Name: Transplantation de Homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez la transplantation homochronique de précurseurs d'interneurones dans le cerveau postnatal de souris. Cette méthode permet d'étudier l'influence de l'environnement sur le destin et la maturation neuronale.

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Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health (K99MH104595) et le programme de recherche intra-muros de NICHD pour T.J.P. Nous remercions Gord Fishell, dans le laboratoire de dont cette approche a été initialement établie.

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<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
<li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li>
<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un aspect essentiel de ce protocole de maximiser les chances de survie des cellules. Veiller à ce que les tissus et les cellules sont toujours en sACSF de carboxygenated de glace froide est nécessaire pour promouvoir la survie des cellules. Cela nécessite une dissection efficace et une stratégie de dissociation pour minimiser la durée pendant laquelle les cellules passent dans divers solution et à l’extérieur de l’environnement du cerveau. Selon le nombre de régions du cerveau sont disséqués et transplantés, il peut être...

Bon fonctionnement cortical nécessite un équilibre entre les neurones de projection excitatrices et des interneurones GABAergiques inhibiteurs, une population extrêmement hétérogène avec des morphologies distinctes, les propriétés électrophysiologiques, connectivité et neurochimiques marqueurs. Un développement anormal et la fonction des interneurones (et sous-groupes spécifiques interneurone) a été liée à la pathologie des troubles psychiatriques comme la schizophrénie, l’autisme et d’épilepsie1,2,3. En outre, de nombreux gènes impliqués dans ces troubles cérébraux sont fortement enrichis en interneurones jeune4. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent la maturation et la détermination du sort interneurone est nécessaire pour comprendre le développement normal et les étiologies possibles de nombreuses maladies cérébrales.
Interneurones du prosencéphale sont issus principalement de deux structures embryonnaires transitoires, les éminences ganglionnaires médiales et caudales (MGE et GCE, respectivement). Ces cellules postmitotiques (précurseurs des interneurones) subissent alors une phase de migration tangentielle prolongées de se disperser dans le télencéphale où ils s’intègrent dans une grande variété de circuits. Dérivé de MGE interneurones consistent en trois sous-groupes en grande partie non chevauchantes, neurochemically définies : rapide de fortification interneurones de la parvalbumine (PV+), non EXPRES interneurones de la somatostatine (SST+), de dopage et fin de fortification neuronale nitrique interneurones de synthase (nNOS+) oxyde qui constituent les cellules hippocampiques de neurogliaform et de lierre. Plusieurs laboratoires ont identifié plusieurs mécanismes au sein de la MGE qui régissent les décisions initiales sort en PV+ / SST + interneurones, y compris les gradients spatiaux de morphogènes, date de naissance des précurseurs des interneurones et le mode de division neurogène 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. il a été suggéré que les interneurones initialement se différencient en « classes de cardinales » et ensuite progressivement mûrissent « classes définitifs » pendant qu’ils interagissent avec leur environnement11. Des données récentes indiquent que certains sous-types interneurone matures peuvent être génétiquement câblé fur ces cellules postmitotiques dans les éminences ganglionnaires, indiquant que les premiers programmes de génétiques intrinsèques définies peuvent jouer un rôle plus important qu’auparavant apprécié12,13. Toutefois, la question clé de la façon dont les programmes génétiques intrinsèques interagissent avec signaux environnementaux à la différenciation de la voiture en sous-types distincts interneurone demeure largement inexplorée.
De nombreuses études ont transplanté des cellules embryonnaires de MGE directement dans diverses régions du cerveau, avec les résultats d’un consensus qui greffé des cellules matures et libèrent GABA qui empêche généralement les circuits endogène local14,,15, 16,17,18,19. Ces promettant observations ont suscité un intérêt considérable en utilisant les cellules souches humaines pluripotentes induites (hIPSC)-dérivé des interneurones pour traiter une variété de maladies du cerveau. Cependant, très peu de ces études évaluer si ces cellules greffées mûrissent les types attendus des interneurones matures, un élément essentiel quand on pense approches translationnelles.
Pour répondre à comment l’environnement influence interneurones de différenciation et de maturation, une stratégie a été conçue pour transplanter des précurseurs immatures interneurones dans de nouveaux environnements de cerveau pour examiner si des interneurones greffées adoptent des caractéristiques de l’hôte environnement ou conserver les caractéristiques de l' environnement de donateurs20. MGE transplantations ne conviennent pas à répondre à cette question car la MGE contient une population mixte d’interneurones GABAergiques projection les cellules et qui se dispersent tout au long de nombreuses cerveau régions21. Sans savoir où ces cellules MGE auraient migré, on ne peut pas complètement évaluer comment ces transplantations d’organes sont affectées par l’environnement de cerveau. En récoltant les précurseurs des interneurones à intervalles postnatale précoce, ce problème est contourné par l’obtention de cellules immatures qui ont terminé leur migration et ont atteint leur cible région du cerveau, mais ont une interaction minimale avec l’environnement. En mettant l’accent sur des caractéristiques spécifiques des interneurones qui sont exprimés de façon différentielle entre les régions cérébrales distinctes, on peut alors déterminer comment l’environnement hôte modifie les propriétés d’interneurones. L’approche générale proposée dans le présent Protocole s’appliquera à tout enquêteur que veut examiner comment les jeunes neurones comporte quand a contesté dans un nouvel environnement.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Matrices cérébrales</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Uniquement nécessaire en cas de prélèvement du striatum</td></tr><tr><td>Pointe fine Pince Dumont Roboz</td><td></td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de microdissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur manuel avec support</td><td>World Precision Instruments&nbsp ;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en plastique à fond rond de 5 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 60 mm Boîtes de Pétri</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ThermoFisher</td><td></td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um filtres</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantation de homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Maturation et détermination neuronale sort nécessite une interaction complexe entre des programmes génétiques et signaux environnementaux. Cependant, démêler les rôles d’intrinsèque contre les mécanismes extrinsèques qui régulent ce processus de différenciation est une énigme pour tous les neurobiologistes du développement. Ce problème est amplifié pour les interneurones GABAergiques, une population de cellules incroyablement hétérogène qui naît de structures embryonnaires transitoires et subir une phase prolongée migrateur de se disperser dans le télencéphale. Pour découvrir comment différents cerveau environnements affect interneurone sort et la maturation, nous avons développé un protocole pour la récolte des interneurones immatures fluorescent étiquetés précurseurs de certaines régions du cerveau chez des souris nouveau-nées (P0-P2). À cet âge, migration interneurone est presque terminée et ces cellules sont résidant dans leurs environnements de repos finales avec relativement peu d’intégration synaptique. Après la collecte des solutions unicellulaire par cytométrie en flux, ces précurseurs d’interneurones sont transplantées P0-P2 type sauvage postnatals chiots. En effectuant les deux homotopes (p. ex., cortex-à-cortex) ou hétérotopique (p. ex., cortex-à-hippocampus) transplantations d’organes, on peut évaluer comment contester des interneurones immatures dans de nouveaux environnements de cerveau influe sur leur sort, la maturation et intégration circuit. Cerveau peut être récolté chez les souris adultes et testés avec une grande variété d’analyse posthoc sur les cellules greffées, y compris immunohistochimiques, profilage électrophysiologiques et transcriptionnelle. Cette approche générale fournit des enquêteurs avec une stratégie d’analyser comment différents environnements de cerveau peuvent influer sur nombreux aspects du développement de neurone et identifier les spécificités neuronales sont principalement déterminées par les programmes génétiques câblé ou signaux environnementaux.

Ce protocole montre comment récolter des régions précises du cerveau de cerveaux postnatale précoce (Figure 1-2), recueillir des dissociations unicellulaire des précurseurs des interneurones et transplanter ces cellules dans diverses régions du cerveau en naïf WT chiots postnatals (Figure 3). Pour l’analyse posthoc, cerveau qui a reçu d’interneurones précurseur greffes ont été récoltés entre P30-35 pour caractéri...

Défi jeunes neurones dans de nouvelles régions de cerveau peut révéler des renseignements importants sur comment l’environnement sculpte la maturation et le sort neuronale. Ce protocole décrit un procédé pour récolter les précurseurs des interneurones de certaines régions du cerveau et les transplanter soit homotopically ou isotransplantation dans le cerveau des petits après la naissance.

Transplantation de Homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

L’objectif global de cette procédure est de récolter des précurseurs d’interneurones à partir de régions cérébrales distinctes chez des bébés souris postnatals, et de transplanter ces cellules chez des receveurs du même âge afin d’évaluer comment les changements environnementaux influencent le destin et la maturation des interneurones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences du développement sur la façon dont les programmes génétiques intrinsèques et les signaux environnementaux interagissent pour sculpter le destin des cellules neurales. Le principal avantage de cette technique est que les altérations du destin et de la maturation des précurseurs de l’interneurone peuvent être analysées après leur transfert adoptif dans un nouvel environnement cérébral.La démonstration visuelle des étapes de prélèvement et de greffe de cellules est essentielle car de petites erreurs dans la technique peuvent conduire à des expériences de transplantation inefficaces et infructueuses. Pour commencer, placez une lame de rasoir dans le lobe frontal antérieur d’un cerveau de chiot postnatal, et des lames de rasoir supplémentaires dans les fentes juste derrière la première lame de rasoir pour générer deux tranches de 0,5 millimètre. Transférez les tranches de striatal dans une boîte de Pétri avec du saccharose bullé, du liquide céphalo-rachidien artificiel ou sACSF et placez le tissu cérébral restant dans une boîte de Pétri avec sACSF sur glace.Placez les tranches sous un microscope à dissection et utilisez une pince pour pincer le striatum des deux hémisphères, en plaçant les morceaux de striatum dans un tube de 50 millilitres de sACSF sur de la glace pendant qu’ils sont récoltés. Si le cerveau a été prélevé sur une souris rapporteure fluorescente, utilisez la microscopie à fluorescence pour distinguer le signal striatal td-tomato du signal fluorescent plus fort du globus pallidus. Pour retirer l’hippocampe, utilisez une pince pour hémisecter le cerveau le long de la ligne médiane et placez un hémisphère sous un microscope à dissection de la surface médiane vers le haut.À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer le tissu cérébral ventral et identifier l’hippocampe en forme de saucisse qui enjambe l’accès antéropostérieur le long des côtés dorsal et ventriculaire du cortex. Insérez les pointes de la pince devant l’hippocampe antérieur et avancez la pince vers l’arrière tout en pinçant le long du bord cortical de l’hippocampe pour séparer doucement l’hippocampe du cortex. Placez le tissu isolé dans un tube de 50 millilitres de sACSF sur de la glace et répétez la récolte de l’hippocampe pour l’hémisphère controlatéral.Placez ensuite le cortex hémirecté côté médial vers le bas et utilisez la pince pour retirer les parties les plus dorsales, ventrales, antérieures et postérieures du cortex. Transférez le carré restant du cortex médial dans un tube de 50 millilitres de sACSF sur de la glace. Après avoir retiré le cerveau, épinglez le côté ventral du cerveau à travers le cervelet et le cortex antérieur ou les bulbes olfactifs.À l’aide d’une pince incurvée, séparez doucement le cortex postérieur de l’hippocampe sous-jacent et des autres tissus de chaque hémisphère. Et décollez le cortex dorsal vers l’avant pour exposer les structures sous-jacentes. Utilisez des pinces pour pincer l’hippocampe dans un hémisphère sur la ligne médiane et retirez l’hippocampe en le décollant latéralement du cerveau.Placez l’hippocampe dans un tube de 50 millilitres de sACSF sur de la glace et récoltez l’hippocampe controlatéral de la même manière. Ensuite, grattez doucement les bords du striatum pour le détacher des tissus environnants. Pincez doucement sous le striatum pour prélever le tissu striatal.Après avoir prélevé le cortex des deux hémisphères, comme démontré précédemment, transférez le striatum sous une lunette de dissection fluorescente. À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer tout tissu rouge vif de chaque striatum. Lorsque tous les tissus ont été prélevés, transférez les tissus dans un tube à fond rond de cinq millimètres et remplacez le sACSF dans chaque tube de prélèvement par deux millilitres de solution pronase-sACSF fraîchement préparée pour une incubation de 20 minutes à température ambiante avec un effleurement occasionnel.A la fin de l’incubation, remplacer délicatement la pronase-sACSF par un à deux millilitres de solution de reconstitution, et dissocier mécaniquement les tissus à l’aide de pipes Pasteur polies au feu. Lorsque le tissu est trouble et qu’aucun morceau de tissu n’est visible, filtrez la solution cellulaire à travers un filtre de 50 microns dans de nouveaux tubes à fond rond de cinq millilitres pour éliminer tout amas de cellules avant le tri cellulaire activé par fluorescence. Après avoir reçu les cellules de la cytométrie en flux, transférez les suspensions cellulaires dans des tubes coniques de 1,5 millilitre pour la centrifugation.Après la centrifugation, aspirez tous les microlitres de surnageant de chaque tube, sauf les 20 derniers litres, et reconstituez les granulés pour le comptage. Si nécessaire, diluez la solution cellulaire avec sACSF à une concentration de une à trois fois 10 à 10 à 5 cellules par microlitre. Chargez une micropipette à pointe fine d’huile minérale.Fixez la micropipette à un injecteur de nanolitres et fixez l’appareil d’injection de nanolitres à un manipulateur fixé à une base magnétique. Pendant que le premier chiot est anesthésié sur de la glace, pipetez la solution cellulaire plusieurs fois pour assurer une distribution cellulaire homogène. Éjectez l’huile minérale et remplissez complètement la pipette avec la suspension à cellule unique.Après avoir confirmé une absence de réponse au pincement de l’orteil, placez le chiot sur un couvercle de boîte de Pétri avec la tête reposant sur du mastic adhésif, de sorte que le haut de la tête soit relativement plat. Couvrez la tête avec un morceau de ruban adhésif de laboratoire avec un trou en diamant, en tirant sur le ruban jusqu’à ce que la peau soit étirée de sorte que la tête soit fermement fixée et que le lambda soit visible à travers le trou. Déplacez le chiot fixé sous l’injecteur de nanolitre et abaissez la micropipette de manière à ce que la pointe soit directement au-dessus de lambda.Observez les coordonnées X et Y sur le manipulateur et ajustez les boutons du manipulateur jusqu’à ce que la micropipette soit positionnée aux coordonnées appropriées le long des axes médian, latéral et antéropostérieur de la tête. Abaissez la micropipette jusqu’à ce que la pointe crée une petite concavité sur la peau, et tournez le bouton du manipulateur de l’axe z fermement mais doucement pour enfoncer la micropipette à travers la peau et le crâne jusqu’au cerveau. Rétractez légèrement la micropipette jusqu’à ce que la pointe soit entourée d’un cône de peau en forme de tente.Et affichez les coordonnées le long de l’axe z. Abaissez ensuite la micropipette à la profondeur d’expérience appropriée et injectez les cellules. Attendez 15 secondes après la distribution des cellules avant de rétracter la micropipette et répétez l’injection à un deuxième endroit si vous le souhaitez.Placez le chiot sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement avant de le transférer dans la cage familiale. Les cellules greffées migrent dans les régions cérébrales ciblées avec des taux de survie cellulaire variables allant de quelques dizaines à plusieurs milliers. Les cellules greffées se localisent dans les régions appropriées, de nombreuses cellules présentant des morphologies d’interneurones et des marqueurs neurochimiques interneuronaux bien caractérisés.Les cellules du donneur survivent et mûrissent même lorsqu’elles sont greffées dans de nouveaux environnements avec des transplantations hétérotopiques. L’analyse électrophysiologique des cellules greffées révèle des propriétés physiologiques de type adulte et des schémas de décharge distincts, représentatifs de sous-types d’interneurones bien définis, suggérant que les interneurones greffés sont capables de mûrir correctement dans l’environnement hôte. Les cellules transplantées présentent également des courants postsynaptiques excitateurs spontanés.L’enregistrement à partir de cellules pyramidales adjacentes à des interneurones transplantés exprimant la channelrhodopsine-2 révèle des courants GABAergiques postsynaptiques qui sont évoqués par la lumière bleue dans ces cellules pyramidales endogènes. Lors de cette procédure, il est important de garder les cellules sur de la glace et de triturer doucement les cellules avec une pipette Pasteur pour minimiser la mort cellulaire. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage de cellules uniques peuvent être effectuées sur les cellules greffées pour définir plus précisément comment les changements environnementaux affectent le transcriptome d’une cellule.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’isoler les précurseurs d’interneurones de différentes régions cérébrales de chiots nouveau-nés et de transplanter ces cellules dans diverses régions cérébrales de chiots postnatals du même âge.

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JoVE Journal

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