Analyse de Flux extracellulaire isolement, caractérisation et un débit élevé de souris primaire tubulaire les cellules épithéliales rénales

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le métabolisme rénal, telles que l’oxydation des acides gras, qui est étroitement liée au développement de la fibrose rénale et de diverses autres néphropathies. Le principal avantage de cette technique est d’utiliser une plateforme à haut débit pour cribler des composés qui régulent la bioénergétique mitochondriale dans les cellules épithéliales tubulaires rénales. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies métaboliques rénales, car elle permet un dépistage à haut niveau des composés qui régulent le métabolisme mitochondrial dans les cellules épithéliales rénales.

Pour préparer les boîtes de Pétri de 60 millimètres enrobées de collagène, ajoutez deux millilitres d’acide acétique pré-filtré de 20 millimolaires suivis de 35 microlitres de solution de collagène I dans chaque plat. Ensuite, incubez la plaque à température ambiante pendant une heure, faites-la sécher à l’air libre et exposez-la aux UV. Ensuite, rincez les résidus d’acide acétique à l’aide de PBS. Effectuez trois rinçages.

Ensuite, conservez le plat dans un incubateur de culture cellulaire sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Après avoir préparé la souris pour la chirurgie, retirez la fourrure de la poitrine et de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire. Ensuite, désinfectez la peau avec de l’iode et essuyez les résidus d’iode.

Ensuite, faites une incision pour ouvrir la cavité abdominale et exposez le cœur et les reins. Maintenant, installez une pompe de perfusion à 32 millilitres par minute et retirez toutes les bulles dans le tube avant de commencer la perfusion. Utilisez une aiguille de calibre 27 à la fin de la ligne.

Pour continuer, insérez une aiguille dans le ventricule gauche à travers l’apex du cœur. Dès que le tampon remplit le cœur, percez un trou dans l’oreillette droite pour créer une sortie pour le tampon de perfusion. Ensuite, passez au tampon de digestion et réduisez légèrement la vitesse de la pompe à 30 millilitres par minute pour la digestion.

Après avoir perfusé 20 millilitres de tampon de digestion, retirez les deux reins pour l’isolement des cellules tubulaires. Pour traiter les reins prélevés, retirez d’abord les capsules rénales et la moelle. Ensuite, hachez les deux rognons en petits morceaux et incubez-les dans 10 millilitres d’un tampon de digestion dans un four à 37 degrés Celsius avec une rotation douce pendant cinq minutes.

Après la digestion, retirez tous les tissus non digérés en passant le tampon à travers un filtre de 70 microns. Après avoir recueilli le tissu digéré, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture pour arrêter la digestion. Ensuite, centrifugez la suspension de tissu filtré à 50 g pendant cinq minutes pour granuler les cellules tubulaires.

Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture et répétez la centrifugation pour recueillir les cellules tubulaires restantes. Maintenant, mettez la première pastille en suspension dans 20 millilitres de milieu de culture et centrifugez-la à 50 g pendant cinq minutes pour purifier davantage les cellules collectées. Disposer du surnageant.

Ensuite, mettez les deux granulés en suspension dans 10 millilitres de milieu de culture. Ensuite, comptez les cellules vivantes à l’aide de la coloration au bleu trypan. Ensuite, ensemencez jusqu’à 10 millions de cellules dans une boîte recouverte de collagène de 60 millimètres et laissez les cellules tubulaires se fixer pendant la nuit.

Pour commencer, ensemencez des cellules tubulaires P1 à 40 000 cellules dans les puits d’une microplaque de 96 puits fraîchement préparée et recouverte de collagène. Utilisez 100 microlitres de milieu de culture par puits. L’optimisation de la densité cellulaire et de la concentration des composés dans le test de flux extracellulaire est la clé de la réussite d’une expérience.

Nous recommandons une expérience pilote de titrage pour identifier la densité cellulaire optimale et la concentration du composé. Ensuite, hydratez la cartouche du capteur. Tout d’abord, soulevez la cartouche du capteur et remplissez chaque puits de la plaque avec 200 microlitres de solution d’étalonnage.

Ensuite, repositionnez la cartouche pour immerger les capteurs, et incubez l’ensemble pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez l’ancien support et remplacez-le par 175 microlitres de support de dosage de glucose ou d’acides gras. Ensuite, continuez l’incubation pendant une heure sans dioxyde de carbone.

Pendant l’incubation de la cellule, chargez l’orifice A de la cartouche avec 25 microlitres d’oligomycine, chargez l’orifice B avec FCCP, chargez l’orifice C avec roténone/antimycine A, et chargez l’orifice D et tous les autres orifices avec de l’eau. Stockez maintenant la cartouche dans l’incubateur sans dioxyde de carbone jusqu’à ce que la configuration soit prête pour l’étalonnage. Allumez l’analyseur de flux extracellulaire et le contrôleur.

Ensuite, ouvrez le logiciel de l’analyseur, choisissez un test standard et appuyez sur l’option Assistant de test. Ensuite, sous l’onglet Composés, attribuez les composés aux ports appropriés. Sous l’onglet Correction d’arrière-plan, sélectionnez les puits qui ne contiennent aucune cellule.

Ensuite, utilisez l’onglet Groupes et étiquettes pour étiqueter les groupes expérimentaux. Ensuite, sous l’onglet Protocole, définissez les cycles de mixage et de mesure appropriés à l’aide des commandes disponibles. Ces paramètres sont indiqués dans le protocole texte, et une fois qu’ils sont saisis, enregistrez le modèle pour une utilisation ultérieure.

Maintenant, appuyez sur End Wizard pour continuer. Maintenant, appuyez sur Démarrer pour commencer l’étalonnage. L’analyseur éjecte ensuite le support de plaque et demande l’insertion de la plaque de cartouche.

Ce processus d’étalonnage prend de 20 à 25 minutes. Une fois le système calibré, appuyez sur la commande d’invite pour remplacer la plaque d’étalonnage par la plaque de cellule et poursuivez l’exécution. Une fois l’exécution terminée, enregistrez les données OCR et retirez la plaque de l’analyseur.

Maintenant, ajoutez Hoechst dans chacun des puits d’essai et incubez la plaque pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’une excitation de 355 nanomètres et d’une émission de 460 nanomètres, et normalisez les données OCR en fonction du nombre de cellules. Dans ce protocole, une population hétérogène de cellules rénales, de tubules incomplètement digérés et d’autres débris tissulaires a été cultivée sur des plaques recouvertes de collagène.

Le lendemain de l’isolement, le milieu de culture a été centrifugé pour éliminer les débris, et les cellules tubulaires ont été replaquées. Par la suite, les cellules se sont fixées plus facilement et, au cinquième jour de culture, elles étaient à 80 à 90 % de confluence. Les TEC rénaux ont ensuite été sous-cultivés et ont atteint leur confluence en une semaine.

Une croissance similaire s’est produite au cours des deux passages suivants. La monocouche de cellules a pris une formation en dôme, se soulevant de la plaque et restant attachée par des jonctions serrées. La respiration mitochondriale des TEC primaires isolés a été mesurée à l’aide de l’analyse du flux extracellulaire décrite de l’OCR à différentes densités de placage comme décrit.

Les cellules plaquées à des densités plus élevées présentaient des augmentations proportionnelles de l’OCR. 40 000 cellules par puits couvraient la surface de la plaque mieux que toute autre densité de placage, ce qui en fait la concentration optimale pour tester les interactions entre les cellules et les composés. Par exemple, un milieu contenant un substrat d’acides gras a été appliqué sur les TEC avec le 2DG, un inhibiteur de la glycolyse, pour évaluer directement l’oxydation des acides gras dans les TEC aux passages un et deux.

Lors de cette procédure, il est important de toujours garder un registre des volumes et des concentrations exacts dans chaque puits. Des modifications dans les concentrations finales des composants peuvent entraîner l’échec de l’ensemble de l’expérience. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la néphrologie pour explorer le rôle du métabolisme des acides gras tubulaires dans la pathogenèse de diverses néphropathies.