Un test Flow Cytometry pour mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial dans les Myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation

Cette méthode peut aider à mesurer l’effet de l’hypoxie/réoxygénation sur les cellules dans le potentiel de la membrane mitochondriale, et elle peut être utilisée pour évaluer si un agent protège contre une blessure. Le principal avantage de ce test est que la MMP détectée par celui-ci est en cas de facteurs tels que la taille mitochondriale. De plus, il a un faible besoin en matériaux et en rayonnement.

Commencez avec 70 % de myocytes cardiaques humains confluents dans une plaque à six puits. Après avoir lavé les cellules avec une solution saline tampon phosphate, ajoutez le médicament ou le véhicule dans deux millilitres de sérum et de DMEM sans glucose. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire contenant 5 % de CO2 et 95 % d’air à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant l’hypoxie.

Après 30 minutes, placez la boîte de myocytes cardiaques humains dans un bocal anhypoxique hermétique de 2,5 litres. Équipé d’un catalyseur pour récupérer l’oxygène libre et d’un indicateur anaérobie pour mesurer la tension de l’oxygène dans le milieu. Placez le bocal dans l’incubateur de culture tissulaire.

La couleur de l’indicateur anaérobie passe du bleu clair dans un environnement normoxique au blanc pâle dans des conditions hypoxiques. Réoxygénez les myocytes cardiaques humains en retirant la plaque à six puits du bocal et en la plaçant sur l’étagère de l’incubateur pendant deux heures. Après la réoxygénation, rincez les cellules avec un millilitre de PBS préchauffé et ajoutez 0,5 millilitre de trypsine préchauffée à 25 % le long de la paroi du puits.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant environ une minute jusqu’à ce que tous les myocytes cardiaques humains soient presque détachés. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu complet DMEM dans les puits pour neutraliser la trypsine. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et granulez les HCM en les centrifugant à 500 fois G pendant trois minutes, à température ambiante.

Après la centrifugalisation, aspirer soigneusement le surnageant sans déranger les granulés. Ajoutez ensuite 5 millilitres de milieu complet pour myocytes cardiaques humains et 5 millilitres de solution de travail JC-1 dans chaque tube. Remettez les HCM en suspension en les pipetant de haut en bas.

Couvrez les tubes d’une feuille d’aluminium pour éviter le blanchiment de l’indicateur fluorescent et incubez les cellules dans des conditions normales pendant 20 minutes. Après avoir granulé les myocytes cardiaques humains en les centrifugeant à 500 fois G pendant trois minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius, rincez les cellules deux fois avec deux millilitres de tampon de coloration JC-1 glacé. Après le deuxième rinçage, remettre en suspension les myocytes cardiaques humains dans 300 microlitres de tampon de coloration à froid glacé.

Et filtrez les échantillons dans les tubes d’échantillonnage respectifs. Analysez les cellules par cytométrie en flux dans les 30 minutes. Démarrez le cytomètre en flux et assurez-vous que le logiciel est connecté.

Effectuez le démarrage fluidique. Démarrez le flux et configurez la pause. Ouvrez deux fenêtres de diagramme à points dans le logiciel de cytométrie en flux.

Sélectionnez la lumière diffusée vers l’avant sur l’axe X et la lumière diffusée latérale sur l’axe Y dans le premier graphique à points. Représenter les caractéristiques des cellules en termes de taille et de granularité, respectivement. Sélectionnez le canal de détection PE pour l’axe Y.

Et FITC pour l’axe des X, à l’aide d’une échelle logarithmique dans le deuxième graphique à points, qui est utilisée pour mesurer l’intensité de la fluorescence du colorant JC-1 dans les cellules. Cliquez sur décharger pour faire sortir le bras de support du tube et positionnez le tube d’échantillon vierge contenant des myocytes cardiaques humains qui n’ont pas été teints avec JC-1. Cliquez sur charger pour ramener le bras de support dans sa position de travail.

Cliquez sur enregistrer pour collecter les particules en suspension dans le tube d’échantillon vierge. Et ajustez les tensions des canaux de fluorescence dans le deuxième graphique à points. Gate la population cellulaire pour une analyse plus approfondie dans le premier graphique à points.

Ensuite, analysez les myocytes cardiaques humains. Affichez les statistiques de chaque tube d’échantillon et calculez les MMP de chaque échantillon en divisant le rapport entre l’intensité de la fluorescence rouge et celui de l’intensité de la fluorescence verte. L’hypoxie et la réoxygénation induisent de manière significative l’apoptose des myocytes cardiaques humains, par rapport aux cellules normales mesurées par le rapport PI de l’annexine.

une médecine traditionnelle chinoise aux effets cardio-protecteurs, a empêché l’apoptose des HCM après hypoxie/réoxygénation. Comme le montre ici, le rapport rouge/vert JC-1 après le traitement avec le CCP mitochondrial était presque nul. Cohérent avec les résultats du test d’apoptose.

Le groupe traité H/R a présenté un rapport rouge/vert significativement plus faible que le groupe normal. Et a inversé un tel changement de ratio. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de démarrer les cellules chargées de JC-1 dans un tampon debout glacial, car la température a un effet considérable sur les stabilités du potentiel de la membrane mitochondriale.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la manipulation génétique peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que si la diminution du MMP résulte de l’ouverture du MPTP.