaient identiques, la surface d’isophenotypic devrait être plat, définissant l’additivité pour trois combinaisons de médicaments. Si la surface est plus concave ou convexe que ce modèle nul Loewe-additif, combinaisons de médicaments sont synergiques ou antagonistes, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme d’indice de combinaison ; les graphiques montrent les calculs de la CI50 pour les effets synergiques, additifs et antagonistes." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : méthode diagonale pour mesurer les interactions médicamenteuses par paires. Pour chaque essai de damier, seules les régions montrées en magenta rectangles sont mesurées. i et ii augmentons linéaire des concentrations du médicament seul. III est évaluée en faisant un mélange 1:1 des deux médicaments et titration linéairement ce mélange comme si c’était un seul médicament. La FIC est égale à l’IC50 observée dans la combinaison divisée par l’IC50 attendue de deux médicaments simples. Pour le modèle d’additivité de Loewe, l’IC50 attendue est approximée par la CI50 moyenne de ces deux médicaments seul. Une valeur FIC vaut 1 pour les paires de Loewe-additif et est inférieure ou supérieure à 1 pour les paires synergiques ou antagonistes, respectivement2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme d’analyse des interactions médicamenteuses avec courbes dose-réponse et calcul de la CI&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; pour la synergie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : diagonale méthode pour mesurer les trois interactions. Pour chaque dosage checkercube, seules les régions montrées sont mesurées. i, ii et iii augmentons linéaire des concentrations du médicament seul. IV est mesurée en faisant un 1:1:1 mélange de trois médicaments et titration linéairement ce mélange comme s’il s’agissait d’un seul médicament. La Concentration inhibitrice fractionnaire est égale à l’observé IC50 dans la combinaison divisée par la CI50 attendue compte tenu de trois médicaments seul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Tableau de flux de travail des interactions médicamenteuses ; Les étapes comprennent la préparation des cellules, les dilutions, les tests d’interaction, l’analyse des données." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figure 6 : flux de travail pour la méthode diagonale du protocole décrit ci-après et les détails de configuration pour chaque microplaque. La plaque figure à jour 4 est réalisée en double exemplaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma de la méthode de microdilution montrant le gradient de concentration du médicament et la mesure de la croissance bactérienne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figure 7 : les expériences de relation dose-effet de dilution en série et linéaire. (A) préparation des dilutions dose-réponse pour un médicament et les concentrations de médicament final correspondantes. Cellules d’Escherichia coli sont ajoutés à la plaque ; la croissance est enregistrée après 16 h. Serial IC50, montré à orange, a été sélectionné pour chaque drogue pour utilisation dans le lendemain de linéaire les expériences de relation dose-effet de dilution. (B) préparation de dilution linéaire dose-réponse pour un médicament et les concentrations de médicament final correspondantes. Cellules d’Escherichia coli sont ajoutés à la plaque ; la croissance est enregistrée après 16 h. Pour chaque médicament, le IC50s sélectionnés qui seront utilisés dans le lendemain drug interaction expériences sont indiqués en orange. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Effets du gradient d’antibiotiques sur la croissance bactérienne ; Le diagramme montre les données de concentration et la matrice de croissance." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figure 8 : expériences d’interaction de drogue. Préparation des expériences d’interaction est semblable au seul médicament linéaire dose-effet, sauf que 1:1 ou 1:1:1 mélange de médicaments est utilisée pour deux ou trois médicament doses-réponses, respectivement. Observé IC50s pour chaque dose-réponse, représenté en orange, sont utilisées pour calculer les scores de la FIC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Inhibition de la croissance antimicrobienne ; carte thermique, matrice de concentration de médicament ; IC50, analyse FIC illustrée." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Figure 9 : représentant expérimenter résultats. Représentant résultats obtenus en utilisant le protocole décrit sont présentés, avec des précisions dans le texte principal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Dans ce protocole, nous décrivons comment faire Loewe mesures interaction médicament axée sur l’additivité pour pairwise et combinaisons de trois médicaments.

Méthode diagonale à mesure synergie entre n’importe quel nombre de médicaments

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des systèmes, telles que la façon dont les combinaisons de plusieurs médicaments ou agents affectent le raccourcissement. Le principal avantage de cette technique est que son efficacité et sa facilité d’interprétation permettent d’étudier les interactions entre plus de deux agents. Commencez cette procédure par la préparation des aliquotes d’antibiotiques et la culture bactérienne comme détaillé dans le protocole textuel. Prenez une aliquote de chaque médicament à moins 20 degrés Celsius et laissez les aliquotes décongeler à température ambiante pendant 10 minutes.Pour se préparer à des dilutions en série de ces médicaments, mélangez 990 microlitres de milieu LB et 110 microlitres de DMSO pour obtenir un LB 10 % sol. Ensuite, préparez 500 microlitres de LB 10 % LEV en mélangeant 450 microlitres de média LB et 50 microlitres de LEV. Vortex le LB 10 % sol pendant cinq secondes au réglage le plus élevé.Ajoutez 20 microlitres de LB 10 % sol aux quatre rangées supérieures des puits dans la microplaque de 96 puits. Maintenant, vortex le LB 10 % LEV de la même manière. Ajoutez 20 microlitres de LB 10 % LEV dans le premier puits de la rangée A.Ensuite, préparez une dilution en série en deux fois pour LB 10 % LEV en aspirant 20 microlitres du premier puits, en l’ajoutant au deuxième puits et en pipetant de haut en bas cinq fois.Répétez cette opération pour tous les puits de manière séquentielle jusqu’au 11ème puits qui se termine avec 40 microlitres. Retirez et jetez 20 microlitres du contenu du 11ème puits à l’aide d’une micro-pipette. Répétez ces étapes pour les NAL en utilisant la deuxième rangée de la microplaque.Et pour PNG en utilisant la troisième rangée. Ensuite, répétez ces étapes pour le médicament LEV à nouveau sur la quatrième rangée en tant que contrôle positif interne. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la densité optique à 600 nanomètres ou OD600 d’une dilution de un à 10 de la culture.Diluez les cellules dans cinq millilitres de milieu LB jusqu’à une OD600 de 0,01. Ensuite, versez les cellules diluées dans un réservoir. À l’aide d’une micropipette multicanaux, ajoutez 80 microlitres de cellules diluées aux dilutions en série du médicament.Scellez la plaque pour éviter l’évaporation. Incuber la plaque pendant 16 heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, commencez une nouvelle culture bactérienne à utiliser pour l’expérience dose-réponse.Mesurer la DO 600 pour la plaque dose-réponse de dilution en série à l’aide d’un lecteur de plaque et normaliser la croissance comme décrit dans le protocole texte. Pour chaque médicament, localisez les puits qui ont une inhibition de la croissance d’environ 50 % ou une CI50. Attribuez la concentration dans ces puits à la CI50 série pour chaque médicament.Ensuite, décongelez les aliquotes de médicament frais. Préparez un millilitre de médicament LB 10 % en mélangeant le milieu LB et le médicament dans un rapport de neuf pour un. Ici, la concentration du médicament est de 100 fois celle de chaque série de médicament IC50, avant l’ajout du milieu LB.Préparez également un millilitre de LB 10 % sol comme précédemment. Préparez également un millilitre de LB 10 % sol comme précédemment. Préparez des doses linéairement croissantes de LEV, NAL et PNG à 11 concentrations en mélangeant LB 10 % médicament et LB 10 % sol en volumes comme indiqué ici.Préparez également des doses linéairement croissantes de LEV sur la quatrième rangée comme contrôle positif interne. Maintenant, mesurez la DO 600 de la dilution de un à 10 de la culture qui s’est développée. Diluez les cellules dans cinq millilitres de milieu LB jusqu’à une OD600 de 0,01.Et versez la culture diluée dans un réservoir. Ajoutez 80 microlitres de cellules diluées aux dilutions linéaires du médicament à l’aide d’une micropipette multicanaux. Ensuite, incubez la plaque pendant 16 heures à 37 degrés Celsius.De plus, commencez deux cultures bactériennes fraîches pour l’expérience d’interaction. Mesurer la DO 600 pour la dilution linéaire dose-réponse. Pour chaque médicament, choisissez la concentration qui a donné la CI50 et préparez le médicament avec des concentrations 100 fois supérieures à la CI50.Ensuite, utilisez des médicaments fraîchement décongelés pour préparer 100 fois IC50 pour chaque médicament. À partir de ceux-ci, formulez des mélanges de médicaments un à un en volume de LEV plus NAL, LEV plus PNG et NAL plus PNG. Préparez également un mélange médicamenteux individuel de LEV plus NAL plus PNG.Maintenant, préparez deux plaques pour des expériences d’interaction médicamenteuse, comme précédemment, sauf qu’un mélange de médicaments est utilisé un à un ou un à un. Mesurer la DO 600 de la dilution d’un à 10 de la culture commencée plus tôt. Préparez deux dilutions avec une OD600 de 0,01 dans cinq millilitres de milieu LB.Ajoutez 80 microlitres de cellules de la première culture sur la première plaque et ajoutez 80 microlitres de cellules de la deuxième culture sur la deuxième plaque. Après avoir scellé les plaques pour éviter l’évaporation, incubez-les pendant 16 heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, mesurer l’absorbance OD600 pour les plaques diagonales d’expérience d’interaction médicamenteuse.Pour chaque rangée, localisez la colonne où l’inhibition de la croissance est la plus proche de la CI50. Attribuez la CI50 en fonction de la concentration relative de médicament dans ce puits. Voici une planche d’une expérience d’interaction médicamenteuse en double.Tous les médicaments ont leur CI50 qui est définie comme une absorbance de 0,25 à une concentration unique. La CI50 attendue pour la combinaison par paires ou à trois voies est calculée par la moyenne arithmétique des médicaments constitutifs, ce qui fait que la CI50 attendue pour toutes les combinaisons est également une fois la concentration. Le score d’interaction médicamenteuse ou FIC pour chaque combinaison est calculé en divisant la CI50 observée par la CI50 attendue.L’inspection des scores FIC montre que LEV plus NAL, et LEV plus NAL plus PNG sont synergiques, tandis que LEV plus PNG et NAL plus PNG sont antagonistes. Les scores FIC obtenus à partir de la deuxième plaque dupliquée sont en accord, ce qui soutient la fiabilité du protocole. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à reproduire tous les résultats nécessitera une attention minutieuse aux détails et une cohérence au jour le jour.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’être extrêmement prudent avec les concentrations de médicaments et de cellules pour garantir des relations dose-réponse reproductibles. Bien que la méthode présentée ici soit optimisée pour les bactéries, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes biologiques tels que les lignées cellulaires de mammifères. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies infectieuses ou du cancer, car ces maladies nécessitent souvent un traitement par plusieurs médicaments.Après sa mise au point, cette technique a permis aux chercheurs d’explorer les synergies entre de nombreux agents de la tuberculose et du cancer colorectal.

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