Name: Un test Flow Cytometry pour mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial dans les Myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Apprenez à mesurer le potentiel de membrane mitochondriale dans les myocytes cardiaques humains après hypoxie/réoxygénation par cytométrie en flux avec colorant JC-1. Cette méthode évalue efficacement les effets protecteurs des agents.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été financée par des subventions de The National Key Research and Development Programme of China (no 2017YFC1700503), le Programme National de la recherche fondamentale (973 Program) de la Chine (No.2012CB518602), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81370223 et no 81573957) et novateurs Research Foundation du troisième cycle of Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).

1. préparation des réactifs et des Solutions
<ol><li>Préparer les myocytes cardiaques humaines (ces mesures) milieu complet en ajoutant 25 mL de mélange de supplément de milieu de culture des myocytes dans 500 mL de milieu de culture des myocytes selon les instructions du fabricant. Conserver à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant d’utiliser.</li>
	<li>Préparer la Solution de Tongxinluo (TXL) en dissolvant la poudre ultrafine TXL en milieu sans sérum/glucose de Dulbecco aigle modifié (DMEM) et ajuster la concentration de TXL à 400 µg/mL en ajoutant DMEM (pour plus de détails, voir11). Conserver à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant d’utiliser.</li>
	<li>Préparer 5 mL de solution de travail JC-1 en ajoutant 25 µL de la solution mère (200 x) JC-1, 4 mL d’eau ultrapure et 1 mL de stock tampon (5 x) une coloration dans un tube à centrifuger 15 mL dans l’obscurité. Pipeter le mélange monter et descendre plusieurs fois et chauffé à 37 ° C avant d’utiliser.</li>
	<li>Préparer 30 mL de tampon de coloration de travail en ajoutant 24 mL d’eau ultrapure à 6 mL de stock tampon (x 5) dans un tube à centrifuger 50 mL de coloration. Utilisez cette solution glacée.</li>
</ol>2. création du modèle de l’hypoxie/réoxygénation
<ol><li>Plaque de 1,0 x 105 cellules par puits avec milieu complet HCM dans une plaque 6 puits. Se développer pour atteindre une confluence d’environ 70 % dans un incubateur à cellules contenant 5 % CO2 et 95 % air à 37 ° C.</li>
	<li>Ces mesures se laver avec une solution saline de tampon phosphate (PBS). Les exposer aux différents traitements (400 µg/mL TXL ou non) dans 2 mL de sérum/sans glucose DMEM pendant 30 min avant l’hypoxie dans un incubateur à cellules contenant 5 % CO2 et 95 % air à 37 ° C.</li>
	<li>Incuber ces mesures dans un bocal hermétique et hypoxique (2,5 L) équipé d’un catalyseur pour piéger l’oxygène libre et entraîner une hypoxie pendant 18 h (Figure 1 a) et un indicateur anaérobie pour mesurer la tension en oxygène dans la moyenne de11,12, 13, dans un incubateur à cellules contenant 5 % CO2 et 95 % air à 37 ° C. Remarque : Il faut environ 1,5 h pour le catalyseur piéger l’oxygène libre dans le bocal. Par conséquent, les HCMs sont conservés dans le bocal pour 19,5 h avant l’ouverture de la jarre. La couleur de l’indicateur anaérobie passe du bleu clair en environnement normoxique au blanc pâle en état hypoxique (Figure 1 b).</li>
	<li>Reoxygenate ces mesures par le déplacement de la plaque 6 puits dans un incubateur à 37 ° C, contenant 5 % CO2 et 95 % air pendant 2 h.</li>
</ol>3. la préparation de ces mesures pour la cytométrie en flux
<ol><li>Réchauffer la solution d’acide (EDTA) 0,25 % trypsine-tétraacétique et PBS à 37 ° C.</li>
	<li>Aspirer la moyenne de chaque puits, rincer les cellules avec 1 mL de PBS et ajouter 0,5 mL de 0,25 % de trypsine le long de la paroi du puits.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que toutes ces mesures sont presque détachés (environ 1 min).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu complet DMEM (milieu DMEM avec 10 % sérum de veau fœtal) dans les puits pour neutraliser la trypsine. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger 15 mL et ces mesures de granule par centrifugation à 500 g pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Soigneusement aspirer le surnageant sans déranger le culot.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de milieu complet de HCM et 0,5 mL de solution de travail JC-1 dans chaque tube. Resuspendre les HCMs par pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Couvrir les tubes ensemble avec du papier aluminium pour éviter le blanchiment de l’indicateur fluorescent et incuber ces mesures dans des conditions normales (à 37 ° C, contenant 5 % CO2 et 95 % d’air) pendant 20 min.</li>
	<li>Ces mesures de culot de centrifugation à 500 g pendant 3 min à 4 ° C.</li>
	<li>Rincer ces mesures deux fois avec 2 mL de glacee JC-1 tampon coloration.</li>
	<li>Remettre la suspension de ces mesures dans un volume final de 300 µL de tampon de coloration glacé dans le tube à essais (12 mm x 75 mm) et utilisent les cellules pour l’analyse dans les 30 minutes. Remarque : Utilisez le carbonyl cyanide m-Chlorophényl hydrazone (CCCP), un puissant inhibiteur de la chaîne de transport d’électrons respiratoire, pour traiter de ces mesures pendant 1 h à une concentration de 20 µM, pour le contrôle positif.</li>
</ol>4. installation de cytomètre en flux
<ol><li>Commencer le cytomètre en flux et s’assurer que le logiciel est connecté.</li>
	<li>Exécutez fluidique démarrage, démarrer le flux de données et mettre en place le breakoff.</li>
	<li>Ouvrez deux fenêtres de parcelle de dot dans le logiciel de cytométrie de flux.<ol>
<li>Avant de sélectionner dispersés lumière (FSC) sur l’axe des X et lumière (SSC) dispersés sur l’axe des Y dans la première parcelle de dot pour représenter les caractéristiques des cellules en fonction de leur taille et leur granularité, respectivement.</li>
		<li>Sélectionnez le canal PE de détection (575 ± 26 nm) pour l’axe des Y et la FITC (530 ± 30 nm) pour l’axe X à l’aide d’une échelle logarithmique dans la deuxième parcelle de dot, qui sert à mesurer l’intensité de la fluorescence du colorant JC-1 dans les cellules.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. écoulement Cytometry mesure et analyse des données
<ol><li>Cliquez sur décharger pour laisser les bras de support sur le tube et positionner le vide (ces mesures qui n’ont pas été teints avec JC-1) échantillon tube là-dessus. Cliquez sur Load pour le bras de support de tube de retour à son poste de travail.</li>
	<li>Cliquez sur enregistrement pour recueillir des particules de suspension dans le tube à essais vide et puis porte la population de cellules (P1) pour une analyse ultérieure dans la première parcelle de dot (Figure 3).</li>
	<li>Ces mesures s’accumuler dans les autres tubes échantillon et optimiser la mesure en réglant les tensions des canaux fluorescence, pour s’assurer que le point de la cellule se trouve dans la zone centrale de la deuxième parcelle de dot.</li>
	<li>Afficher les statistiques de chaque tube d’échantillon et calculer les peines minimales obligatoires de chaque échantillon en divisant le ratio d’intensité de fluorescence rouge par celle de l’intensité de la fluorescence verte.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1606915">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%3A+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li>
<li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li>
<li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li>
<li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+cardioprotection%3A+signal+transduction+in+ischemic+pre-%2C+post-%2C+and+remote+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li>
<li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li>
<li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Cossarizza, A., Salvioli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+using+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).</li>
<li>Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JC-1%2C+but+not+DiOC6%283%29+or+rhodamine+123%2C+is+a+reliable+fluorescent+probe+to+assess+delta+psi+changes+in+intact+cells%3A+implications+for+studies+on+mitochondrial+functionality+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis.</a> FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).</li>
<li>Chen, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia%2Freperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1%2Fp-p70s6k1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK%2FERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia%2Freoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.prot065490.short">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li>
<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).</li>
<li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+%28mPTP%29+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li>
<li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K%2B+channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li>
<li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li>
<li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).</li>
<li>Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Liver+Mitochondria+Isolation%2C+Size+Fractionation%2C+and+Real-time+MOMP+Measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement.</a> Bio-Protocols. 6 (15), (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons un protocole qui utilise JC-1 colorant pour évaluer la MMP des cellules après avoir été exposés à H/R. détecté par JC-1 dosage, le PSM de cellules est indépendant des facteurs comme la taille mitochondriale, forme et densité qui peut-être influencer la fluorescence mono-composant signaux de14. Par conséquent, les résultats du test de JC-1 sont relativement fiables. En outre, il est pratique et gain de temps pour effectuer le test de JC-1. Ce test a une faible exigence pour mat...

Maladie coronarienne est la principale cause de décès dans le monde. Le traitement de choix pour réduire une lésion ischémique et de limiter la taille de l’infarctus chez les patients avec segment ST élevé l’infarctus du myocarde est une reperfusion myocardique en temps opportun et efficace via une intervention coronarienne percutanée primaire (PCI)1, 2. Toutefois, la reperfusion provoque des dégâts supplémentaires, ce qui peuvent représenter jusqu'à 30 pour cent de la taille finale infarctus3. Il est universellement reconnu que le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) n’est pas seulement central dans les mitochondries des dommages et la mort cellulaire durant l’ischémie/reperfusion (I / R), mais est aussi une cible convergente de cardioprotecteurs signalisation4 , 5. comme l’ouverture du mPTP entraînerait une dépolarisation de la membrane mitochondriale interne potentielle (MMP)4, nous avons détecté des PFMP ouverture utilisant le 5, 5′, 6, 6′-tétrachloro-1, 1′, 3, test de tétraéthyle-3′-imidacarbocyanineiodide (JC-1).
L’analyse de JC-1 est une méthode de cytofluorométrique qui est tant qualitatives que quantitatives, et elle a été validée plus loin en analysant les MMP au niveau d’une mitochondrie unique6. JC-1 existe sous une forme agrégée, ce qui donne un rouge aux émissions couleur orange (590 ± 17,5 nm) dans la matrice des mitochondries avec MMP normale ; avec la perte de MMP, JC-1 est converti en la forme monomère qui donne une fluorescence verte avec une émission de 530 nm ± 15. Par conséquent, une diminution du ratio d’intensité de fluorescence rouge/vert pourrait indiquer la réduction de MMP dans des conditions telles que l’ischémie/reperfusion (I / R).
En plus de JC-1, MMP a également été étudié avec membrane perméable cations lipophiles comme la Rhodamine 123 et 3, l’iodure de 3′-dihexyloxadicarbocyanine [DiOC6(3)]. Toutefois, par rapport à ces deux sondes, JC-1 est plus fiable pour l’analyse des MMP. La rhodamine 123 a une sensibilité relativement médiocre (surtout en trempe mode7,,8) et la spécificité médiocre. Le changement dans la rhodamine 123 est parfois si petit qu’il est difficile pour les chercheurs ou les équipements à observer/détecter. En outre, dans une seule cellule, il existe des sites de liaison différents mitochondrie pour la rhodamine 123 et donc qu’elle peut avoir différentes fluorescence émissions9. DiOC6(3) n’est pas recommandé pour la détection des MMP soit comme il réagit sensiblement à la dépolarisation de la membrane plasmique10.
Donc, ici, nous utilisons le test JC-1 pour évaluer la MMP de ces mesures après avoir été exposés à une hypoxie/réoxygénation avec ou sans agent de protection.

<table><tbody><tr><td>Kit de dosage du potentiel de la membrane mitochondriale avec JC-1</td><td>Beyodtime, Chine</td><td>C2006</td><td>Dans le kit, il y a une solution mère JC-1 (200&fois ;), un tampon de coloration mère (5&fois ;) et CCCP (10mM)</td></tr><tr><td>Tongxinluo poudre ultrafine</td><td>Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Chine</td><td>071201</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI Kit</td><td>Becton-Dickinson, États-Unis</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, États-Unis</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte cardiaque humain</td><td>Promocell, Allemagne</td><td>C-12810</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des myocytes (SupplementMix)</td><td>Promocell, Allemagne</td><td>C-39275</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des myocytes (prêt à l’emploi)</td><td>Promocell, Allemagne</td><td>C-22070</td><td>utilisé avec le milieu de croissance des myocytes SupplementMix</td></tr><tr><td>GENbox</td><td>BioM&eacute ; rieux, Marcy l' Etoile, France</td><td>96127</td><td>2.5L</td></tr><tr><td>Catalyseur (AnaeroPack)</td><td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL&nbsp ; COMPANY, INC., Japon</td><td>&nbsp ; C-1</td><td></td></tr><tr><td>Indicateur anaérobie</td><td>BioM&eacute ; rieux, Marcy l' Etoile, France</td><td>96118</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre</td><td>en flux Becton-Dickinson, États-Unis</td><td>FACSAria 2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>Becton-Dickinson, États-Unis</td><td></td><td>Version8.0.1</td></tr><tr><td>Tube d’échantillonnage</td><td>Corning science, États-Unis</td><td>352054</td><td>12*75mm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone, États-Unis</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

un test flow cytometry pour mesurer le potentiel de membrane mitochondrial dans les myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Méthode rapide et efficace de reperfusion de l’artère coronaire obstruée, c’est la meilleure stratégie pour diminuer la taille de l’infarctus du myocarde chez les patients avec un segment ST élevée d’infarctus du myocarde. Toutefois, reperfusion en soi peut entraîner en outre du cardiomyocyte, un phénomène appelé lésion de reperfusion. L’ouverture de la pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP), avec la diminution du potentiel membranaire mitochondrial (MMP), ou la dépolarisation mitochondriale, est universellement reconnue comme la dernière étape de la lésion de reperfusion et est responsable mitochondriale et du cardiomyocyte. JC-1 est un colorant cationique lipophile qui s’accumule dans les mitochondries selon la valeur de MMP. Plus le PSM est, plus JC-1 s’accumule dans les mitochondries. Les quantités croissantes de JC-1 dans les mitochondries peuvent se traduire par un changement de d’émission de fluorescence du vert (~ 530 nm) au rouge (~ 590 nm). Par conséquent, la réduction du ratio d’intensité de la fluorescence rouge/vert peut indiquer la dépolarisation des mitochondries. Ici, nous prenons le parti de JC-1 pour mesurer les MMP, ou l’ouverture du mPTP dans les myocytes cardiaques humaines après l’hypoxie/réoxygénation, détectée par cytométrie en flux.

Avant d’effectuer le test de JC-1 afin d’évaluer les changements de MMP, il est fortement recommandé que des expériences effectués pour confirmer les conditions correctement définie par les chercheurs. Comme le montrent les résultats de la cytométrie en flux (Figure 2), comparées au groupe normal, hypoxie/réoxygénation (H/R) induit significativement l’apoptose de ces mesures (annexine V + /PI±), indiquant que nous avions établi un modèle cellulaire d’I / R (±...

Nous présentons ici un protocole qui utilise JC-1 colorant pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale des cellules après avoir été exposés à une hypoxie/réoxygénation avec ou sans agent de protection.

Un test Flow Cytometry pour mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial dans les Myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Cette méthode peut aider à mesurer l’effet de l’hypoxie/réoxygénation sur les cellules dans le potentiel de la membrane mitochondriale, et elle peut être utilisée pour évaluer si un agent protège contre une blessure. Le principal avantage de ce test est que la MMP détectée par celui-ci est en cas de facteurs tels que la taille mitochondriale. De plus, il a un faible besoin en matériaux et en rayonnement.Commencez avec 70 % de myocytes cardiaques humains confluents dans une plaque à six puits. Après avoir lavé les cellules avec une solution saline tampon phosphate, ajoutez le médicament ou le véhicule dans deux millilitres de sérum et de DMEM sans glucose. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire contenant 5 % de CO2 et 95 % d’air à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant l’hypoxie.Après 30 minutes, placez la boîte de myocytes cardiaques humains dans un bocal anhypoxique hermétique de 2,5 litres. Équipé d’un catalyseur pour récupérer l’oxygène libre et d’un indicateur anaérobie pour mesurer la tension de l’oxygène dans le milieu. Placez le bocal dans l’incubateur de culture tissulaire.La couleur de l’indicateur anaérobie passe du bleu clair dans un environnement normoxiqu

a-flow-cytometry-based-assay-for-measuring-mitochondrial-membrane

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Préparation des fibres perméabilisées saponine en conjonction avec l'analyse de phosphorylation oxydative respirométriques fournit une évaluation intégrative de la fonction mitochondriale. Respiration mitochondriale dans les états physiologiques et pathologiques peuvent refléter diverses influences réglementaires, y compris les interactions des mitochondries, la morphologie et la biochimie.

Respirométriques évaluation phosphorylation oxydative dans la saponine perméabilisées fibres cardiaques

Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l'ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries...

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

Cette vidéo démontre le marquage des cellules neuronales avec des anticorps pour les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale, la protéine associée à l’ADN mitochondrial et la protéine de la membrane externe mitochondriale, suivi d’une cytométrie en flux pour quantifier leurs niveaux.

Mesure de plusieurs paramètres mitochondriaux dans les neurones à l’aide de la cytométrie en flux

Décrit ici est un procédé pour détecter et quantifier les protéines de la membrane externe des mitochondries par immunomarquage des mitochondries isolées à partir de tissus et l'analyse par cytométrie en flux rongeur. Cette méthode peut être étendue à évaluer les aspects fonctionnels des sous-populations mitochondriales.

Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Le but du présent protocole est d’illustrer l’utilisation de souris néonatales cardiomyocytes comme système modèle pour examiner comment divers facteurs peuvent modifier la consommation d’oxygène au coeur.

Analyse des taux de consommation d’oxygène dans les Cardiomyocytes néonatals cultivés primaires de souris à l’aide d’un analyseur de Flux extracellulaire

Les pompes à efflux xénobiotiques sont très actives dans les cellules hématopoïétiques des tiges et des progéniteurs (HSPC) et provoquent l'extrusion de TMRM, un colorant fluorescent potentiel de membrane mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour mesurer avec précision le potentiel de membrane mitochondriale dans HSPCs par TMRM en présence de Verapamil, un inhibiteur de pompe d'efflux.

Améliorer la précision de l'évaluation cytométrique du débit du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre grâce à l'inhibition des pompes d'Efflux

Ici nous décrivons une méthode fiable pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel de membrane dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T cultivées ex vivo.

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

Les effets distincts des différents degrés d’hypothermie sur la protection myocardique n’ont pas été soigneusement évalués. L’objectif de la présente étude était de quantifier les niveaux de mort cellulaire à la suite de différents traitements d’hypothermie dans un modèle humain à base de cardiomyocytes, jetant les bases d’une recherche moléculaire approfondie future.

Évaluation in vitro de la protection myocardique après hypothermie-préconditionnement dans un modèle de myocytes cardiaques humains

Cette étude rapporte une nouvelle approche pour mesurer plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux basés sur la cytométrie en flux et la double coloration avec deux rapporteurs fluorescents ou anticorps pour détecter les changements dans le volume mitochondrial, le potentiel de membrane mitochondriale, le niveau d’espèces réactives de l’oxygène, la composition de la chaîne respiratoire mitochondriale et l’ADN mitochondrial.

Analyse cytométrique en flux de paramètres mitochondriaux multiples dans des cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leurs dérivés neuronaux et gliaux

Ici, nous présentons une compilation de tests pour mesurer directement la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères indépendamment de leur capacité à consommer de l’oxygène moléculaire.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

Apprenez à mesurer le potentiel de membrane mitochondriale dans les myocytes cardiaques humains après hypoxie/réoxygénation par cytométrie en flux avec colorant JC-1. Cette méthode évalue efficacement les effets protecteurs des agents.

Un test Flow Cytometry pour mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial dans les Myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation (Vidéo) | JoVE Journal

Un test Flow Cytometry pour mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial dans les Myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation

Explorer plus de vidéos