Name: Transplantation de Homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez la transplantation homochronique de précurseurs d'interneurones dans le cerveau postnatal de souris. Cette méthode permet d'étudier l'influence de l'environnement sur le destin et la maturation neuronale.

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Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health (K99MH104595) et le programme de recherche intra-muros de NICHD pour T.J.P. Nous remercions Gord Fishell, dans le laboratoire de dont cette approche a été initialement établie.

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<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
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<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un aspect essentiel de ce protocole de maximiser les chances de survie des cellules. Veiller à ce que les tissus et les cellules sont toujours en sACSF de carboxygenated de glace froide est nécessaire pour promouvoir la survie des cellules. Cela nécessite une dissection efficace et une stratégie de dissociation pour minimiser la durée pendant laquelle les cellules passent dans divers solution et à l’extérieur de l’environnement du cerveau. Selon le nombre de régions du cerveau sont disséqués et transplantés, il peut être...

Bon fonctionnement cortical nécessite un équilibre entre les neurones de projection excitatrices et des interneurones GABAergiques inhibiteurs, une population extrêmement hétérogène avec des morphologies distinctes, les propriétés électrophysiologiques, connectivité et neurochimiques marqueurs. Un développement anormal et la fonction des interneurones (et sous-groupes spécifiques interneurone) a été liée à la pathologie des troubles psychiatriques comme la schizophrénie, l’autisme et d’épilepsie1,2,3. En outre, de nombreux gènes impliqués dans ces troubles cérébraux sont fortement enrichis en interneurones jeune4. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent la maturation et la détermination du sort interneurone est nécessaire pour comprendre le développement normal et les étiologies possibles de nombreuses maladies cérébrales.
Interneurones du prosencéphale sont issus principalement de deux structures embryonnaires transitoires, les éminences ganglionnaires médiales et caudales (MGE et GCE, respectivement). Ces cellules postmitotiques (précurseurs des interneurones) subissent alors une phase de migration tangentielle prolongées de se disperser dans le télencéphale où ils s’intègrent dans une grande variété de circuits. Dérivé de MGE interneurones consistent en trois sous-groupes en grande partie non chevauchantes, neurochemically définies : rapide de fortification interneurones de la parvalbumine (PV+), non EXPRES interneurones de la somatostatine (SST+), de dopage et fin de fortification neuronale nitrique interneurones de synthase (nNOS+) oxyde qui constituent les cellules hippocampiques de neurogliaform et de lierre. Plusieurs laboratoires ont identifié plusieurs mécanismes au sein de la MGE qui régissent les décisions initiales sort en PV+ / SST + interneurones, y compris les gradients spatiaux de morphogènes, date de naissance des précurseurs des interneurones et le mode de division neurogène 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. il a été suggéré que les interneurones initialement se différencient en « classes de cardinales » et ensuite progressivement mûrissent « classes définitifs » pendant qu’ils interagissent avec leur environnement11. Des données récentes indiquent que certains sous-types interneurone matures peuvent être génétiquement câblé fur ces cellules postmitotiques dans les éminences ganglionnaires, indiquant que les premiers programmes de génétiques intrinsèques définies peuvent jouer un rôle plus important qu’auparavant apprécié12,13. Toutefois, la question clé de la façon dont les programmes génétiques intrinsèques interagissent avec signaux environnementaux à la différenciation de la voiture en sous-types distincts interneurone demeure largement inexplorée.
De nombreuses études ont transplanté des cellules embryonnaires de MGE directement dans diverses régions du cerveau, avec les résultats d’un consensus qui greffé des cellules matures et libèrent GABA qui empêche généralement les circuits endogène local14,,15, 16,17,18,19. Ces promettant observations ont suscité un intérêt considérable en utilisant les cellules souches humaines pluripotentes induites (hIPSC)-dérivé des interneurones pour traiter une variété de maladies du cerveau. Cependant, très peu de ces études évaluer si ces cellules greffées mûrissent les types attendus des interneurones matures, un élément essentiel quand on pense approches translationnelles.
Pour répondre à comment l’environnement influence interneurones de différenciation et de maturation, une stratégie a été conçue pour transplanter des précurseurs immatures interneurones dans de nouveaux environnements de cerveau pour examiner si des interneurones greffées adoptent des caractéristiques de l’hôte environnement ou conserver les caractéristiques de l' environnement de donateurs20. MGE transplantations ne conviennent pas à répondre à cette question car la MGE contient une population mixte d’interneurones GABAergiques projection les cellules et qui se dispersent tout au long de nombreuses cerveau régions21. Sans savoir où ces cellules MGE auraient migré, on ne peut pas complètement évaluer comment ces transplantations d’organes sont affectées par l’environnement de cerveau. En récoltant les précurseurs des interneurones à intervalles postnatale précoce, ce problème est contourné par l’obtention de cellules immatures qui ont terminé leur migration et ont atteint leur cible région du cerveau, mais ont une interaction minimale avec l’environnement. En mettant l’accent sur des caractéristiques spécifiques des interneurones qui sont exprimés de façon différentielle entre les régions cérébrales distinctes, on peut alors déterminer comment l’environnement hôte modifie les propriétés d’interneurones. L’approche générale proposée dans le présent Protocole s’appliquera à tout enquêteur que veut examiner comment les jeunes neurones comporte quand a contesté dans un nouvel environnement.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Matrices cérébrales</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Uniquement nécessaire en cas de prélèvement du striatum</td></tr><tr><td>Pointe fine Pince Dumont Roboz</td><td></td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de microdissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur manuel avec support</td><td>World Precision Instruments&nbsp ;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en plastique à fond rond de 5 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 60 mm Boîtes de Pétri</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ThermoFisher</td><td></td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um filtres</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantation de homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Maturation et détermination neuronale sort nécessite une interaction complexe entre des programmes génétiques et signaux environnementaux. Cependant, démêler les rôles d’intrinsèque contre les mécanismes extrinsèques qui régulent ce processus de différenciation est une énigme pour tous les neurobiologistes du développement. Ce problème est amplifié pour les interneurones GABAergiques, une population de cellules incroyablement hétérogène qui naît de structures embryonnaires transitoires et subir une phase prolongée migrateur de se disperser dans le télencéphale. Pour découvrir comment différents cerveau environnements affect interneurone sort et la maturation, nous avons développé un protocole pour la récolte des interneurones immatures fluorescent étiquetés précurseurs de certaines régions du cerveau chez des souris nouveau-nées (P0-P2). À cet âge, migration interneurone est presque terminée et ces cellules sont résidant dans leurs environnements de repos finales avec relativement peu d’intégration synaptique. Après la collecte des solutions unicellulaire par cytométrie en flux, ces précurseurs d’interneurones sont transplantées P0-P2 type sauvage postnatals chiots. En effectuant les deux homotopes (p. ex., cortex-à-cortex) ou hétérotopique (p. ex., cortex-à-hippocampus) transplantations d’organes, on peut évaluer comment contester des interneurones immatures dans de nouveaux environnements de cerveau influe sur leur sort, la maturation et intégration circuit. Cerveau peut être récolté chez les souris adultes et testés avec une grande variété d’analyse posthoc sur les cellules greffées, y compris immunohistochimiques, profilage électrophysiologiques et transcriptionnelle. Cette approche générale fournit des enquêteurs avec une stratégie d’analyser comment différents environnements de cerveau peuvent influer sur nombreux aspects du développement de neurone et identifier les spécificités neuronales sont principalement déterminées par les programmes génétiques câblé ou signaux environnementaux.

Ce protocole montre comment récolter des régions précises du cerveau de cerveaux postnatale précoce (Figure 1-2), recueillir des dissociations unicellulaire des précurseurs des interneurones et transplanter ces cellules dans diverses régions du cerveau en naïf WT chiots postnatals (Figure 3). Pour l’analyse posthoc, cerveau qui a reçu d’interneurones précurseur greffes ont été récoltés entre P30-35 pour caractéri...

Défi jeunes neurones dans de nouvelles régions de cerveau peut révéler des renseignements importants sur comment l’environnement sculpte la maturation et le sort neuronale. Ce protocole décrit un procédé pour récolter les précurseurs des interneurones de certaines régions du cerveau et les transplanter soit homotopically ou isotransplantation dans le cerveau des petits après la naissance.

Transplantation de Homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

L’objectif global de cette procédure est de récolter des précurseurs d’interneurones à partir de régions cérébrales distinctes chez des bébés souris postnatals, et de transplanter ces cellules chez des receveurs du même âge afin d’évaluer comment les changements environnementaux influencent le destin et la maturation des interneurones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences du développement sur la façon dont les programmes génétiques intrinsèques et les signaux environnementaux interagissent pour sculpter le destin des cellules neurales. Le principal avantage de cette technique est que les altérations du destin et de la maturation des précurseurs de l’interneurone peuvent être analysées après leur transfert adoptif dans un nouvel environnement cérébral.La démonstration visuelle des étapes de prélèvement et de greffe de cellules est essentielle car de petites erreurs dans la technique peuvent conduire à des expériences de transplantation inefficaces et infructueuses. Pour commencer, placez une lame de rasoir dans le lobe frontal antérieur d’un cerveau de chiot postnatal, et des lames de rasoir supplémentaires dans les fentes juste

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Neuroscience

Neurosciences

Source : Weber, R. Z., et al. Transplantation intracérébrale et suivi de la bioluminescence in vivo des cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau de la souris. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo démontre la transplantation stéréotaxique de cellules progénitrices neurales humaines (NPC) génétiquement modifiées dans le cerveau de la souris. Les chercheurs injectent des NPC exprimant la luciférase et des protéines fluorescentes, ce qui permet l’imagerie par bioluminescence in vivo et la...

Transplantation de cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau de souris

Cette vidéo présente une méthode pour générer des précurseurs d’interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Le protocole implique la culture des cellules souches dans des milieux contenant des inhibiteurs de petites molécules spécifiques, qui facilitent la prolifération et l’agrégation des cellules souches en corps embryoïdes (EB). Par la suite, les EB sont dissociés avec des enzymes et plaqués sur des puits de plaque de culture recouverts de protéines...

Génération de précurseurs d’interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Source : Quattrocolo, G., et al. Transplantation homochronique de précurseurs d’interneurones dans des cerveaux de souris postnatals précoces. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre la transplantation de cellules précurseurs d’interneurones dans le cerveau d’une souris néonatale en utilisant une approche homotopique ou hétérotopique. La procédure consiste à sécuriser un chiot receveur anesthésié, à identifier la région cérébrale cible et à injecter une suspension de cellules précurseurs...

Transplantation de cellules précurseurs d’interneurones dans le cerveau d’un bébé souris

Source : Gonzalez-Ramos, A., et. al., Transplantation de neurones GABAergiques dérivés de cellules souches humaines dans l’hippocampe de souris postnatal précoce pour atténuer les troubles neurodéveloppementaux. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique de cellules précurseurs d’interneurones dérivées de l’homme dans l’hippocampe d’un chiot souris génétiquement modifié avec des interneurones inhibiteurs réduits, dans le but de rétablir l’équilibre excitateur-inhibiteur.

Transplantation de cellules précurseurs d’interneurones d’origine humaine dans l’hippocampe d’un bébé souris

Source : Denaxa, M., el al., Transplantation de progéniteurs d’interneurones corticaux modifiés par chimiogénétique dans des cerveaux de souris postnatals précoces. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’injection d’un vecteur plasmidique porteur du gène d’intérêt dans les progéniteurs interneurones d’une tranche de cerveau embryonnaire, suivie d’une électroporation pour l’entrée du plasmide et l’expression génique. Ces progéniteurs modifiés peuvent ensuite être utilisés pour...

TRANSFERT DE GÈNES ASSISTÉ PAR ÉLECTROPORATION INCORPORÉ DANS L’AGAROSE DANS DES PROGÉNITEURS D’INTERNEURONES CORTICAUX DE SOURIS

Ce protocole décrit une méthode pour générer des progéniteurs interneurones corticaux et des interneurones post-mitotiques précurseurs de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide d’une méthode modifiée de corps-à-monocouche embryoïdes. Ces cellules souches/précurseurs peuvent être utilisés in vitro fluorescent triés et transplantés dans le néocortex néonatal pour l’étude de détermination de sort ou utilisés dans des applications thérapeutiques.

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Basée sur l'ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux, leur co-transplantation dans des cerveaux de type sauvage et l'évaluation morphométrique appariée des dérivés « test » et « contrôle », cette méthode permet une modélisation précise du contrôle des gènes in vivo du néocortical morphologie neuronale d'une manière simple et abordable.

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Ici nous présentons un protocole, conçu pour employer des outils chimiogénétiques pour manipuler l'activité des progéniteurs interneurons corticaux transplantés dans le cortex des souris postnatales tôt.

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La transplantation de neurones GABAergiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines générées par la programmation neuronale pourrait être une approche thérapeutique potentielle pour les troubles neurodéveloppementaux. Ce protocole décrit la génération et la transplantation de précurseurs neuronaux GABAergiques dérivés de cellules souches humaines dans le cerveau de souris néonatales, permettant l’étude à long terme des neurones greffés et l’évaluation de leur potentiel thérapeutique.

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Analyse mosaïque de fonction des gènes dans le développement de cerveau de souris à l&#39;aide postnatale à base de virus recombinaison Cre

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