Transplantation de Homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce

L’objectif global de cette procédure est de récolter des précurseurs d’interneurones à partir de régions cérébrales distinctes chez des bébés souris postnatals, et de transplanter ces cellules chez des receveurs du même âge afin d’évaluer comment les changements environnementaux influencent le destin et la maturation des interneurones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences du développement sur la façon dont les programmes génétiques intrinsèques et les signaux environnementaux interagissent pour sculpter le destin des cellules neurales. Le principal avantage de cette technique est que les altérations du destin et de la maturation des précurseurs de l’interneurone peuvent être analysées après leur transfert adoptif dans un nouvel environnement cérébral.

La démonstration visuelle des étapes de prélèvement et de greffe de cellules est essentielle car de petites erreurs dans la technique peuvent conduire à des expériences de transplantation inefficaces et infructueuses. Pour commencer, placez une lame de rasoir dans le lobe frontal antérieur d’un cerveau de chiot postnatal, et des lames de rasoir supplémentaires dans les fentes juste derrière la première lame de rasoir pour générer deux tranches de 0,5 millimètre. Transférez les tranches de striatal dans une boîte de Pétri avec du saccharose bullé, du liquide céphalo-rachidien artificiel ou sACSF et placez le tissu cérébral restant dans une boîte de Pétri avec sACSF sur glace.

Placez les tranches sous un microscope à dissection et utilisez une pince pour pincer le striatum des deux hémisphères, en plaçant les morceaux de striatum dans un tube de 50 millilitres de sACSF sur de la glace pendant qu’ils sont récoltés. Si le cerveau a été prélevé sur une souris rapporteure fluorescente, utilisez la microscopie à fluorescence pour distinguer le signal striatal td-tomato du signal fluorescent plus fort du globus pallidus. Pour retirer l’hippocampe, utilisez une pince pour hémisecter le cerveau le long de la ligne médiane et placez un hémisphère sous un microscope à dissection de la surface médiane vers le haut.

À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer le tissu cérébral ventral et identifier l’hippocampe en forme de saucisse qui enjambe l’accès antéropostérieur le long des côtés dorsal et ventriculaire du cortex. Insérez les pointes de la pince devant l’hippocampe antérieur et avancez la pince vers l’arrière tout en pinçant le long du bord cortical de l’hippocampe pour séparer doucement l’hippocampe du cortex. Placez le tissu isolé dans un tube de 50 millilitres de sACSF sur de la glace et répétez la récolte de l’hippocampe pour l’hémisphère controlatéral.

Placez ensuite le cortex hémirecté côté médial vers le bas et utilisez la pince pour retirer les parties les plus dorsales, ventrales, antérieures et postérieures du cortex. Transférez le carré restant du cortex médial dans un tube de 50 millilitres de sACSF sur de la glace. Après avoir retiré le cerveau, épinglez le côté ventral du cerveau à travers le cervelet et le cortex antérieur ou les bulbes olfactifs.

À l’aide d’une pince incurvée, séparez doucement le cortex postérieur de l’hippocampe sous-jacent et des autres tissus de chaque hémisphère. Et décollez le cortex dorsal vers l’avant pour exposer les structures sous-jacentes. Utilisez des pinces pour pincer l’hippocampe dans un hémisphère sur la ligne médiane et retirez l’hippocampe en le décollant latéralement du cerveau.

Placez l’hippocampe dans un tube de 50 millilitres de sACSF sur de la glace et récoltez l’hippocampe controlatéral de la même manière. Ensuite, grattez doucement les bords du striatum pour le détacher des tissus environnants. Pincez doucement sous le striatum pour prélever le tissu striatal.

Après avoir prélevé le cortex des deux hémisphères, comme démontré précédemment, transférez le striatum sous une lunette de dissection fluorescente. À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer tout tissu rouge vif de chaque striatum. Lorsque tous les tissus ont été prélevés, transférez les tissus dans un tube à fond rond de cinq millimètres et remplacez le sACSF dans chaque tube de prélèvement par deux millilitres de solution pronase-sACSF fraîchement préparée pour une incubation de 20 minutes à température ambiante avec un effleurement occasionnel.

A la fin de l’incubation, remplacer délicatement la pronase-sACSF par un à deux millilitres de solution de reconstitution, et dissocier mécaniquement les tissus à l’aide de pipes Pasteur polies au feu. Lorsque le tissu est trouble et qu’aucun morceau de tissu n’est visible, filtrez la solution cellulaire à travers un filtre de 50 microns dans de nouveaux tubes à fond rond de cinq millilitres pour éliminer tout amas de cellules avant le tri cellulaire activé par fluorescence. Après avoir reçu les cellules de la cytométrie en flux, transférez les suspensions cellulaires dans des tubes coniques de 1,5 millilitre pour la centrifugation.

Après la centrifugation, aspirez tous les microlitres de surnageant de chaque tube, sauf les 20 derniers litres, et reconstituez les granulés pour le comptage. Si nécessaire, diluez la solution cellulaire avec sACSF à une concentration de une à trois fois 10 à 10 à 5 cellules par microlitre. Chargez une micropipette à pointe fine d’huile minérale.

Fixez la micropipette à un injecteur de nanolitres et fixez l’appareil d’injection de nanolitres à un manipulateur fixé à une base magnétique. Pendant que le premier chiot est anesthésié sur de la glace, pipetez la solution cellulaire plusieurs fois pour assurer une distribution cellulaire homogène. Éjectez l’huile minérale et remplissez complètement la pipette avec la suspension à cellule unique.

Après avoir confirmé une absence de réponse au pincement de l’orteil, placez le chiot sur un couvercle de boîte de Pétri avec la tête reposant sur du mastic adhésif, de sorte que le haut de la tête soit relativement plat. Couvrez la tête avec un morceau de ruban adhésif de laboratoire avec un trou en diamant, en tirant sur le ruban jusqu’à ce que la peau soit étirée de sorte que la tête soit fermement fixée et que le lambda soit visible à travers le trou. Déplacez le chiot fixé sous l’injecteur de nanolitre et abaissez la micropipette de manière à ce que la pointe soit directement au-dessus de lambda.

Observez les coordonnées X et Y sur le manipulateur et ajustez les boutons du manipulateur jusqu’à ce que la micropipette soit positionnée aux coordonnées appropriées le long des axes médian, latéral et antéropostérieur de la tête. Abaissez la micropipette jusqu’à ce que la pointe crée une petite concavité sur la peau, et tournez le bouton du manipulateur de l’axe z fermement mais doucement pour enfoncer la micropipette à travers la peau et le crâne jusqu’au cerveau. Rétractez légèrement la micropipette jusqu’à ce que la pointe soit entourée d’un cône de peau en forme de tente.

Et affichez les coordonnées le long de l’axe z. Abaissez ensuite la micropipette à la profondeur d’expérience appropriée et injectez les cellules. Attendez 15 secondes après la distribution des cellules avant de rétracter la micropipette et répétez l’injection à un deuxième endroit si vous le souhaitez.

Placez le chiot sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement avant de le transférer dans la cage familiale. Les cellules greffées migrent dans les régions cérébrales ciblées avec des taux de survie cellulaire variables allant de quelques dizaines à plusieurs milliers. Les cellules greffées se localisent dans les régions appropriées, de nombreuses cellules présentant des morphologies d’interneurones et des marqueurs neurochimiques interneuronaux bien caractérisés.

Les cellules du donneur survivent et mûrissent même lorsqu’elles sont greffées dans de nouveaux environnements avec des transplantations hétérotopiques. L’analyse électrophysiologique des cellules greffées révèle des propriétés physiologiques de type adulte et des schémas de décharge distincts, représentatifs de sous-types d’interneurones bien définis, suggérant que les interneurones greffés sont capables de mûrir correctement dans l’environnement hôte. Les cellules transplantées présentent également des courants postsynaptiques excitateurs spontanés.

L’enregistrement à partir de cellules pyramidales adjacentes à des interneurones transplantés exprimant la channelrhodopsine-2 révèle des courants GABAergiques postsynaptiques qui sont évoqués par la lumière bleue dans ces cellules pyramidales endogènes. Lors de cette procédure, il est important de garder les cellules sur de la glace et de triturer doucement les cellules avec une pipette Pasteur pour minimiser la mort cellulaire. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage de cellules uniques peuvent être effectuées sur les cellules greffées pour définir plus précisément comment les changements environnementaux affectent le transcriptome d’une cellule.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’isoler les précurseurs d’interneurones de différentes régions cérébrales de chiots nouveau-nés et de transplanter ces cellules dans diverses régions cérébrales de chiots postnatals du même âge.