Name: 2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez une méthode de purification d'affinité pour analyser simultanément les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite dans les cultures cellulaires d'Arabidopsis thaliana. Cette technique permet d'identifier les partenaires moléculaires en conditions proches du vivant.

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Nous aimerions bien vouloir reconnaître Prof. Dr. Lothar Willmitzer pour son implication dans le projet, des discussions productives et grande surveillance. Nous sommes reconnaissants à m. Daniel Veyel pour aider avec les mesures de MS de protéomique. Nous remercions Mme Änne Michaelis qui nous a fourni une aide technique précieuse avec mesures LC-MS. En outre, nous tenons à remercier le Dr. Monika Kosmacz et Dr. Ewelina Sokołowska pour leur aide et leur implication dans le travail sur le manuscrit original et à Weronika Jasińska pour le support technique.

<ol><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+as+global+regulators%3A+A+new+view+of+protein+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li>
<li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li>
<li>Ramírez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson%27s+disease-associated+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161(2017).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
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<li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li>
<li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li>
<li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li>
<li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).</li>
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<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Transcription+Factors%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li>
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<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
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<li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté permet une identification parallèle de PP et PM complexes d’une protéine cible. Du clonage aux résultats définitifs, l’expérience peut être complétée en aussi peu que 8 à 12 semaines. AP complète prend environ 4 à 6 h pour une série d’échantillons de 12 à 24, rendant notre protocole d’analyse de débit moyen.
Le protocole, tout en étant simple dans l’ensemble, a un certain nombre d’étapes critiques. (i) suffisamment de protéines d’entrée et des billes d’affinité est cruciale pour atteindre une plage dynamique de détection de métabolite. Lyse cellulaire efficace est donc une étape cruciale dans la procédure. Protéine pauvres rendements peuvent être une conséquence de pulvérisation insuffisante du matériel ou du ratio de lyse-tampon/matériel sous-optimale. (ii) il faut que les réactifs utilisés sont respectueux de MS. Détergents forts, glycérol ou des quantités excessives de sel doivent être évitées car ils interfèrent avec la détection de MS. (iii) l’agar-agar ne devrait pas être trop secs pendant les étapes de lavage, et lorsque vous utilisez une tubulure de vide, il est important d’appliquer un taux de débit lent afin de ne pas pour détruire les billes ou affecter la stabilité complexe.
Il y a quelques importantes modifications possibles au protocole présenté : (i) nous permet de maximiser la quantité de protéine appât le promoteur constitutif de CaMV35S. Surexpression, bien que très utile, peut avoir de graves effets sur la cellule homéostasie28 et conduisent à la formation des interactions physiologiquement non pertinentes. Expression de protéines étiquetées à l’aide de promoteurs natifs et où possible dans un contexte de perte de fonction est considéré comme supérieur afin de récupérer le vrais Interactiens biologiques. Pour les protéines normalement ne pas exprimés dans les cultures de cellules végétales, un fond de plantes peut-être s’avérer nécessaire pour identifier les Interactiens pertinentes. (ii) lorsque vous travaillez avec des protéines membranaires, le tampon de lyse doit être complété par un détergent MS-compatible. (iii) l’introduction d’une deuxième étape de purification d’affinité pourrait améliorer le nombre de faux positifs au ratio de true-positifs et éliminent la nécessité de contrôles de EV29. Une balise de roman en tandem avec deux sites de clivage protéase indépendant présente une alternative intéressante à l’étape de chromatographie liquide d’exclusion ajoutée par Maeda et al 201411, qui est laborieuse et chronophage.
Le plus grave inconvénient de l’AP est le taux élevé de faux positifs. Les raisons sont nombreuses. Surexpression constitutive a été déjà mentionnée. Une autre source d’interactions physiologiquement non pertinentes, à moins que travaillant avec des organites isolés, est préparation de mélanges de protéines et de métabolites des différents compartiments subcellulaires des lysats de cellules entières. Localisation sous-cellulaire devrait être utilisée pour filtrer les Interactiens vrais. Néanmoins, la majorité des faux positifs proviennent de liaison non-spécifique entre les protéines et les résines d’agarose. Introduction d’une deuxième étape de purification, comme décrit plus haut, offre la meilleure solution au problème, vient toutefois au détriment du temps et débit. En outre, plus faible interaction peut être perdue car le protocole s’allonge. Une autre restriction d’AP, c’est que, malgré les informations complètes qu'il fournit sur l’interactome d’une protéine cible, différencier les cibles directes et indirectes de la protéine appâtée est impossible. Les approches bimoléculaires ciblées sont nécessaires pour confirmer les interactions.
AP couplé avec métabolomique basée sur MS a permis d’étudier les protéines complexes dans S. cerevisiae12. Ce travail, ainsi que de notre précédente observation13 , que, de même aux lipides, les composés polaires et semi polaires restent liés à des complexes de protéine isolées de lysats cellulaires, a fourni les bases conceptuelles pour le protocole présenté. Notre protocole est caractérisée par trois points uniques : (i) en revanche à la levure travail12, il montre que l’AP est approprié pour récupérer non seulement les ligands protéine hydrophobe mais aussi hydrophile. (ii) en introduisant un protocole d’extraction de trois-en-un, un seul point d’accès peut servir à étudier les Interactiens de protéine et métabolite de la protéine de l’appât. (iii) nous avons adapté le protocole de cellules végétales.
Futurs efforts porteront sur la création d’une balise de roman en tandem avec deux sites de clivage protéase indépendant. Nous tenons également à explorer les qualités du protocole à la faible abondance de petites molécules telles que des hormones végétales.

La méthode décrite ici vise à l’identification des partenaires métabolite et protéine d’une protéine de choix dans des conditions de lysat cellulaire prochein vivo . Il a été spéculé que nombreux métabolites plus que caractérise aujourd'hui ont une importante fonction de réglementation1. Métabolites peuvent agir comme des auxiliaires biologiques, modification de l’activité, fonctionnalité, et/ou la localisation de leurs récepteurs protéines2,3,4. Dans la dernière décennie, plusieurs méthodes de percée, ce qui permet l’identification des PMI en vivo ou dans des conditions quasiin vivo , ont été développés5. Les approches disponibles peuvent être séparés en deux groupes. Le premier groupe comprend les techniques qui commencent avec un appât connu-métabolite afin d’emprisonner les partenaires de la nouvelle protéine. Méthodes incluent affinité chromatographie6drogues affinité cible sensible-stabilité dosage7, chimio-protéomique8et thermique proteome profilage9. Le deuxième groupe est constitué d’une seule méthode qui commence par une protéine connue afin d’identifier des ligands de petit-molécule10,11.
AP couplé avec lipidomique axée sur le MS a été utilisé pour analyser les complexes protéines-lipides dans Saccharomyces cerevisiae12. Comme point de départ, les auteurs ont utilisé des souches de levures exprimant 21 enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’ergostérol et 103 kinases fusionnée à une purification d’affinité en tandem de tag (TAP). 70 % des enzymes et 20 % des kinases trouvées pour lier les différents ligands hydrophobes, éclairant dans le réseau d’interactions complexes protéines-lipides.
Auparavant, nous pourrions démontrer que, de la même façon aux lipides, composés polaires et semi polaires aussi restent liés à des complexes de protéine isolées de lysats cellulaires13. Se fondant sur ces constatations, nous avons décidé d’optimiser l’AP méthode publiée précédemment10,11 pour cellules végétales et des composés hydrophiles14. À cet effet, nous avons utilisé des vecteurs robinet décrites par Van lhonneux et al. 2010, utilisée avec succès dans l’usine PPI études15. Pour raccourcir le temps nécessaire pour obtenir des lignées transgéniques, nous avons décidé sur des cultures cellulaires Arabidopsis. Nous avons utilisé un one-step méthyl tert-butyl éther, (MTBE) / méthanol/eau méthode d’extraction, ce qui permet la caractérisation des protéines (pellet), lipides (phase organique) et métabolites hydrophile (phase aqueuse)16 dans une seule expérience de purification d’affinité. Les lignes de contrôle EV ont été introduites afin d’exclure des faux positifs, par exemple les protéines liant à la balise seule. Comme preuve de concept, nous avons marqué trois (sur cinq) kinase de diphosphate de nucléoside présents dans le génome d’Arabidopsis (NDPK1-NDPK3). Entre autres conclusions, nous pourrions démontrer que NDPK1 interagit avec le glutathion S-transférase et glutathion. Par conséquent, nous pourrions prouver que NDPK1 est soumis à glutathionylation14.
Pour résumer, le protocole présenté est un outil important pour caractériser les protéines et les réseaux d’interaction de protéine-petit-molécule et constitue une avancée majeure par rapport aux méthodes existantes.

<table><tbody><tr><td>Sels basaux Murashige et Skoog avec un minimum de matières organiques</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>Acide 1-naphtylacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Solution de kinétine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 Inhibiteur de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase</td><td>Cocktail Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protéase</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorèse&nbsp ; Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Échelle de protéines précolorées</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps de balise SBP (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>IgG-HRP de chèvre IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Mélange trypsine/lys-C, qualité Mass Spec</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Thiourée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&nbsp ;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique&nbsp ;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique&nbsp ;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Plate-forme Shaker</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh (Diamètre du fil 34 &micro ; M, épaisseur 55 & micro ; M, aire ouverte 14 %)</td><td>Prosepa</td> Entonnoir en verre <td>sur mesure</td><td></td></tr><tr><td>, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Flacon filtrant 500 mL 0,2 &micro ; M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Broyeur mélangeur MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol « "Classic" » avec 2 bouchons à vis différents sans filtres</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filtre (petit) 35 & micro ; Taille des pores M, pour Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de tube à vitesse variable SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Plats rotatifs pour rotateurs SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24-Port SPE</td><td>Collecteurs Restek&nbsp ;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17 % SPE Colonnes 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Échantillonneur automatique&nbsp ; Flacons</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&ouml ; r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Colonne</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 Chromatographe</td><td>liquide Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Spectromètre de masse</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Système UPLC Acquity&nbsp ;</td><td>Eaux&nbsp ;</td><td>Commande</td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Colonne, 100A, 1.8 & micro ; M, 2,1 mM X 100 mM, 1/paquet</td><td>d’eau&nbsp ;</td><td></td><td></td>186003533</tr><tr><td>Bains de nettoyage par ultrasons haute puissance pour solutions de nettoyage aqueux</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 en 1 : en une seule étape de purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite complexes

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Les processus cellulaires sont réglementés par des interactions entre molécules biologiques telles que des protéines, des métabolites et des acides nucléiques. Alors que l’étude des interactions protéine-protéine (PPI) n’est aucune nouveauté, approches expérimentales visant à caractériser les interactions protéine-métabolite endogène (PMI) constituent un développement assez récent. Ici, nous présentons un protocole qui permet la caractérisation simultanée de l’IPP et PMI d’une protéine de choix, dénommé comme appât. Notre protocole a été optimisé pour des Arabidopsis cell cultures et combine la purification d’affinité (AP) avec la spectrométrie de masse (MS)-fonction détection de protéines et de métabolites. En bref, les lignées transgéniques d’Arabidopsis, exprimant la protéine appât fusionnée à une balise d’affinité, sont tout d’abord lysées pour obtenir un extrait cellulaire natif. Anticorps anti-Tags servent à tirer vers le bas des partenaires protéiques et métabolite de la protéine de l’appât. Les complexes purifiés par affinité sont extraites à l’aide d’une seule étape méthyl tert-butyl éther (MTBE) / méthanol/eau méthode. Alors que les métabolites séparent dans le polaire ou la phase hydrophobe, protéines se trouvent dans le culot. Les métabolites et les protéines sont ensuite analysés par spectrométrie de masse par chromatographie liquide ultra performance (UPLC-MS ou UPLC-MS/MS). Lignes de contrôle vide-vector (EV) sont utilisés pour exclure des faux positifs. L’avantage majeur de notre protocole est qu’il permet d’identifier des partenaires protéiques et métabolite d’une protéine cible en parallèle dans des conditions physiologiques près (lysat cellulaire). La méthode présentée est simple, rapide et peut être facilement adaptée aux systèmes biologiques autres que les cultures de cellules végétales.

Dans l’étude originale, trois gènes d’Arabidopsis NDPK étaient surexprimés dans les cultures de suspension de cellules de PSB-L sous le contrôle du promoteur 35 s constitutif14 (Figure 1). Balise d’affinité en tandem a été fusionnée à une extrémité carboxy - ou amino-terminale d’une protéine de l’appât. Les complexes purifiés par affinité ont été soumis à l' extraction de MTBE/méthanol/eau16. Affinité-tiré de protéines et de petites molécules ont été identifiées à l’aide de MS (tableaux S2 et S3).
Pour corriger des faux positifs, échantillons blancs ont été utilisés pour exclure des contaminants de petites molécules des produits chimiques et consommables de laboratoire. En outre, métabolites et les protéines qui se lient à soit une balise d’affinité ou résine seul comptaient pour à l’aide de lignes de commande EV. Pour récupérer les vrais positifs, les t-test bilatéral non appariés de l’étudiant et les taux de fausse découverte Benjamini &amp; Hochberg correction a été appliquée afin d’identifier des métabolites (Tableau S4) et protéines (Tableau S5) considérablement enrichis dans l’AP NDPK expériences (N - et C-terminale le tag NDPK) en comparaison avec les lignes de contrôle EV (FDR &lt; 0,1). Notez que dans les travaux antérieurs, nous avons utilisé des critères absence/présence pour délimiter les Interactiens de protéines et de petites molécules.
Résultats représentatifs sont données pour NDPK1, tout en métabolite données mettant l’accent sur les dipeptides, une nouvelle classe des régulateurs petites molécules étudiées dans notre groupe. Analyse protéomique a révélé 26 partenaires de protéine putative de NDPK1. Par filtrage supplémentaire pour les protéines co localisés dans le même compartiment subcellulaire voir NDPK1 (cytosol), la liste réduite jusqu'à 13 Interactiens de protéine putative. Parmi les protéines identifiées étaient glutathion S-transférase, deux facteurs initiation, tubuline et aconitate hydratase. Métabolomique analyse a révélé quatre dipeptides Val-Leu, Ile-Glu, Leu-Ile et Ile-Phe qui spécifiquement co élué avec NDPK1 (Figure 2). Notez que tous les quatre dipeptides partagent un résidu hydrophobe dans leur extrémité N-terminale, ce qui suggère la spécificité de liaison partagée.
Chercher des complexes protéine-protéine et protéine-métabolite connus nous interrogé 13 identifiées protéines et quatre dipeptides contre le point de base de données25 (Figure 3). Plusieurs observations peuvent être faites : (i) aucun d'entre les Interactiens a été signalé auparavant pour NDPK1. (ii) APX1 orthologues a été signalé pour interagir avec l’aldéhyde déshydrogénase membre de la famille ALDH7B4, tout facteur d’initiation de traduction FBR12 avec un autre facteur d’initiation de traduction codé par le gène AT2G40290. (iii) les dipeptides identifiés ont rapporté non partenaires protéiques. Les dipeptides co éluées n’ont pas été signalés auparavant, associé à n’importe quelle protéine végétale récupérée. Cependant, ils jouent un rôle important dans d’autres organismes : Leu-Ile, par exemple, a un effet activateur neurotrophine dans une cellule humaine ligne26. Notez que l’expérience ne permet pas de déterminer la topologie exacte du système. Par exemple, un dipeptide peut-être interagir directement avec les NDPK1 mais peut bien être lié à l’une des protéines purifiées conjointement.
Pris ensemble, nos résultats montrent que la procédure établie, employant AP avec la spectrométrie de masse, facilite l’identification de protéine-protéine et protéine-petit-molécule Interactiens et contribue à générer des informations détaillées sur la interactome de la protéine cible.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Figure 1. Schéma du flux de travail AP-MS. (A) préparation d’une fraction soluble native de culture de cellules végétales. (B) prochaines étapes dans la procédure de l’AP. Après le chargement de l’échantillon sur la colonne, la protéine d’intérêt (POI) fusionnée à une balise de robinet se lie à l’anticorps de type IgG immobilisés sur les billes de gel d’agarose. Lavage de la colonne facilite l’élimination des protéines non liées et de métabolites. Après avoir effectué un clivage AcTEV, complexes de protéine-métabolite POI sont éluées. (C) séparation des complexes en fraction de protéine et métabolite suivie d’analyse semi-quantitative de SM. Partie de cette Figure est reproduite de Luzarowski al 201714. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Figure 2. Dipeptides spécifiquement à élution conjointement avec NDPK1. Les intensités moyennes de quatre dipeptides Val-Leu (A), Ile-Glu (B), (C)de la Leu-Ile et Ile-Phe (D) mesurée dans l’expérience de l’AP ont été tracées. Tous les quatre dipeptides montrent l’enrichissement significatif dans des échantillons de NDPK1 par rapport au témoin EV (astérisques représentent FDR &lt; 0,1). Barres d’erreur représentent écart-type pour les 6 mesures (3 répétitions de N - et 3 de terminalement tag protéines). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Figure 3. Réseau d’interactions de toutes les molécules à élution conjointement avec NDPK1, interrogé sur base de données de point tenant compte seulement précédent expérimentale et les preuves de base de données (confiance &gt; 0,2). Plus de confiance envers indique des chances plus élevées de l’interaction et est calculé en fonction des données déposées. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau S1. MaxQuant sortie de table « parameters.txt ». Table inclut des valeurs de seuil pour identification et quantification, en plus d’informations sur les bases de données utilisées. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau S2. Informations de MaxQuant sortie table « proteinGroups.txt ». Table contient une liste de tous les groupes de protéines identifiées, intensités et des informations supplémentaires telles que nombre de peptides uniques et score. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau S3. Fichier de sortie contenant l’analyse des métabolites polaires. Table contient une liste de toutes les fonctionnalités de massives identifiées caractérisée par spécifique m/z, RT et intensité. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau S4. Dipeptides trouvent dans des échantillons de l’AP dans les NDPK1, les NDPK2 ou les NDPK3 ont été utilisés comme appât. Dipeptides présents dans les échantillons blancs ont été exclus de la liste. Deux lignes indépendantes (taggés en soit N - ou C-terminale) pour chaque NDPK ont été exécutés en trois exemplaires. De Student t-tester et assurer la correction de la p-valeur à l’aide de Benjamini &amp; méthode Hochberg ont servi à déterminer les partenaires interactor significativement enrichis de NDPK (FDR &lt; 0,1). Donné est ΔRT calculé par rapport à la référence composés et Δppm en ce qui concerne le monoisotopique masse donnée dans Metlin27. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Table S5. Les protéines purifiées conjointement avec NDPK1. Deux lignes indépendantes (taggés en soit N - ou C-terminale) pour chaque NDPK ont été exécutés en trois exemplaires. De Student t-tester et assurer la correction de la p-valeur à l’aide de Benjamini &amp; méthode Hochberg ont servi à déterminer les partenaires interactor significativement enrichis de NDPK (FDR &lt; 0,1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite sont indispensables pour toutes les fonctions cellulaires. Ici, les auteurs décrivent un protocole qui permet une analyse parallèle de ces interactions avec une protéine de choix. Notre protocole a été optimisé pour les cultures de cellules végétales et combine purification d’affinité avec la protéine basé sur la spectrométrie de masse et de la détection de métabolite.

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Cette méthode peut être utilisée non seulement pour répondre à des questions clés en recherche fondamentale, mais aussi contribuer aux domaines médical, pharmaceutique et biotechnologique, en délimitant de nouveaux petits ligands moléculaires de protéines essentielles. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse parallèle des protéines et des partenaires métaboliques de la protéine choisie dans des conditions in vivo. Cette méthode permet de repérer les molécules en interaction sans être limitée à des ligands présélectionnés.Bien que cette méthode ait été développée pour les plantes, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les cellules HeLa, E. coli et S. Cerevisiae. Pour commencer, préparez le milieu MSMO et ajustez le pH à 5,7 avec une molaire d’hydroxyde de potassium. Ensuite, autoclavez la solution pendant 15 minutes à 121 degrés Celsius.Ajoutez les suppléments au milieu juste avant le début de l’expérience. Maintenant, cultivez une culture cellulaire transgénique PSBL Arabidopsis thaliana dans 50 millilitres de milieu MSMO dans une fiole de 100 millilitres. Ensuite, placez le ballon sur un agitateur à plate-forme orbitale et agitez doucement les cellules à 130 tr/min à 20 degrés Celsius à la lumière.Tous les sept jours, sous-cultivez les cellules dans un milieu frais à une solution de un à 10. Ensuite, utilisez un entonnoir en verre avec un treillis en nylon monté sur une fiole conique, relié à une pompe à vide pour récolter les cellules pendant la phase de croissance logarithmique. Ensuite, enveloppez les cellules séchées dans du papier d’aluminium et congelez-les dans de l’azote liquide.À l’aide d’un mélangeur pré-refroidi, réglé sur une fréquence vibratoire de 20 hertz. Homogénéisez la matière cellulaire végétale récoltée et congelée en une poudre fine pendant deux minutes. Ensuite, aliquote trois grammes de poudre broyée par échantillon à l’aide d’azote liquide, d’un équipement pré-refroidi pour l’empêcher de dégeler.Ensuite, à l’aide d’un mortier pré-refroidi à l’azote liquide, triturez la poudre broyée avec trois millilitres de tampon de lyse glacé jusqu’à ce qu’elle décongèle. Divisez immédiatement l’échantillon décongelé dans deux micro-tubes à centrifuger d’un millilitre. Centrifuger les échantillons à 20 817 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires.Pendant la centrifugation de l’échantillon, aliquote 100 microlitres de billes de sépharose IgG par échantillon. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse et remettez les billes en suspension par vortex. Essorez pendant trois secondes à 2 000 g et jetez le tampon de lyse.Enfin, remettez les billes en suspension dans 400 microlitres de tampon de lyse. Après la centrifugation, transférez trois millilitres de lysat végétal clair dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres. Ajoutez les billes pré-équilibrées au lysat végétal et incubez le mélange sur une roue rotative pendant une heure à quatre degrés Celsius.Transférez le mélange dans une seringue reliée à un capuchon verrouillé par leurre sur une colonne de centrifugation avec un filtre de la taille d’un pore de 35 micromètres situé sur le dessus du collecteur à vide. Faites passer le lysat à travers l’appareil en allumant la pompe à vide avec une légère pression pour éviter d’endommager les billes. Le lysat non lié est drainé dans la station de déchets située à la base du collecteur et les complexes protéiques, liés aux billes, restent sur le filtre.Une fois la seringue vidée du lysat cellulaire, ajoutez 10 millilitres de tampon de lavage pour laver les billes. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon d’élution pour effectuer la deuxième étape de lavage. Maintenant, retirez la seringue et le capuchon de verrouillage du leurre.Fermez le capuchon inférieur de la colonne et ajoutez 400 microlitres de tampon d’élution contenant 50 unités de la forme améliorée du virus de la gravure du tabac, la protéase, aux billes. Placez la colonne sur un agitateur de table, réglé à 1 000 tr/min pendant 30 minutes à 16 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 50 unités supplémentaires de protéase dans la colonne et incubez le mélange sur le shaker comme à l’étape précédente.Ensuite, retirez le capuchon inférieur et replacez la colonne dans un tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres. Centrifuger à 20 817 g pendant une minute pour recueillir l’éluat et procéder à l’extraction des protéines et des métabolites. Pour commencer l’extraction, ajoutez un millilitre de trois à un solvant d’eau de méthanol MTBE à l’éluat.Retournez le tube pour le mélanger à l’échantillon. Ensuite, ajoutez 0,4 millilitre d’une à trois solutions d’eau de méthanol au mélange et retournez le tube pour mélanger l’échantillon. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 20 817 g pendant deux minutes à température ambiante pour permettre la séparation des phases.À l’aide d’une pipette manuelle de manipulation de liquide d’un millilitre, retirez la phase supérieure contenant les lipides. Ensuite, ajoutez 0,2 millilitre de méthanol et retournez le tube pour mélanger l’échantillon. Centrifuger à 20 817 g pendant deux minutes à température ambiante et recueillir la phase polaire dans un nouveau tube pour mesurer les métabolites.Laissez environ 50 microlitres de phase polaire au fond du tube pour éviter de déloger la pastille de protéine. Ensuite, séchez le tube contenant la phase polaire dans un évaporateur centrifuge pendant la nuit. Séchez les tubes de granulés de protéines pendant 30 à 60 minutes pour éviter un séchage excessif.La purification par affinité en une étape, associée à la spectrométrie de masse, les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite dans des cultures cellulaires transgéniques d’Arabidopsis thaliana ont été identifiées. Les cultures cellulaires exprimant NDPK1 montrent un enrichissement significatif en valine-leucine, en isoleucine glutamate, en leucine, en isoleucine et en isoleucine phénylalanine par rapport aux échantillons de vecteurs vides, NDPK2 et NDPK3. Pour rechercher des interactions protéine-protéine et protéine-métabolite connues, 13 protéines et quatre dipeptides co-éluant avec NDPK1 sont comparés à la base de données des points.Les principales associations sont observées entre l’orthologue APX1 et la famille des aldéhydes déshydrogénases, et le facteur d’initiation de la traduction, FBR12, avec l’homologue alpha du facteur d’initiation de la traduction deux. Les dipeptides identifiés ne montrent aucun partenaire protéique signalé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, si elle est correctement exécutée.Lors de cette procédure, il est important de garder les échantillons, l’équipement et les réactifs froids tout au long de l’expérience. Après cette procédure, d’autres méthodes, comme la thermophorèse au microscope ou le test d’activité, peuvent être effectuées afin de déterminer l’interaction directe entre les molécules ou l’inférence de leur ligand sur l’activité protéique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler l’échantillon tout au long de la procédure pour obtenir des résultats fiables et identifier les ligands de la protéine de votre choix.N’oubliez pas que travailler avec du méthanol et une solution MTBE peut être extrêmement dangereux. Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté et des précautions, telles que le travail sous la hotte, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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