Un dosage Neurosphère pour évaluer l’Activation endogène cellules souches neurales dans un modèle murin de minime de la moelle épinière

Cette méthode peut aider à répondre aux questions liées au rôle des cellules précurseurs neurales dans la médecine régénérative. Plus précisément, nous pouvons nous demander comment les lésions affectent le comportement des cellules précurseurs neurales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une approche pour étudier l’effet des lésions de la moelle épinière sur la cinétique des cellules précurseurs neurales endogènes.

La démonstration visuelle de ces techniques est essentielle. Comme les étapes chirurgicales et de dissection nécessitent de la précision, et peuvent être difficiles à apprendre, bien qu’elles puissent être perfectionnées avec de la pratique. Avant de commencer la procédure, utilisez une tondeuse à cheveux pour enlever la fourrure du dos d’une souris anesthésiée du milieu du dos au cou et aux oreilles.

Après avoir fixé la souris dans un dispositif stéréotaxique, placez quatre à cinq morceaux de gaze roulée sous l’abdomen, tout en tirant légèrement sur la base de la queue pour redresser le corps et la colonne vertébrale. Poussez le rouleau de gaze thoracique de l’abdomen de la souris vers la partie supérieure du thorax pour soutenir la colonne thoracique. Et utilisez du ruban adhésif de laboratoire pour fixer la queue et les membres dans une orientation en étoile.

Après avoir désinfecté la peau exposée avec des écouvillons séquentiels d’éthanol à 70 % et de povidone iodée, utilisez une lame de scalpel numéro 10 pour faire une incision verticale parallèle à l’axe longitudinal de l’animal, du point médian des deux omoplates à la courbure de la colonne thoracique. Rétractez la peau pour exposer les tissus mous et le contour de la colonne vertébrale. Et identifiez le bord inférieur du coussinet adipeux super scapulaire.

Ensuite, utilisez le scalpel pour couper soigneusement mais avec force le long des deux côtés des vertèbres T5 à T8 et neuf os, afin de détacher les tendons musculaires du dos de la colonne vertébrale. Repositionnez les écarteurs de manière à ce que les dents des écarteurs soient insérées dans le site d’incision de chaque côté de la colonne vertébrale. Et élargissez chaque écarteur pour ajuster l’exposition, jusqu’à ce que la colonne vertébrale soit suffisamment élevée sans trop solliciter les couches musculaires rétractées.

Sous un microscope chirurgical, nettoyez soigneusement le muscle résiduel et les autres tissus mous recouvrant la colonne vertébrale, afin d’exposer l’os vertébral. Saisir l’apophyse épineuse des vertèbres à l’aide d’une pince dentée et déplacer légèrement la pince de haut en bas pour identifier les vertèbres qui seront enlevées. Ensuite, insérez la pointe d’une paire de ciseaux incurvés et émoussés de chaque côté du foramen intervertébral exposé, caudal à la lame vertébrale à exciser.

Et coupez les articulations intervertébrales de connexion bilatéralement. Ensuite, soulevez la lame vers le haut et coupez l’attache supérieure de la lame pour isoler et retirer l’os. Lors de la coupe et de l’ablation de la lame vertébrale, veillez à toujours incliner les ciseaux vers le haut afin de ne pas endommager la moelle épinière sous-jacente.

Avec les veines médianes dorsales servant de point de repère, insérez la tige courbée à 45 degrés d’une pointe d’aiguille de 30 gages, côté biseau vers le haut, à un millimètre de profondeur dans la surface latérale dorsale de la moelle épinière. Et environ 0,5 millimètre latéral de chaque côté de la ligne médiane. Déplacez l’aiguille d’environ deux millimètres de la direction caudale à la direction rostrale, de sorte que toute la longueur du biseau soit insérée dans le cordon.

Ensuite, retracez le chemin de l’entrée pour retirer l’aiguille. Pour fermer la plaie, retirez l’écarteur et utilisez une suture résorbable 6-0 pour joindre les muscles du dos de chaque côté de la blessure le long de la ligne médiane. Et une suture en soie 4-0 pour fermer la peau sus-jacente.

Pour isoler les neurosphères, faites une incision médiane dans la peau sur toute la longueur du dos pour exposer le contour des muscles et des os vertébraux. Soulevez la face médiale de chaque omoplate et utilisez des ciseaux pour couper les tissus mous entre l’omoplate et les vertèbres. Lorsque la colonne vertébrale sous-jacente a été exposée, insérez les ciseaux dans l’ouverture thoracique supérieure, en suivant la courbure de la colonne vertébrale, et coupez les côtes, les muscles et les organes internes attachés pour isoler la colonne vertébrale.

Insérez les ciseaux dans le foramen vertébral caudal, et coupez les articulations intervertébrales de chaque côté des lamelles, en prenant soin de ne pas endommager le cordon intact. Lorsque la longueur appropriée du cordon est exposée, coupez soigneusement tous les nerfs spinaux qui s’étendent latéralement à partir du cordon, avant de transférer le tissu de la moelle épinière dans une boîte de Pétri de liquide céphalo-rachidien artificiel ordinaire sur de la glace. À l’aide d’un microscope de dissection, coupez le tissu de la moelle épinière pour inclure environ deux millimètres de tissu rostral et caudal jusqu’au site de la blessure, et utilisez deux paires de pinces fines pour séparer doucement le cordon en deux moitiés longitudinales, le long des fissures dorsale et ventrale.

Utilisez les micro-ciseaux pour découper la substance blanche latérale dorsale blessée. Et placez le tissu blessé dans un tube conique de 15 millilitres. En tenant une moitié de la moelle épinière avec la pince, taquinez et retirez la substance blanche non blessée avec deux paires de pinces le long de l’extension caudale rostrale de la moelle épinière, pour isoler la région périventriculaire appropriée.

Après avoir isolé de la même manière la substance blanche lésée et les régions périventriculaires associées de l’autre moitié de la moelle épinière, placez les morceaux de tissu périventriculaire dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Et utilisez les micro-ciseaux pour hacher doucement le tissu contre les parois des tubes. Une fois que la procédure de digestion tissulaire est terminée et que la suspension unicellulaire a été obtenue, mettez en place une culture de neurosphère en ajoutant 10 millilitres du milieu approprié dans un flacon de culture tissulaire de 25 millimètres par état cellulaire.

Et ajoutez les cellules souches neurales isolées jusqu’à une densité clonale de 10 cellules par microlitre pour leur culture dans un incubateur de culture cellulaire. Après 24 heures, agitez doucement les flacons et décantez le contenu dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres pour la centrifugation. Remettez les granules en suspension dans un à deux millilitres de milieu basal neural frais pour le comptage.

Et plaquez les cellules à la densité clonale dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits par condition, contenant 500 microlitres du milieu approprié complété par du mitogène correspondant par puits. Ensuite, faites pousser les neurosphères dans l’incubateur de culture cellulaire pendant sept jours. Cinq jours après la lésion minime de la moelle épinière, le nombre absolu de neurosphères dérivées de cellules souches neurales définitives est supérieur au nombre de neurosphères dérivées de cellules souches neurales primitives.

Les neurosphères définitives présentent un diamètre plus grand et un grand centre sombre. Alors que les neurosphères primitives sont de plus petite taille et plus serrées. Une lésion minime de la moelle épinière induit une augmentation significative des neurosphères développées à partir du canal central au niveau de la lésion, par rapport à une augmentation relativement modeste au niveau du canal central, rostral au niveau de la lésion.

Des neurosphères définitives peuvent également être générées à partir de la substance blanche lésée au niveau de la lésion. Une région qui ne contient pas de cellules formant la neurosphère chez les animaux seuls de la laminectomie. Une augmentation similaire des cellules souches neurales primitives est observée après la lésion, à l’exception des neurosphères primitives au niveau de la substance blanche au niveau du site de la lésion.

Une fois maîtrisée, la technique chirurgicale peut être réalisée en moins de 40 minutes. Et la dissection et l’isolement des tissus peuvent être effectués en moins de 30 minutes, s’ils sont effectués correctement. Après l’intervention chirurgicale, en fonction de la souche animale, des méthodologies supplémentaires telles que l’immunohistochimie et le choquement linéaire peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la cinétique de prolifération et l’auto-devenir des cellules précurseurs neurales après une lésion.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le test de la neurosphère pour évaluer l’activation des cellules souches neurales, après une lésion de la moelle épinière.