2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Cette méthode peut être utilisée non seulement pour répondre à des questions clés en recherche fondamentale, mais aussi contribuer aux domaines médical, pharmaceutique et biotechnologique, en délimitant de nouveaux petits ligands moléculaires de protéines essentielles. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse parallèle des protéines et des partenaires métaboliques de la protéine choisie dans des conditions in vivo. Cette méthode permet de repérer les molécules en interaction sans être limitée à des ligands présélectionnés.

Bien que cette méthode ait été développée pour les plantes, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les cellules HeLa, E. coli et S. Cerevisiae. Pour commencer, préparez le milieu MSMO et ajustez le pH à 5,7 avec une molaire d’hydroxyde de potassium. Ensuite, autoclavez la solution pendant 15 minutes à 121 degrés Celsius.

Ajoutez les suppléments au milieu juste avant le début de l’expérience. Maintenant, cultivez une culture cellulaire transgénique PSBL Arabidopsis thaliana dans 50 millilitres de milieu MSMO dans une fiole de 100 millilitres. Ensuite, placez le ballon sur un agitateur à plate-forme orbitale et agitez doucement les cellules à 130 tr/min à 20 degrés Celsius à la lumière.

Tous les sept jours, sous-cultivez les cellules dans un milieu frais à une solution de un à 10. Ensuite, utilisez un entonnoir en verre avec un treillis en nylon monté sur une fiole conique, relié à une pompe à vide pour récolter les cellules pendant la phase de croissance logarithmique. Ensuite, enveloppez les cellules séchées dans du papier d’aluminium et congelez-les dans de l’azote liquide.

À l’aide d’un mélangeur pré-refroidi, réglé sur une fréquence vibratoire de 20 hertz. Homogénéisez la matière cellulaire végétale récoltée et congelée en une poudre fine pendant deux minutes. Ensuite, aliquote trois grammes de poudre broyée par échantillon à l’aide d’azote liquide, d’un équipement pré-refroidi pour l’empêcher de dégeler.

Ensuite, à l’aide d’un mortier pré-refroidi à l’azote liquide, triturez la poudre broyée avec trois millilitres de tampon de lyse glacé jusqu’à ce qu’elle décongèle. Divisez immédiatement l’échantillon décongelé dans deux micro-tubes à centrifuger d’un millilitre. Centrifuger les échantillons à 20 817 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires.

Pendant la centrifugation de l’échantillon, aliquote 100 microlitres de billes de sépharose IgG par échantillon. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse et remettez les billes en suspension par vortex. Essorez pendant trois secondes à 2 000 g et jetez le tampon de lyse.

Enfin, remettez les billes en suspension dans 400 microlitres de tampon de lyse. Après la centrifugation, transférez trois millilitres de lysat végétal clair dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres. Ajoutez les billes pré-équilibrées au lysat végétal et incubez le mélange sur une roue rotative pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Transférez le mélange dans une seringue reliée à un capuchon verrouillé par leurre sur une colonne de centrifugation avec un filtre de la taille d’un pore de 35 micromètres situé sur le dessus du collecteur à vide. Faites passer le lysat à travers l’appareil en allumant la pompe à vide avec une légère pression pour éviter d’endommager les billes. Le lysat non lié est drainé dans la station de déchets située à la base du collecteur et les complexes protéiques, liés aux billes, restent sur le filtre.

Une fois la seringue vidée du lysat cellulaire, ajoutez 10 millilitres de tampon de lavage pour laver les billes. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon d’élution pour effectuer la deuxième étape de lavage. Maintenant, retirez la seringue et le capuchon de verrouillage du leurre.

Fermez le capuchon inférieur de la colonne et ajoutez 400 microlitres de tampon d’élution contenant 50 unités de la forme améliorée du virus de la gravure du tabac, la protéase, aux billes. Placez la colonne sur un agitateur de table, réglé à 1 000 tr/min pendant 30 minutes à 16 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 50 unités supplémentaires de protéase dans la colonne et incubez le mélange sur le shaker comme à l’étape précédente.

Ensuite, retirez le capuchon inférieur et replacez la colonne dans un tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres. Centrifuger à 20 817 g pendant une minute pour recueillir l’éluat et procéder à l’extraction des protéines et des métabolites. Pour commencer l’extraction, ajoutez un millilitre de trois à un solvant d’eau de méthanol MTBE à l’éluat.

Retournez le tube pour le mélanger à l’échantillon. Ensuite, ajoutez 0,4 millilitre d’une à trois solutions d’eau de méthanol au mélange et retournez le tube pour mélanger l’échantillon. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 20 817 g pendant deux minutes à température ambiante pour permettre la séparation des phases.

À l’aide d’une pipette manuelle de manipulation de liquide d’un millilitre, retirez la phase supérieure contenant les lipides. Ensuite, ajoutez 0,2 millilitre de méthanol et retournez le tube pour mélanger l’échantillon. Centrifuger à 20 817 g pendant deux minutes à température ambiante et recueillir la phase polaire dans un nouveau tube pour mesurer les métabolites.

Laissez environ 50 microlitres de phase polaire au fond du tube pour éviter de déloger la pastille de protéine. Ensuite, séchez le tube contenant la phase polaire dans un évaporateur centrifuge pendant la nuit. Séchez les tubes de granulés de protéines pendant 30 à 60 minutes pour éviter un séchage excessif.

La purification par affinité en une étape, associée à la spectrométrie de masse, les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite dans des cultures cellulaires transgéniques d’Arabidopsis thaliana ont été identifiées. Les cultures cellulaires exprimant NDPK1 montrent un enrichissement significatif en valine-leucine, en isoleucine glutamate, en leucine, en isoleucine et en isoleucine phénylalanine par rapport aux échantillons de vecteurs vides, NDPK2 et NDPK3. Pour rechercher des interactions protéine-protéine et protéine-métabolite connues, 13 protéines et quatre dipeptides co-éluant avec NDPK1 sont comparés à la base de données des points.

Les principales associations sont observées entre l’orthologue APX1 et la famille des aldéhydes déshydrogénases, et le facteur d’initiation de la traduction, FBR12, avec l’homologue alpha du facteur d’initiation de la traduction deux. Les dipeptides identifiés ne montrent aucun partenaire protéique signalé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, si elle est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de garder les échantillons, l’équipement et les réactifs froids tout au long de l’expérience. Après cette procédure, d’autres méthodes, comme la thermophorèse au microscope ou le test d’activité, peuvent être effectuées afin de déterminer l’interaction directe entre les molécules ou l’inférence de leur ligand sur l’activité protéique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler l’échantillon tout au long de la procédure pour obtenir des résultats fiables et identifier les ligands de la protéine de votre choix.

N’oubliez pas que travailler avec du méthanol et une solution MTBE peut être extrêmement dangereux. Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté et des précautions, telles que le travail sous la hotte, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.