Name: Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶカロレスピロメトリー法で細胞のエネルギー代謝を非侵襲的に解析する方法。酸素消費と熱産生を同時測定し、製薬開発におけるミトコンドリア毒性評価や治療計画に有用なデータを提供します。

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この仕事の一部メアリー é. Konkle とマイケル ・ a. Menze に国立科学財団助成金チェ 160944 によって資金を供給されました。

1. 細胞培養
<ol><li>ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、追加基板 (10 mM グルコース、グルタミン、2 mM と 1 mM ピルビン酸) を含む人間の肝細胞癌 (hepg2 細胞) 細胞を維持 (5 %co2、95% の空気、湿度 100%)。 注: は、DMEM が呼吸と熱量測定の後の手順で参照される上記 DMEM の定式化を使用します。</li>
	<li>1 x 106細胞をプレートあたりセル 100 mm の板を文化とサブカルチャーそれらすべて 7 日または 90% の confluency に達する前に、媒体ごとに 3-4 日を更新します。</li>
	<li>セルが 60-80% 合流実験を実行します。</li>
</ol>2. 呼吸度計、熱量計の準備
<ol><li>呼吸室に DMEM の 2.2 mL ピペットで移しなさい完全にストッパーを挿入、中に空気から最適な酸素の拡散を実現するストッパー スペーサー ツールで調整。</li>
	<li>(ブルー トレース) の酸素濃度、酸素流量 (赤のトレース) が安定するまで、37 ° C で継続的にかき混ぜます。実験で使用中の酸素溶解度を考慮して呼吸のソフトウェアをプログラムを確認します。 注: 別のメディアがある別の酸素溶解度係数 (例えば、DMEM 0.92 を =)。</li>
	<li>商工会議所を開き DMEM で酸素濃度の安定化は後、酸素濃度トレースの安定した部分を選択し、100% の空気飽和のためにそれを校正します。</li>
	<li>0% 酸素室で酸素がないとき酸素濃度トレースの安定した部分を選択するために校正します。20 μ L の滴定実験の終わりに生物学的サンプルですべての酸素が消費された後の 230 mM 亜ジチオン酸ナトリウムの後、この手順を実行します。</li>
	<li>100% の空気の呼吸度計のキャリブレーション後ストッパーを閉じ泡が商工会議所に存在しないことを確認します。 注: 酸素流量のわずかな増加として検出される密閉チャンバーのポーラロ グラフ法による酸素センサー (POS) の酸素分圧を測定するために酸素を消費します。</li>
	<li>閉じられているストッパーの ~ 10 分後安定した酸素流量を観察することによって呼吸度計を HepG2 細胞の準備ができているを確認します。 注: ここで使用される熱量計ステンレス アンプルを利用し、1 アンプルの参照として使用することが必要です。</li>
	<li>カロリメータの参照アンプルに 2.5 mL H2O (dH2O) の [サンプル (ステップ 4) と等しいボリューム] を追加し、必要に応じて、ペンチを使用してキャップを締めます。気流のある密封されたアンプルをきれいにし、熱量計の参照チャネルの 1 の位置にアンプルをゆっくりと下ろします。位置 1 まで生物的サンプルを用意しています。</li>
</ol>3. HepG2 細胞の呼吸と熱量測定のための準備
<ol><li>計、熱量計の準備し、校正を確認します。暖かい DMEM そして 37 の ° C の水浴中にトリプシン。</li>
	<li>新鮮な 100 mm プレートと CO2と温度の両方のための媒体の平衡を許可するインキュベーターで場所に DMEM を追加します。 注: 適切なボリュームに使用するアンプル数によって異なりますので、この媒体は熱量測定実験のため使用されます。</li>
	<li>セルは、60-80% 合流、その後洗って 100 mm プレート室温リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を 2 倍を倒立顕微鏡で確認します。</li>
	<li>細胞の 100 mm プレートを 37 ° C トリプシンの 3 mL を加えるし、細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 7-10 分間インキュベートします。37 ° C DMEM の 3 mL のトリプシンを中和し、5 mL のピペットを使い、優しく 〜 20 回ピペッティング システムそれによって中断します。</li>
	<li>滅菌 15 mL の円錐管に DMEM およびトリプシンの再懸濁細胞の 6 mL を転送し、175 x g に 5 分は細胞ペレットを乱すことがなく液体を削除、それを遠心分離します。</li>
	<li>〜 5 mL DMEM とセルを万全にそれが十分に互いから分離したピペットで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>十分に混合されたサンプルの ~ 100 μ L を削除し、セルの合計数を決定するための診断のすべての 8 のフィールドを利用した徹底的な細胞数を実行します。〜 50 μ L あたり 10 の6セル × 2 を生成するために、細胞の再懸濁のボリュームを計算します。 注: これは 2 × 106セルが最小限の中変位計の各商工会議所に追加されている保証されます。</li>
	<li>細胞を再懸濁します 175 x g. で 5 分間遠心分離機の DMEM ステップ 3.7 から計算される量のペレット。</li>
	<li>(これは 〜 50 μ L をする必要があります) 呼吸の商工会議所あたり 2 × 106細胞を注入するために必要なボリュームを決定するセル数を実行します。氷の準備ができるまで進入します。 測定用セルを格納します。</li>
	<li>濃縮細胞サンプルは、氷の上は、熱量測定の 1 x 10 の5セル/mL の濃度を生成するために必要な希釈を決定します。</li>
	<li>サンプルをよく混ぜ、それぞれアンプルの DMEM で 1 x 10 の5セル/mL で細胞の 〜 3 mL を準備します。 注: サンプル希釈用 DMEM は 3.3 の手順で調製した平衡の培地をする必要があります。</li>
</ol>4. 熱量測定
<ol><li>熱量計は、コンピューターに接続されている μ で熱量の信号が観察可能な安定したことを確認します。</li>
	<li>各アンプルに 1 x 105セル/ml (~2.5 x 105細胞) 細胞の 2.5 mL を追加、アンプルの蓋とガスの拡散を許可する媒体の間は十分な空気を確保します。</li>
	<li>すぐに必要に応じて、ペンチを使用して、キャップを締めます。密封されたアンプルは、空気の流れを使用して任意の外部の破片を削除するをきれいにし、熱量計の 1 の位置にアンプルをゆっくりと下ろします。アンプルは 1 の位置に下がる時間を記録します。</li>
	<li>15 分の 1 の位置に座っているアンプルを許可します。 注: この 15 分間は、細胞呼吸 (手順 5) に注入されるべきです。これにより、CR の比率が決定するときに、熱発生量と酸素消費量の時間の同じ間隔を使用します。</li>
	<li>位置 1 で 15 分後のリファレンスとサンプルの両方のアンプル 2 の位置までゆっくりと下ろします。時間、アンプルが引き下げられると、少なくとも 30 分のための測定を記録します。</li>
</ol>5. 呼吸
<ol><li>アンプルがカロリメータの位置 1 は 15 分間隔、中に進入します研究を開始します。</li>
	<li>同種のソリューションを確認し注入ピペッティングにより細胞サンプルを徹底的にミックス < ~ 106セル/室 × 2 の最終濃度計の各チャンバーに細胞サンプルを 50 μ l 添加します。呼吸度計に細胞を注入時間を記録します。</li>
	<li>HepG2 細胞を継続的に 37 ° C で攪拌注入後酸素流量と酸素濃度の安定した減少の両方安定化のため、少なくとも 20 〜 30 分を待ちます。</li>
	<li>画面の右上あたり V O2フラックスタブを選択し、酸素流量の安定した部分を強調表示。マーク、統計、および V 当たり O2フラックスのレコード データを選択します。この記録は、CR 率の計算に使用されます。 注: 5.5、5.6 の手順はオプションです。漏れの呼吸と最大の共役呼吸オリゴマイシンおよび FCCP の滴定によって明らかにされます。</li>
	<li>各チャンバーに 4 mg/mL オリゴマイシンの 1 μ L を注入でき 〜 酸素のフラックスの安定化のため 10 分。以下の手順でレコードの安定したリーク呼吸オリゴマイシン添加後酸素フラックス トレースの安定した部分を強調することによって 5.4 で実行されます。</li>
	<li>0.2 mM の FCCP 各商工会議所に各投与後酸素フラックス安定化を可能にする 2 μ L 注入を滴定しなさい。最大磁束に到達するまで、後続 FCCP 滴定のわずかな低下によって示されるように、滴定を続けます。最大磁束中安定した呼吸を記録します。</li>
</ol>6. Calorespirometric 比の計算
<ol><li>作製したサンプルの最後のセルの数を数えるため 〜 1 x 10 の5セル/mL アンプル (2.5 mL) に追加されるセルの合計数を決定するための診断のすべての 8 のフィールドを活用しました。</li>
	<li>熱量計法と安定した信号が同じ時間に存在する計から測定を記録する時間を決定します。アンプルは位置 2 と呼吸度計にセルの注入の時間に低下したときに記録された時間を参照します。</li>
	<li>ステップと μ/100万セルとして急行を決められた時点で尊敬のアンプルの熱出力を表示するトレースの上にカーソルを置くと、熱生産を記録します。酸素消費量データを収集し、pmol O2倍の 100万個 x s-1として表現されることを確認します。</li>
	<li>CR の比率を計算するために μ を kJ/秒に変換し、kJ/mol O2として表される CR 比を取得する O2/s の mol 以上 kJ/s を分割します。注: CR 率は kJ/mol O2で提示されます。 (<a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">補足のファイル 1</a>を参照してください)</li>
</ol>

<ol><li>Gnaiger, E., Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+in+aerobic+mammalian+cells%3A+information+from+the+ratio+of+calorimetric+heat+flux+and+respirometric+oxygen+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).</li>
<li>Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+the+specific+rate+of+catabolic+activity+%28Ac%29+from+the+heat+flow+rate+of+soil+microbial+reactions+measured+by+calorimetry%3A+significance+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biodiversity%22%5BJournal%5D)">Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications.</a> Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).</li>
<li>Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbicide+and+estrogen+effects+on+the+metabolic+activity+of+Elliptio+complanata+measured+by+calorespirometry%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Pharmacology%2C+Toxicology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).</li>
<li>Wadso, L., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorespirometry+of+terrestrial+organisms+and+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems.</a> Methods. 76, 11-19 (2015).</li>
<li>Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Strategies+for+Gas+Exchange+and+Metabolism%22">Strategies for Gas Exchange and Metabolism</a>. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).</li>
<li>Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071715003661">Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism.</a> Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).</li>
<li>Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+preconditioning+of+cells+with+AICAR-riboside%3A+improved+cryopreservation+and+cell-type+specific+impacts+on+energetics+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation.</a> Cryobiology. 61, 79-88 (2010).</li>
<li>Webb, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebb%2C+P+%22Human+Calorimetry%22">Human Calorimetry</a>. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).</li>
<li>Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+modified+atmospheres+on+diapausing+5th+instar+codling+moth+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism.</a> Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).</li>
<li>Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+application+of+tunable+diode+laser+absorption+spectroscopy+and+isothermal+micro-calorimetry+for+calorespirometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).</li>
<li>Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040603117300187">Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry.</a> Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).</li>
<li>Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+metabolic+heat+rate%2C+CO2+production%2C+and+O2+consumption+by+microcalorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).</li>
<li>Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/004060319080576K">Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues.</a> Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cellular+energetics+by+galactose+and+pioglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone.</a> Cell and Tissue Research. , (2017).</li>
<li>Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040603104003697">Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells.</a> Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).</li>
<li>Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcalorimetric+determination+of+energy+expenditure+due+to+active+sodium-potassium+transport+in+the+soleus+muscle+and+brown+adipose+tissue+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat.</a> The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).</li>
<li>Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+biochemical+energy+balance+during+an+isometric+tetanus+and+steady+state+recovery+in+frog+sartorius+at+0+degree+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C.</a> Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Kemp, R. B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/004060319080559H">Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells.</a> Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).</li>
<li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15286737">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).</li>
<li>Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+HepG2+cells+to+identify+direct+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death.</a> Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).</li>
<li>Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64, 985-993 (2004).</li>
<li>Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Thermochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

Calorespirometry の目的は、好気性と嫌気性代謝経路の貢献を定量的に評価し、細胞のエネルギー流束の複合ビューを取得することです。これは、熱放散と同等理論 oxycaloric の計算の CR 率の比較に続いて酸素流量の同時測定で。いくつかの重要なステップは、再現性のある信頼性の高いデータの考慮されなければなりません。滅菌、健康な細胞培養のメンテナンスが重要です。細菌や真菌による汚染流用熱生産や酸素消費量、CR 率の無意味なレンダリング可能性があります。さらに、不適切なセルをカウント、ミキシング、貧しい人々 のサンプルまたは周辺固定支持細胞は、不正確な CR 率にも 。呼吸度計に関しての重要なステップは適切な試料注入はボリュームに 50 μ L 以下です。このボリュームは、商工会議所から中の最小限の量を転置し、酸素消費量が 2 x 10 の6セルに正しく帰属を保証します。日常の呼吸を観察すると、一度提案プロトコルは 2 つ追加滴定 (オリゴマイシンおよび FCCP) リーク呼吸とミトコンドリアの ETS 容量を照らすと互換性が。このアプリケーションは、FCCP の過剰な添加を呼吸を阻害し、最大磁束; を...

生物学的システム、代謝時に熱リリースまたはエンタルピーの変更は通常直接どちらかを監視 (を介して直接熱量測定) または間接的 O2消費量や CO2の生産 (呼吸) を経由。残念ながら、単独でこれらのテクニックを使用すると、重要な情報が失われます、嫌気性細胞の代謝経路の貢献など。Calorespirometry は、放熱と呼吸の両方の同時測定に依存する強力な手法です。完全に酸素の哺乳類細胞の嫌気性代謝を検討した calorespirometric 仕事を開拓し、にもかかわらず中トランス ホーム細胞のエネルギー恒常性する好気性と嫌気性経路の同時の貢献を実証します。完全に酸素環境1。Calorespirometry は、さまざまな生物学的質問にから適用されています。いくつかの例は、低酸素レベルで動物のエネルギー論の研究、二枚貝、地上の生物の代謝と有機質土壌物質2,の微生物分解のえらに及ぼす除草剤とエストロゲンの両方3,4,5,6。 さらに、calorespirometry は7細胞の哺乳類の凍結凍結する前に明らかにしたどのように代謝前処理向上。それぞれのアプローチは、熱量測定および呼吸、細胞と個体の生体エネルギーの私達の知識は個別に増加しました。ただし、calorespirometry を使用して答えることができる基本的な生物学的質問比較的未踏のままです。
ヘスの法則の反作用の合計エンタルピー変化は初期と最終状態の間の経路に依存しません。たとえば、生化学的経路の合計エンタルピー変更は、経路内のすべての反作用のエンタルピーの変更の合計です。熱量測定は、無差別に好気性と嫌気性の両方の経路を検出する細胞熱生産を測定するためのリアルタイムのアプローチを提供しています。これは実験アンプル8の壁を通ってを除く、システムでエネルギーは交換されません基盤に基づいています。放熱の変更は、アンプルのすべての代謝反応からリリース エンタルピーの変更と同じです。したがって、負のエンタルピーは、システムからの熱の損失に関連します。過去 4 年間の徹底的な研究は、異化と同化の熱力学的景観を特徴としています。これは、検索用語「生物」と「熱量」インデックスによってアメリカ合衆国国立図書館の医学 (NLM) 健康の国民の協会 (PubMed) で研究の記事の安定した上昇によって表されます。検索は合計 27 の文書参照の生物学的熱量測定; 1970 年前にことを明らかに一方、単独で 2016 年 546 出版物利用技術です。
熱量測定法は、熱生産を決定する確立されています。ただし、進入します。 値を解決するためより多くの柔軟性が与えられます。進入します。 測定は、O2CO2、または O2と CO2の両方で構成できます。さらに、O2 ・ CO2測定は optrodes、クラーク型電極、波長可変半導体レーザー吸収分光法7,9,10 など、様々 な手法で行うことができます。、11。CO2の生産は多くの進入します研究に貴重な指標が、培養細胞用培地はしばしば pH コントロール12,13炭酸水バッファー システムを利用しています。重炭酸塩システムの CO2測定の合併症を避けるためには、培養細胞の calorespirometry の次のプロトコルは、唯一の進入しますパラメーターとして O2を利用しています。
酸素のフラックスの測定と並行して、特定の respirometers (材料の表を参照してください) は、ミトコンドリア機能の詳細な評価のため設計されています。基板-ランプ-阻害剤-滴定 (スーツ) プロトコルは、よく確立されるおよび膜の潜在的な反応酸素種 (ROS) の形成14を測定するために設計された実験と互換性が。そのままなセルの calorespirometry の提案するプロトコルは、化学的脱共役カルボニル シアン化物-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) と F0F1-ATP 合成酵素阻害剤オリゴマイシンなどの導入と互換性が。FCCP 添加して酸素消費量が、ミトコンドリアの性能15の潜在的な治療の影響を評価するために有用である ATP を生産から結合することができます。さらに、オリゴマイシン添加漏れ呼吸の程度が点灯します。したがって、calorespirometry の中に実行される進入します。 測定がさらにミトコンドリアの生理機能を解明するために広範なプロトコルと互換性があります。
放熱の酸素流量同時測定 calorespirometric (CR) 比の計算が可能です。この比率は、ソーントンの定数または細胞または興味の組織によって-480 kJ mol-1 -430 と補われた炭素基板1,間の範囲と同等理論 oxycaloric と比較して16. したがってより否定的な CR の比率は、全体的な代謝活動に嫌気代謝経路から増加した貢献を明らかにします。たとえば、仕事の積極的なパフォーマンスなしルーチン筋肉組織呼吸の CR 率は-448 から-468 の理論 oxycaloric 等価17,18の範囲内にある kJ mol-1 範囲します。一方、哺乳類の癌細胞は高いブドウ糖の培地で培養した解糖系に続く強化の乳酸発酵を表示、ミトコンドリア婚約19が比較的低い。-800 kJ mol-1、嫌気性より否定的な CR 比1,7、によって示されると細胞の代謝経路の高まりの関与を示す-490 の CR 率の範囲内でこの表現型の結果 16,20。
両方の商業および非営利の細胞・組織の代理店現在ほぼ 4,000 細胞 150 種以上提供細胞は、人間から派生しました。不死化細胞株は、すぐに多くの直接または間接的を妨げるミトコンドリア機能の潜在的な治療の毒性を評価するための便利なツールです。薬剤のスクリーニング中に変換されたセルを使用して可能性があります限られた予測値の一部に Warburg 効果、多くの癌の特徴のため。多くの場合、癌は基質レベルのリン酸化から ATP を生成し、完全好気性条件19の下でミトコンドリアを雇わないで乳酸の産生を介して酸化還元バランスを維持します。医薬品開発は、悪名高い高価、非能率的で 9 化合物市場承認21を達成するために失敗した人間の臨床試験で検証中約 8 です。潜在的な治療は、細胞株の低毒性のための最初のスクリーニングを渡すことも、これらの化合物のいくつかが mitotoxic であることは可能です。これらの毒素が Warburg 効果を表示しない一次電池のエネルギー ・ バランスを損なうことができる方法を検出するための適切なメソッドがない重要な情報は過剰に見て、初期の段階で治療開発のボトルネックします。
Calorespirometry は、さまざまな細胞や組織を含む生体試料などの代謝活動を分析する実用的な非侵襲的アプローチです。提案するプロトコルのコアは、アプリケーションの範囲との互換性です。ただし、1 つの合併症が確認されています。不死化細胞は、潜在的な mitotoxins22、細胞を感作するために酸化的リン酸化 (OXPHOS) エネルギー生産のための貢献度を高めてガラクトースと補われるブドウ糖自由の培地中で培養頻繁 23。この代謝リプログラミングが熱量計15で使用されるステンレス製アンプルに配置するサンプル分析を不明瞭に表示されます。グルコース培地で培養された細胞は、いくつかの時間の高い代謝活性に従事し続けてください。一方、ガラクトース培地で培養された細胞は、測定実験早くポイントに制限を行う、アンプル内の配置の 30 分以内熱生産を減少させます。この現象は、残念ながら、彼らの細胞増殖を評価する機会を妨げています。この特定の制限にもかかわらず calorespirometric 解析と互換性のあるほとんどのアプリケーション、これにより代謝の詳細情報を取得できます。

<table><tbody><tr><td>HepG2細胞</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>HB-8065</td><td>熱量測定に使用される細胞</td></tr><tr><td>O2k-呼吸器計</td><td>オロボロス機器</td><td>10022-02</td><td>呼吸器</td></tr><tr><td>LKB 2277 熱活動モニター (TAM)</td><td>サーモメトリック AB</td><td></td><td>サーモメトリックはTAインスツルメンツが購入しました</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>11360070</td><td>100倍溶液をDMEM培地に添加</td></tr>した<tr><td>ウシ胎児血清 - Premiuim Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>を 10% に添加した DMEM 培地</td></tr><tr><td>Trypsn-EDTA (0.25%)</td> <td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td>細胞解離試薬</td></tr><tr><td>オリゴマイシン from Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>O4876</td><td>ミトコンドリア阻害剤</td></tr><tr><td>シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C2920</td><td>ミトコンドリアアンカプラー</td></tr><tr><td>コーニング 100 mm TC処理培養皿</td><td>コーニングコーポレーション</td><td>430167</td><td>組織培養皿</td></tr><tr><td>グルコース、粉末</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>15023021</td><td>DMEM用グルコース 中</td></tr>ガ<tr><td>ラクトース、粉末</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP656500</td><td>DMEM培地用ガラクトース</td></tr><tr><td>L-グルタミン(200 mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030081</td><td>グルタミン DMEM用グルタミン</td></tr><tr><td>DMEM、グルコースなし</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11966025</td><td>細胞培養培地</td></tr></tbody></table>

calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

基本的な生物学的および生物医学研究で使用される多くの細胞は、好気性と嫌気性の呼吸の組み合わせによりエネルギー恒常性を維持します。ただし、両方の経路が細胞のエネルギー生産の景観に貢献する範囲は一貫して見落とさ。変換で培養された細胞のブドウ糖のレベルをしばしば飽和は、酸化的リン酸化基質レベルのリン酸化の増加によって償われる ATP の生産のために減少の依存関係を表示します。代謝の身のこなし、このシフトでは、細胞はミトコンドリア毒素の存在にもかかわらず増殖することができます。以来トランス ホーム細胞の変えられた代謝身のこなしを無視して、医薬品のスクリーニングの結果が誤って、潜在的 mitotoxic の効果が検出されないモデル高グルコースの存在下で培養のセルラインを使用して濃度。このプロトコルでは、呼吸と熱量測定、細胞 ATP を生産する好気性と嫌気性の貢献の量的で、非侵襲的評価を可能にする 2 つの強力な手法の組み合わせについて説明します。好気性と嫌気性の呼吸熱監視を介して熱量測定をすることができますを生成します。一方、酸素消費率を測定は、好気呼吸の程度を評価できます。放熱と酸素消費量の両方を同時に測定、calorespirometric 比が決定できます。理論 oxycaloric 相当に得られた実測値を比較し、ことができ、嫌気性の呼吸の程度を判断できます。したがって、calorespirometry は、医薬品開発、微生物の増殖、平地と低酸素の条件の下で基本的な生体エネルギーなど生物の質問の広い範囲を分析するユニークな方法を提供します。

Calorespirometric 測定値の再現性は、適切かつ一貫性のある試料に依存します。培養細胞から調製したサンプル使用しないでくださいプレートが大きくなり過ぎた場合細胞数は凝集のため不正確になることができます。さらに、限られた基板周辺固定支持の細胞の拡散による熱フローが発生する可能性があります。したがって、付着性のセルを使用する場合は、60-80% の confluency にプレートを選択して媒体の実験の前に 24 時間を変更する重要です。
適切な機器の校正とメンテナンスは、有益であり、再現性のある calorespirometric の測定のために重大。に従って、製造元の確立工場の洗浄のプロトコル、エタノールと広範な洗浄残留疎水性脱共役剤と阻害剤が削除され。、測定値を部分的に妥協しないように実装されます。抑制または連結を解くミトコンドリア。計室が試料測定前に動作しているとき酸素濃度と酸素フラックス トレースは図 1に示すように、安定したする必要があります。POS は、センサーの修理が必要な場合、<strong c...

このプロトコルでは、calorespirometry、放熱の呼吸、エネルギー代謝を評価するために非侵襲的アプローチを提供する直接・同時測定をについて説明します。この手法は、総細胞エネルギーの流れを監視することによって好気性と嫌気性経路エネルギー利用への貢献を評価するために使用されます。

Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

この手順の全体的な目標は、生物学的サンプルの代謝活性を分析し、嫌気性経路がサンプル内の細胞エネルギー生産にどの程度寄与しているかを判断することです。この方法は、医薬品開発におけるミトコンドリア毒性の程度に関する製薬分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、目的の細胞サンプルの酸素消費量と熱生成の同時測定を容易にすることです。したがって、この方法は、医薬品開発中の治療計画に関する洞察を提供します。また、凍結保存に対する代謝プレコンディショニングの影響を評価できるcyrobiologyなどの他の分野にも適用できます。呼吸計を準備するには、まず各呼吸計チャンバーに2点2ミリリットルのDMEMを追加し、ストッパーを完全に挿入します。ストッパースペーサーツールでストッパーを調整して、媒体への酸素拡散を最適化し、酸素濃度と酸素フラックスが安定するまで、750rpm、37°Cでサンプルを連続的に攪拌するようにチャンバーを設定します。呼吸計ソフトウェアが、実験で使用した培地の酸素溶解度を考慮するようにプログラムされていることを確認します。次に、酸素濃度トレースの安定した部分を選択し、この部分を100%の空気飽和度に校正します。次に、チャンバー内に気泡が存在しないように注意しながら、ストッパーを閉じます。約10分後、安定した酸素流束が観察されるはずです。熱量測定の準備をするには、まず2点5ミリリットルの脱イオン水を基準アンプルに加え、次にキャップを締めます。エアポンプを使用して、アンプルから外部の破片を取り除き、アンプルをゆっくりと下げて、熱量計の基準チャネルにアンプルを配置します。アンプルは、細胞サンプルを含むアンプルが調製されるまで、位置1に留まります。熱量測定に使用されるDMEMは、加湿雰囲気と5%CO2の摂氏37度のインキュベーターで平衡化する必要があります。実験を開始するには、使用する熱量計アンプルごとに100ミリリットルのプレートに3ミリリットルのDMEMを加え、サンプルが熱量測定の準備ができるまでプレートをインキュベーターに置きます。培地が平衡化している間に、倒立顕微鏡を使用して、60〜80%のコンフルエントで均一に分布しているHepG2細胞を含むプレートを選択します。まず、細胞培養培地を取り出し、10ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。3ミリリットルの予熱したトリプシンを摂氏37度で加え、プレートを摂氏37度でインキュベートします。7〜10分間のインキュベーション後、3ミリリットルの摂氏37度DMEMで酵素反応を中和し、5ミリリットルのピペットを使用して細胞を穏やかに解離して単一細胞懸濁液にします。細胞を滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移して遠心分離し、パレットを約5ミリリットルの新鮮なDMEMに再懸濁します。細胞を徹底的にピペットで動かして細胞クラスターを分解し、カウントした後、細胞を培地50マイクロリットルあたり約200万個の細胞に濃縮します。この分析法の再現性は、一貫性と精度のある細胞数に依存します。サンプルが均質であり、分析中のどの時点でも細胞が凝集していないことを確認することが重要です。次に、呼吸測定および熱量測定を行う準備ができるまで、細胞を氷上に保存します。熱量測定の前に、熱量計がコンピューターに接続されていること、および熱量測定信号が安定しており、マイクロワットであることを確認してください。サンプル調製前にインキュベーターに入れた平衡培地で細胞を1ミリリットルあたり100, 000細胞に希釈します。次に、各アンプルに2.5ミリリットルの細胞溶液を加え、アンプルの蓋と培地との間にガス拡散を可能にするのに十分な量の空気が維持されていることを確認します。すぐにキャップを締め、密封されたアンプルを空気で洗浄して、外部の破片を取り除きます。次に、細胞サンプルと一緒に密封されたアンプルをゆっくりと下げて、熱量計の1つを配置します。サンプルを十分に混合して均質な溶液を確保し、連続攪拌下で呼吸器計の各密閉チャンバーに200万個の細胞を注入します。熱量計の1番の位置で15分後、基準アンプルと細胞のあるアンプルの両方をゆっくりと下げて位置2にし、下げた時間を記録します。細胞を呼吸計に注入してから10〜15分後には、酸素フラックスの安定化と酸素濃度の着実な減少が観察されます。リーク呼吸を決定するには、各チャンバーに1マイクロリットルあたり4ミリグラムのオリゴマイシンを注入し、酸素フラックスが約10分間安定するまで待って、先ほど示したように安定したリーク呼吸数を記録します。次に、最大フラックスを決定するために、2マイクロリットルのゼロポイント2ミリモルFCCPをチャンバーに注入し、各注入後に酸素フラックスが安定するようにし、最大フラックスに達するまで滴定を続けます。最大フラックス中の安定した呼吸数を記録します。サンプル測定前にレスプロメーターチャンバーが作動している場合、酸素濃度と酸素フラックストレースの両方が安定している必要があります。アンプルを位置2まで下げた後、熱出力が安定している時間を特定し、酸素フラックスが安定している対応する時間を特定して、熱量スピロメトリック比を計算できます。HepG2細胞をグルコース非存在下で培養し、ガラクトースを補充してミトコンドリアの関与を増加させると、細胞は熱量計内で増殖せず、アンプル内で約30分後に代謝活性が低下するため、熱量測定の計算は熱放散が測定された最も早い時点に制限されます。酸素フラックスが安定し、酸素濃度が着実に低下するまでに約15分かかるため、熱産生と酸素消費量の測定値が同じ時点で収集されるように、細胞がアンプルにピペットで移された時間を記録することが重要です。細胞の安定化された酸素フラックスは、熱量スピロメトリック比を計算する際の酸素消費量の代用として機能するため、追加の滴定を実行してリーク呼吸を評価することができます。これは、酸素フラックスの低下と最大非結合呼吸によって示され、連続したFCCP滴定で呼吸が増加しないことによって示されます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4時間未満で完了できます。この手順を試みる際には、他の細胞株が異なる代謝特性を持っている可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、新しい各細胞株は、熱量測定と呼吸測定の両方に対して最適化する必要があります。このビデオを見れば、HepG2細胞の熱量測定用試料作製方法、正しい機器キャリブレーション、および熱量測定実験の適切な実施方法について十分に理解できるはずです。

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Bioengineering

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