Évaluation du rôle de la fonction mitochondriale en Fatigue liée au Cancer

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer le dysfonctionnement mitochondrial associé à la fatigue chez les patients atteints de cancer. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des soins de soutien contre le cancer, par exemple si le dysfonctionnement mitochondrial est associé à la fatigue chez les patients atteints de cancer après avoir reçu une radiothérapie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est moins invasive et qu’elle peut être facilement utilisée en clinique pour identifier les patients à risque de toxicités liées au traitement du cancer.

Cette technique permet non seulement de faire progresser notre compréhension du rôle du dysfonctionnement mitochondrial dans la fatigue liée au cancer, mais elle peut également améliorer l’évaluation et optimiser sa gestion. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des mécanismes sous-jacents de la fatigue liée au cancer, elle peut également être appliquée à d’autres maladies fatigantes telles que les conditions métaboliques et inflammatoires de l’uri. En général, il peut être difficile pour les personnes novices de cette méthode d’injecter correctement des inhibiteurs respiratoires dans chaque port de la cartouche du capteur sans démonstration visuelle préalable.

La démonstration de cette procédure sera assurée par M. Quang Nguyen, un boursier postbac de notre laboratoire. Pour hydrater la cartouche du capteur, retirez-la d’abord de l’emballage. Ajoutez ensuite 200 microlitres de solution de calibrant dans chaque puits de la plaque utilitaire.

Remplissez également chaque douve avec 400 microlitres de solution de calibrant. Ensuite, remettez la plaque du capteur sur la plaque utilitaire et commencez à hydrater la cartouche dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Mesurez le niveau de fatigue à l’aide de l’évaluation fonctionnelle en 13 questions du traitement des maladies chroniques.

Fatigue au départ, à mi-parcours, à la fin de l’EBRT et un an après l’EBRT. Préparez d’abord le milieu de test pour la mesure de la fonction mitochondriale. Après avoir préparé le milieu, réchauffez-le à 37 degrés Celsius et ajustez le pH à 7,4.

Il est important de s’assurer que le milieu de test est préparé le jour de l’expérience et qu’il est chauffé à 37 degrés avant d’ajuster le PH à 7,4. Ensuite, ensemencez les PBMC dans chaque puits pour atteindre une confluence de 80 à 90 %. Faites ensuite tourner la plaque à 200 fois g pendant 2 minutes pour que les cellules adhèrent au fond des puits.

Après l’essorage, retirez le média de chaque puits et rincez les puits une fois avec un média de dosage. Ajoutez 180 microlitres de milieu de dosage dans chaque puits, y compris les puits d’arrière-plan. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur sans dioxyde de carbone pendant 45 à 60 minutes.

Pour reconstituer les médicaments, ajoutez 252 microlitres de milieu de test au médicament pour générer une solution mère de 50 micromolaires d’oligomycine. Ajoutez 288 microlitres de milieu de test au médicament pour générer une solution mère de 50 micromolaires de FCCP. Enfin, ajoutez 216 microlitres de milieu de dosage pour générer une solution mère de 25 micromolaires d’antimycine a/roténone.

Après avoir reconstitué les trois médicaments, agitez la suspension de médicament pendant une minute, puis diluez les solutions de travail. Ensuite, pipetez 20 microlitres de 10 micromolaires d’oligomycine dans l’orifice A jusqu’à une concentration finale d’une micromolaire dans chaque puits. Pipette suivante 22 microlitres de FCCP 10 micromolaires dans l’orifice B jusqu’à une concentration finale d’une micromolaire dans chaque puits.

Enfin, pipetez 25 microlitres de 5 micromolaires d’antimycine a/roténone dans l’orifice C jusqu’à une concentration finale de 0,5 micromolaire dans chaque puits. Sélectionnez ensuite le test d’effort Mito sur l’instrument de flux extracellulaire. Ensuite, insérez la cartouche du capteur en suivant l’invite de l’instrument.

L’instrument effectuera automatiquement l’étalonnage du capteur. Une fois l’étalonnage terminé, insérez la plaque de la cellule pour que l’instrument termine le reste du test. Pour préparer la solution d’essai de prolifération cellulaire, ajoutez 5,76 microlitres de colorant d’acide nucléique et 28,8 microlitres de suppresseur de fond à 1,405 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate.

Une fois le test de résistance Mito terminé, ajoutez 180 microlitres de solution de travail 2x directement dans le milieu de chaque puits. Ensuite, incubez les cellules avec la solution de test de prolifération cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes. Quantifiez le nombre de cellules vivantes sur un lecteur de plaques à une excitation de 508 nanomètres et une émission de 527 nanomètres, puis normalisez les données OCR.

Lors de la réalisation du titrage FCCP, une micromolaire est la concentration optimale du médicament qui est utilisée pour évaluer la fonction mitochondriale du PBMC. L’étude de la respiration mitochondriale et des PBMC fraîchement isolés montre que l’OCR commence à diminuer après trois heures et se poursuit jusqu’à huit heures. Cependant, la respiration maximale provoquée par l’injection de FCCP ne dépasse pas non plus le niveau d’OCR basal.

Ici, la normalisation de la fonction mitochondriale où les cellules sont isolées de deux individus sains est montrée. En fait, l’OCR normalisé aux cellules vivantes représenté par le colorant de liaison à l’ADN en fluorescence verte est similaire chez les deux individus sains. En effet, aucune différence significative dans l’OCR basale n’est observée entre un sujet sain et un sujet fatigué.

Cependant, le sujet fatigué présente une diminution de la consommation maximale d’oxygène et une capacité respiratoire de rechange par rapport au contrôle. Aucune différence n’a été constatée dans la consommation d’oxygène non mitochondriale et liée à l’ATP ou l’efficacité du couplage entre les sujets sains et les sujets fatigués. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de déterminer d’abord la densité cellulaire optimale et les concentrations FCCP. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’isolement de différentes populations cellulaires, peuvent être mises en œuvre afin de guider les futures investigations mécanistes axées sur des types de cellules spécifiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des soins de soutien pour explorer le rôle du dysfonctionnement mitochondrial chez les patients cancéreux fatigués.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la fonction mitochondriale et des échantillons cliniques qui peuvent également être utilisés pour identifier de manière proactive les patients à risque de développer des toxicités liées au traitement du cancer, y compris la fatigue. N’oubliez pas que travailler avec des inhibiteurs respiratoires tels que l’oligomycine et la roténone peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.