Name: Imagerie de Ca2 + réponses au cours de l’Infection des cellules épithéliales de Shigella (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez l'analyse des réponses calciques locales et globales dans les cellules HeLa infectées par Shigella en utilisant la microscopie à fluorescence avec sondes chimiques. Cette méthode optimise la visualisation des signaux atypiques induits par l'infection bactérienne.

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Nous remercions Thomassin Jenny-Lee pour son aide dans l’édition du manuscrit. Le travail a été soutenu par l’ANR accorde MITOPATHO et PATHIMMUN, des subventions du Labex Memolife et Shigaforce de IDEX PSL. Chunhui Sun est récipiendaire d’une bourse de doctorat de la China Scholarship Council. Laurent Combettes et Guy Tran Van Nhieu sont lauréats d’une bourse de WBI-France Tournesol programme N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l’enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).

1. les préparatifs
<ol><li>
Préparation de bactéries
	<ol>
<li>Les bactéries de la plaque — souche sauvage deShigella exprimant l’adhésine aloudi (M90T-aloudi) — sur un trypticase agar de soja (TCS) plaque contenant 0,01 % du rouge Congo (CR) et les incuber pendant 18 heures à 37 ° C. Remarque : Pour augmenter leur reproductibilité, les plaques de Shigella , obtenus à l’étape 1.1.1 sont stockés à 4 ° C et doivent être utilisés dans une semaine, parce que toutes les colonies sur milieu CR finalement seront allume en rouges au fil du temps.</li>
		<li>Inoculer TCS bouillon pré-culture en choisissant 3 colonies rouges des plaques strie. Remarque : L’inoculation avec 3 colonies est effectuée afin de limiter la probabilité de choisir un seul clone dont plasmides de virulence a fait l’objet d’une recombinaison génétique.</li>
		<li>Cultiver des cultures bactériennes liquides dans un incubateur à agitation pendant 16 h à 37 ° C à 200 tr/min. Ajouter ampicilline à une concentration finale de 75 mg/mL. Concentrations d’antibiotique ne doivent pas dépasser 3 x la concentration minimale inhibitrice, car un excès d’antibiotique peut conduire à la perte du plasmide grande virulence. Remarque : Le maintien du plasmide Shigella virulence doit être vérifié en ensemençant les cultures bactériennes sur des plaques de CR additionnés de concentrations d’antibiotique appropriées. La présence de colonies blanches indique perte de plasmides.</li>
		<li>Ensemencer la culture TCS avec la culture bactérienne préalable à une dilution au 1/100. Il incuber à 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 2 h à 200 tr/min. Veiller à ce que la densité optique à 600 nm (OD600nm) est de 0,2 - 0,4.</li>
		<li>Centrifuger la culture bactérienne pendant 2 min à 13 000 x g à 21 ° C et Resuspendre le culot dans un volume équivalent de EM milieu (120 mM NaCl, KCl 7 mM, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, glucose 5 mM et 25 mM HEPES pH = 7,3).</li>
		<li>Diluer la suspension bactérienne dans un tampon EM à une finale de OD600nm de 0,1 et utiliser immédiatement ou stockez-le à 21 ° C et utiliser dans le prochaine 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de cellules
	<ol>
<li>Les cellules HeLa culture en DMEM avec 1 g/L de glucose additionné de 10 % de sérum de veau foetal (FCS) et cultivent à 37 ° C, avec 10 % de CO2. Croître TC-7 grandi DMEM avec 4,5 g/L de glucose, contenant 10 % FCS et les acides aminés non essentiels dans un incubateur à 37 ° C contenant 10 % de CO2.</li>
		<li>Pour l’entretien de la cellule, fractionner les cellules régulièrement afin d’éviter une inhibition de la croissance-contact liée aux États confluentes ; Cela est essentiel pour un Ca2 + sonde chargement/transfection à rendement élevé.</li>
		<li>Plaque de cellules HeLa sur lamelles circulaires stériles 25 mm de diamètre en plaques 6 puits à une densité de 3 x 105 cellules/puits la veille de l’expérience pour les cellules HeLa.</li>
		<li>Pour les TC-7 cellules, trypsinize et compter les cellules. Les semences à 4 x 105 cellules/puits et incuber les 5-7 jours à 37 ° C dans un 10 % de CO2-incubateur avant les expériences afin de permettre une polarisation.<ol>
<li>Actualiser le milieu de culture cellulaire de tous les jours jusqu’au jour de l’expérience. Remarque : Fond en verre diamètre 35 mm jetable chambres peut-être également être utilisé comme une alternative aux puits contenant des lamelles couvre-objet. Si ces derniers sont utilisés, le contrôle de la température grâce à une platine chauffante ou objectif n’est pas suffisant, et une chambre d’incubation thermostat monté sur la platine du microscope est nécessaire.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le jour de l’expérience, retirez le support et laver les cellules 3 x avec 1 mL EM médium à 21 ° C.</li>
	<li>Charger les cellules avec 3 mM Fluo-4-AM14 un tampon EM pendant 30 minutes à 21 ° C. Remarque : Le chargement de cellules HeLa Sub confluentes ne soulève pas de problèmes majeurs, le chargement des cellules polarisées de TC-7 est souvent hétérogène et peu efficace. Pour ces cellules, nous avons trouvé que l’efficacité de chargement est renforcée par l’ajout de l’agent de dispersion — acide Pluronique — à une concentration finale de 0,1 % et de l’anion-transporteur inhibiteur bromosulfophtalein à une concentration finale de 20 µM à la Contenant fluo-4-AM EM. L’utilisation de produits chimique ratiométrique sondes ou codé génétiquement-FRET sondes nécessitant une double-acquisition n’est pas compatible avec la vitesse d’acquisition requise pour l’imagerie des réponses locales du Ca2 + .</li>
	<li>Laver les échantillons 3 x avec EM mettre en mémoire tampon et plus loin les incuber dans 1 mL de tampon EM à 21 ° C, permettant l’hydrolyse de la portion de l’AM. Utilisation Fluo-4 cellules chargées immédiatement ou dans les prochain 90 min (maintenue à 21 ° C).</li>
</ol>2. infection et Acquisition d’images des réponses locales Ca2 +
<ol><li>Placer la lamelle contenant les cellules chargées de Fluo-4 dans une chambre d’imagerie ou de la chambre de fond en verre. Laver les échantillons dans la salle d’imagerie ou jetables de fond en verre chambre 3 x avec tampon EM pour éliminer les composés potentiellement résultant de la lyse cellulaire. Ajouter 1 mL de tampon d’EM.</li>
	<li>Placer la chambre sur une scène de microscope de fluorescence inversé chauffée à 33 ° C. Remarque : Cette température est sélectionnée comme un compromis entre les températures optimales compatibles avec le processus d’invasion de Shigella et le ralentissement des réponses du Ca2 + pour visualiser les réponses locales. Nous utilisons un 63 X objectif à immersion d’huile (NA = 1,25) équipé d’anneaux de contraste de phase.</li>
	<li>Sélectionnez un champ de microscopie et de définir les paramètres d’acquisition, y compris les temps d’exposition et binning si nécessaire, pour optimiser le signal fluorescent Fluo-4. Remarque : Les grands enjeux du local Ca2 + imagerie sont la faible amplitude et la faible durée des réponses, nécessitant une acquisition au moins tous les 30 m plusieurs disponibles dans le commerce rétro-éclairé EM-CCD ou C-MOS caméras présentent le nécessaire sensibilité pour détecter Ca2 + réponses locales à l’aide de Fluo-4. Sensibilité de détection est également une question importante pour limiter le photovieillissement ou objets tels que des réponses spontanées, liées à l’excitation fluorescente Fluo-4 à haute fréquence. Ici, un éclairage à base de LED de 470 nm, avec un filtre passe-bande d’excitation de 480 ± 40 nm, un filtre dichroïque 505 nm et une émission de passe-bande nm ± 30 527 utilisé à 5 % de son intensité maximale combinée avec un filtre de densité neutre 1,0 ont été utilisés afin de minimiser ces problèmes sous un courant d’acquisitions des durées limitées. Une analyse du Ca2 + signaux locaux de lots de 120 s flux s’est déroulée régulièrement. Dans ces conditions de faible éclairage, fluorophore photoblanchiment n’a pas été observé au cours de l’acquisition de min-stream 2. Les acquisitions successives sur le même échantillon peuvent être effectuées, autant de domaines différents sont utilisés. En règle générale, un premier flux d’acquisition est effectué sur un champ de contrôle en l’absence de stimulation de bactéries pour s’assurer de l’absence de réponses spontanées. Si on observe des réponses spontanées, les échantillons sont lavés avec un tampon EM jusqu'à ce qu’on observe aucune réponse.</li>
	<li>Pour ajouter des bactéries à l’échantillon, retirer 500 µL de tampon de l’EM de la chambre et ajouter 500 µL de la suspension bactérienne préparée à l’étape 1.1.6 pour obtenir une finale de OD600nm de 0,05, avec les soins appropriés afin d’éviter de déplacer le champ sélectionné de la microscopie ; les volumes s’assurer un bon mélange de bactéries et une répartition homogène de la bactérie sur les échantillons de cellules.</li>
	<li>Effectuer une acquisition suite à l’ajout de bactéries. Vous pouvez également effectuer une acquisition 10 min après l’ajout de bactéries, qui correspond au temps nécessaire pour que les bactéries dans les sédiments sur les cellules dans les conditions utilisées. À la fin du flux de l’acquisition, acquérir une image à contraste de phase du champ sélectionné pour visualiser les bactéries communiquant avec les cellules et les volants de membrane associées aux sites d’invasion bactérienne.</li>
	<li>Répétez la procédure d’acquisition comme au point 2.5, à des intervalles qui sont prêtent à la durée de l’acquisitions d’image, fichiers d’épargne et sélection d’un nouveau champ à couvrir l’ensemble du processus. Remarque : Pour les Shigella, nous avons trouvé que l’acquisition diffuse toutes les 5 min pendant 20 min, après la sédimentation bactérienne de 10 min, permise de couvrir la majorité des événements invasion.</li>
	<li>Ajouter à la fin de la procédure d’acquisition, une concentration finale de 2 µM de Ca2 + ionophore ionomycine échantillons pour déterminer l’amplitude maximale des signaux Ca2 + . Acquisition d’images toutes les 3-5 s jusqu'à stabilisation du signal, généralement pour moins de 10 min.</li>
	<li>Suivre en ajoutant Ca2 + chélateur EGTA à une concentration finale de 10 mM pour déterminer le signal de fluorescence en l’absence de Ca2 +. Acquisition d’images toutes les 3-5 s jusqu'à stabilisation du signal, généralement pour moins de 10 min. Remarque : En raison de la dynamique relativement lente des Ca2 + variations globales, effectuer ces acquisitions toutes les 3-5 s (pas en mode streaming), permettant de Ca2 + imagerie sur le même champ microscopique durant les traitements successifs.</li>
</ol>3. analyse
<ol><li>Exprimer des variations cytosoliques de Ca2 + au fil du temps comme le pourcentage de ΔF/F0, où ΔF représente la variation de l’intensité de fluorescence moyenne de la région d’intérêt (ROI) et F0 la fluorescence de base dans le même ROI, auquel une région non pertinents du champ dépourvu de cellules est soustrait.<ol>
<li>Supprimer les niveaux de fluorescence basale pour chaque cellule dans différents domaines, correspondant aux niveaux de référence ; ces niveaux peut être déterminé sans ambiguïté en raison de la faible fréquence et de relativement courte durée de Ca2 + réponses locales dans une acquisition de flux donné. Remarque : Quantifier les caractéristiques frappantes des réponses liées aux questions posées et le modèle pathogène étudiés. Classiquement, différents paramètres sont pris en compte pour analyser les signaux Ca2 + , y compris la fréquence des cellules montrant locales ou globales Ca2 + réponses, ainsi que la durée, amplitude et la fréquence de ces réponses. Dans le cas de Shigella et les réponses locales, un autre aspect important de l’analyse est l’association spatiale des réponses avec des sites d’invasion bactérienne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Afin de quantifier le pourcentage de cellules sensibles présentant des réponses globales ou locales, attirer ROIs dans les cellules, correspondant aux variations d’intensité de Fluo-4 séries.<ol>
<li>La valeur des paramètres stricts pour identifier le Ca2 + les réponses locales, telles que l’amplitude des variations de fond ci-dessus triple du niveau de référence cellule fluorescence moyenne intensité ou une durée d’au moins 200 ms, pour éviter de marquer un faux positif. Remarque : En règle générale, même de petites Ca2 + réponses locales se distingués du bruit de fond par leur profil. La ROIs doit être suffisamment grande pour intégrer assez signaux fluorescents pour permettre la détection des variations locales. Selon l’intensité de la détection de Fluo-4, ces ROIs peuvent correspondre aux cercles d’un diamètre allant de 2 à 5 mM.</li>
		<li>Mesurer les variations de l’intensité de fluorescence Fluo-4 moyenne dans 2 régions dans une zone distincte de la même cellule, afin de déterminer si les réponses sont globales ou locales. Remarque : L’analyse d’un grand nombre de cellules est facilitée par l’utilisation de l’imagerie des logiciels permettant l’affichage de l’écran en direct des variations de l’intensité de la fluorescence moyenne au fil du temps pour les régions sélectionnées. Les logiciels d’imagerie disponibles dans le commerce a une telle option, mais cela peut aussi être effectuée en utilisant le logiciel gratuit Icy , en utilisant le plugin ROI intensité Evolution .</li>
		<li>Déterminer le pourcentage de cellules présentant des réponses locales. Remarque : Ce pourcentage est calculé à partir du nombre total de cellules analysées dans le domaine de la microscopie, qui doit être en nombre suffisant pour soutenir un statistiquement l’importance à l’aide d’un test non paramétrique.</li>
		<li>Déterminer la durée des réponses locales. Remarque : Réponses locales Ca2 + peuvent être davantage distingués selon leurs gammes de durée (c'est-à-dire, moins de 500 ms, entre 5 et 10 s, ou supérieure à 10 s) et leur association avec des sites d’invasion de Shigella .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifier l’amplitude des réponses. Tout d’abord, calibrer le Ca2 + et cellule fond niveau maximal déterminé comme au point 2.1.7. Puisque la charge Fluo-4 peut varier pour chaque cellule, effectuer ces déterminations pour des cellules individuelles dans le domaine.<ol>
<li>Exprimer l’amplitude des réponses sous forme d’un pourcentage relatif de la réponse maximale.</li>
		<li>Effectuer des tests statistiques à l’aide d’un test de normalité, suivi d’un test paramétrique pour analyser les différences potentielles de l’amplitude des réponses entre les échantillons.</li>
		<li>Déterminer l’association entre ces réponses par rapport à des sites d’invasion bactérienne par leur localisation respective pour les volants de membrane induite par la bactérie visualisées dans les images de contraste de phase correspondants.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11413485">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+calcium+ATPases%3A+from+generic+Ca%282%2B%29+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Ca2%2B+signals%3A+a+question+of+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li>
<li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20494106">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li>
<li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li>
<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+III+secretion+systems%3A+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li>
<li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219(2015).</li>
<li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567(2013).</li>
<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Cet article décrit le protocole que nous avons conçu pour suivre les signaux locaux de Ca2 + pendant la cinétique relativement courte d’une invasion de Shigella , en plus de Ca2 + réponses globales au cours de la longue cinétique de Shigella. Ci-dessous, la clé se trouvent des questions qui doivent être abordées afin d’optimiser la détection de Ca2 + signaux tout en minimisant toute ingérence dans les processus biologiques.
Chimiques vs ...

Ca2 + réglemente tous les processus cellulaires connus, notamment la réorganisation du cytosquelette, les réponses inflammatoires et voies de mort cellulaire, associés à des interactions hôte-pathogène1,2,3. Dans des conditions physiologiques, des concentrations2 + Ca cytosoliques basales sont faibles, dans les centaines de gamme nM, mais peuvent être soumises à des augmentations transitoires lors de la stimulation agoniste. Ces variations montrent souvent comportement oscillatoire sous l’action des pompes et des canaux à la membrane de plasma et le réticulum endoplasmique. Le modèle de ces oscillations est caractérisé par la période, la durée et amplitude de Ca2 + augmente et est déchiffré par les cellules qui, à leur tour, déclenchent des réponses spécifiques dans ce qu’on appelle le Ca2 + code4,5 . Une augmentation soutenue de la concentration de Ca2 + cytosolique dans des conditions pathologiques peut-être conduire à la mort de cellule associée à la perméabilisation des membranes mitochondriales et le déblocage de pro-apoptotiques et nécrotiques facteurs6, 7.
Shigella, l’agent causal de la dysenterie bacillaire, envahit les cellules épithéliales en injectant des effecteurs dans les cellules de l’hôte à l’aide d’un type III sécrétion système (T3SS)8,9. Ca2 + signaux les et mondiaux provoquées par la T3SS est associé liée une invasion de Shigella des cellules hôtes. En ce qui concerne le pore-forming toxines, le translocon T3SS qui insère dans les membranes des cellules hôtes et est nécessaire pour l’injection des effecteurs T3SS est probablement responsable de l’activation de PLC et l’inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-dépendant Ca2 + Communiqué. Communique de la combinaison de la stimulation localisée de PLC et l’accumulation de l’actine polymérisée dans les endroits d’un résultat d’invasion de Shigella dans un anormalement longue durée dépendant InsP3 Ca2 + 10. Le type III processeur d’effets IpgD, une phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-phosphatase, limite l’espace local de PIP2, contrôlant ainsi la quantité de substrat disponible pour PLC générer des InsP3, ce qui contribue à l’isolement des locaux Ca2 + réponses à l’invasion bactérienne sites11,12. Ces locaux Ca2 + réponses susceptibles de contribuer à la polymérisation de l’actine à Shigella invasion sites10. Réponses2 + Ca globales qui sont aussi provoquées par Shigella, cependant, sont indispensables pour le processus d’invasion bactérienne mais déclencher l’ouverture de connexine hémicanaux à la membrane plasmique et la libération d’ATP dans l’extracellulaire compartiment. ATP libérée, agissant de manière paracrine, stimule à son tour, Ca2 + oscillatoires réponses dans des cellules à côté de la cellule infectée. IpgD est également responsable de la mise en forme Ca2 + réponses globales dans des réponses isolées erratiques avec la dynamique lente. Finalement, après une infection bactérienne prolongée, IpgD conduit à l’inhibition des signaux2 + Ca induite par l’InsP3. Par le biais de son interférence avec la signalisation de Ca2 + , IpgD retarde un Ca2 +-activation dépendante calpaïne permettant le démontage des structures d’adhérence focale et le détachement prématuré d’infecté les cellules13.
Alors que les signaux de Ca2 + sont impliqués dans les aspects critiques de la pathogenèse, l’utilisation d’un micro-organisme soulève un certain nombre de défis techniques qui ne sont pas rencontrés dans les études classiques agoniste. Protocoles décrits ici utilisent le couramment utilisé Ca2 + chimique indicateur fluorescent Fluo-4 que nous avons conçu pour caractériser les signaux locaux de Ca2 + au cours d’une infection de Shigella . Étapes essentielles pour la détection de ces signaux sont discutés, ainsi que les procédures mises en place pour leur analyse quantitative qui sert à caractériser le rôle des effecteurs bactériennes dans la signalisation de Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph version 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSystème d’éclairage LED pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-parabole 35 mm, haut&nbsp ;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Bouillon de soja (TCS)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>Gélose TCS</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Rouge Congo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>Shigella flexneri sérotype V. exprimant l’adhésine</td><td></td> AfaE</tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>souche mutante isogénique ipgD exprimant l’adhésine</td><td></td> AfaE</tr></tbody></table>

imagerie de ca2 + réponses au cours de l’infection des cellules épithéliales de shigella

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2 + est un ion ubiquitaire impliqué dans tous les processus cellulaires connus. Alors que Ca2 + réponses globales peuvent affecter le sort de la cellule, les variations locales de Ca2 + cytosolique des concentrations libre, liées à la libération de réserves internes ou un influx à travers les canaux de la membrane plasmique, régulent les processus de cellules corticales. Pathogènes qui respecte ou envahir l’hôte cellules déclencheur une réorganisation du cytosquelette d’actine qui sous-tendent la membrane plasmique hôte, affectant probablement Ca2 + signalisation tant mondial que local. Parce que ces événements peuvent se produire dans les basses fréquences de façon Pseudo-aléatoire stochastique plus longue cinétique, l’analyse des signaux de Ca2 + induite par des agents pathogènes soulève des défis techniques majeurs qui doivent être abordées.
Nous rapportons ici, protocoles pour la détection de Ca2 + des signaux les et mondiaux sur une infection Shigella des cellules épithéliales. Dans ces protocoles, artefacts liés à une exposition prolongée et photovieillissement associée à l’excitation de Ca2 + des sondes fluorescentes sont dépannez-effectué en contrôlant rigoureusement les paramètres d’acquisition au cours de périodes définies au cours d’une Shigella invasion. Des procédures sont mises en œuvre pour analyser rigoureusement l’amplitude et la fréquence des signaux2 + Ca cytosoliques globales au cours de la cinétique d’infection étendue à l’aide de la sonde chimique Fluo-4.

Invasion de Shigella est associée à atypique durable Ca2 + réponses locales :
À la suite du protocole mentionné ci-dessus, les cellules HeLa Fluo-4-chargés ont été contestées avec WT Shigella et acquisitions de flux ont été effectuées pour analyser les signaux de Ca2 + . Une expérience représentative est illustrée à la Figure 1, avec une série d’images de Time-la...

Nous présentons ici les protocoles afin de visualiser les réponses de calcium (Ca2 +) induites par les cellules HeLa infectées par Shigella. En optimisant les paramètres de l’infection bactérienne et d’imagerie avec Ca2 + des sondes fluorescentes, atypique globales et locales Ca2 + signaux induits par des bactéries sur une gamme étendue de la cinétique de l’infection sont caractérisés.

Imagerie de Ca2 + réponses au cours de l’Infection des cellules épithéliales de Shigella

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

L’objectif global de cette analyse par microscopie fluorescente à l’aide de sondes chimiques est d’analyser les réponses calciques locales et globales provoquées par les cellules hôtes lors de l’infection par Shigella pathogène. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie cellulaire, telles que la signalisation induite par des agents pathogènes conduisant à la réorganisation du cytosquelette ou à la mort cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’en utilisant des sondes chimiques, on peut suivre les signaux calciques locaux associés à des processus locaux détournés par l’agent pathogène.Généralement, les individus novices dans cette méthode auront du mal à cause de la mise en place de paramètres qui permettent de suivre les signaux calciques locaux tout en préservant l’intégrité des échantillons biologiques. Pour commencer, mettez en boîte des Shigella de type sauvage exprimant l’adhésion AfaE sur une plaque de gélose trypticase de soja ou de TCS contenant 0,01 % de rouge du Congo et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 heures. Préparez des pré-cultures à partir des plaques striées en prélevant trois colonies rouges et en inoculant du bouillon TCS avec 75 microgrammes par millilitre d’ampicilline.Cultivez les cultures liquides dans un incubateur à agitation à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant 16 heures. Ensuite, inoculez le TCS avec la pré-culture bactérienne à une dilution de 1:100. Incuber la culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur à secouer à 200 tr/min pendant deux heures.Assurez-vous que la densité optique à 600 nanomètres est de 0,2 à 0,4. Centrifugez la culture à 13 000 g et 21 degrés Celsius pendant deux minutes et remettez la pastille en suspension dans un volume équivalent de milieu EM. Diluez la suspension bactérienne dans un tampon EM à une DO finale de 600 de 0,1 et utilisez-la immédiatement ou stockez-la à 21 degrés Celsius et utilisez-la dans les 60 prochaines minutes.Cultivez des cellules HeLa dans du DMEM avec un gramme par litre de glucose complété par 10 % de FCS et cultivez la culture à 37 degrés Celsius avec 10 % de CO2. Cultivez des cellules TC7 dans du DMEM avec 4,5 grammes par litre de glucose, 10 % de FCS et d’acides aminés non essentiels et cultivez à 37 degrés Celsius et 10 % de CO2. Pour l’entretien cellulaire, divisez régulièrement les cellules pour éviter l’inhibition du contact de croissance liée aux états confluents.Ceci est essentiel pour une charge élevée de la sonde calcique et l’efficacité de la transfection. Trypsinisez et comptez les cellules TC7. La veille de l’expérience avec des cellules HeLa, placez les cellules sur des lamelles circulaires stériles de 25 millimètres de diamètre en plaques à six puits à une densité de trois fois 10 pour les cinq cellules par puits.Ensuite, pour permettre la polarisation avant les expériences, ensemencez les cellules à quatre fois 10 à cinq cellules par puits et incubez-les pendant cinq à sept jours, en remplaçant le milieu chaque jour. Le jour de l’expérience, retirez le milieu et utilisez un millilitre de milieu EM pour laver les cellules trois fois. Chargez les cellules avec trois tampons micromolaires Fluo-4 AM et EM et incubez les plaques à 21 degrés Celsius pendant 30 minutes.Avec le tampon EM, lavez les échantillons trois fois, puis ajoutez un millilitre de tampon EM et incubez les cellules à 21 degrés Celsius pour permettre l’hydrolyse de la fraction AM. Placez la lamelle contenant les cellules chargées de Fluo-4 dans une chambre d’imagerie ou à fond de verre. Utilisez un tampon EM pour laver l’échantillon trois fois afin d’éliminer les composés pouvant résulter de la lyse cellulaire.Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon EM. Placez la chambre sur une platine de microscope à fluorescence inversée chauffée à 33 degrés Celsius. Sélectionnez un champ de microscopie et configurez les paramètres d’acquisition, y compris le temps d’exposition et le binning si nécessaire pour optimiser le signal fluorescent Fluo-4.Pour ajouter des bactéries à l’échantillon, retirez soigneusement 500 microlitres de tampon EM de la chambre et ajoutez 500 microlitres de suspension bactérienne pour obtenir un DO final de 600 de 0,05. Effectuez immédiatement une acquisition ou attendez 10 minutes pour permettre aux bactéries de se sédimenter sur les cellules. À la fin du flux d’acquisition, acquérir une image en contraste de phase du champ sélectionné pour visualiser les bactéries en contact avec les cellules et les volants membranaires associés aux sites d’invasion bactérienne.Répétez la procédure d’acquisition à des intervalles adaptés à la durée des acquisitions d’images, à l’enregistrement des fichiers et à la sélection d’un nouveau champ pour couvrir l’ensemble du processus. A la fin de la procédure d’acquisition, ajoutez à l’échantillon deux micromolaires de l’ionomycine calcique pour déterminer l’amplitude maximale des signaux calciques. Acquérez des images toutes les trois à cinq secondes jusqu’à ce que le signal se stabilise, généralement pendant moins de 10 minutes.Poursuivez en ajoutant le chélateur de calcium EGTA à une concentration finale de 10 millimolaires pour déterminer le signal fluorescent en l’absence de calcium. Acquérez des images toutes les trois à cinq secondes jusqu’à la stabilisation du signal, généralement pendant moins de 10 minutes. Effectuer l’analyse d’images selon le protocole texte.Dans cette expérience, des cellules HeLa chargées de Fluo-4 ont été testées avec des Shigella de type sauvage et des acquisitions de flux ont été effectuées pour analyser les signaux calciques. La moyenne d’une série d’images en accéléré de l’intensité de fluorescence de la sonde Fluo-4 est calculée dans une région d’intérêt pour une seule cellule, et l’image en contraste de phase correspondante est présentée. Des augmentations locales atypiques du calcium cytosolique libre sont observées au site d’invasion de Shigella avec une amplitude variable et des durées allant de 2,5 à cinq secondes, suivies d’augmentations globales de la cellule infectée.Dans cet exemple, une souche mutante isogénique, déficiente pour l’effecteur de type III IpgD, une phosphatidyl 4, 5-bisphosphate phosphatase, a induit des réponses locales plus globales et moins atypiques avec de longues durées par rapport à la souche Shigella de type sauvage. Comme on l’a vu dans cette expérience, l’imagerie des réponses calciques globales sur une cinétique d’infection étendue montre une diminution de la fréquence des réponses 30 minutes après la provocation avec Shigella de type sauvage. Enfin, la quantification des réponses cellulaires dose-dépendantes à l’agoniste calcique histamine illustre l’inhibition de la libération de calcium dépendante de l’inositol triphosphate aux stades avancés d’une infection à Shigella.À la suite de cette procédure, toutes les méthodes combinant simultanément des fluides compatibles et l’imagerie peuvent être réalisées afin d’aborder le rôle des signaux calciques dans un processus donné. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’élimination des déchets, le nettoyage des surfaces ou des équipements contaminés doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Research

Recherche

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Imagerie de Ca^{2 +} réponses au cours de l’Infection des cellules épithéliales de Shigella

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