Name: Lavage broncho-alvéolaire Exosomes en lésion induite par le Lipopolysaccharide septique pulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Découvrez l'isolation d'exosomes du lavage broncho-alvéolaire chez des souris traitées au LPS pour étudier les mécanismes de lésion pulmonaire aiguë. Cette technique permet d'analyser la communication intercellulaire et les réponses inflammatoires.

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Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.

Le protocole général nécessite 2 jours, y compris le premier jour de l’induction de la septicémie et l’isolement des LBA de l’animal et le deuxième jour pour les exosomes d’isolement de la souris BALF. Toutes les procédures ont été examinées et approuvées par le Comité de l’urbanisme à Atlanta VA medical center et d’institutionnels animalier.
1. souris modèle de blessure pulmonaire septique aiguë
<ol><li>Utilisez 6 à 8 semaines - vieux mâles C57BL/6J souris de type sauvage (poids 20 à 22 g) pour l’animal modèle et effectuez toutes les procédures à l’aide d’instruments et techniques aseptiques. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, y compris les pinces et ciseaux pendant 20 min à 121 ° C.</li>
	<li>Au hasard de distribuer souris dans expérimental et le groupe témoin. Immobiliser la souris sur un plateau chirurgical. Traiter les souris avec Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg) par voie intrapéritonéale. Selon le poids du corps individuel, diluer les doses appropriées de LPS à 0,1 mL de PBS par souris, puis injecter la solution de LPS à l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille 27 G et injecter un volume équivalent de PBS aux animaux témoins.</li>
	<li>Garder les souris dans l’animalerie BSL2, qui se compose des cages propres à la température appropriée.</li>
	<li>24 h plus tard, euthanasier souris avec inhalation de CO2 .</li>
	<li>Sélectionnez la zone chirurgicale au centre du cou de la souris. Faire une petite incision (environ 5 mm) et de séparer doucement les muscles pour l’accès à la trachée avec une pincette émoussé jusqu'à ce que la trachée est exposée.</li>
	<li>Retirer le liquide BAL souris avec seringue stérile de 10 mL avec une aiguille de 27 G. Tout d’abord, doucement, introduire l’aiguille dans la trachée et injecter 1 mL de PBS stérile lentement dans la trachée, puis dessiner BALF dans une seringue de 3 mL avec une aiguille de 27 G. Une fois la procédure terminée, jeter des seringues et des aiguilles dans le conteneur pour objets tranchants biohazard.</li>
	<li>Traiter des instruments chirurgicaux au dioxyde de chlore, comme décrit plus haut par Chauret et al. 27et puis stériliser tous les instruments chirurgicaux à l’autoclave pendant 20 min à 121 ° C.</li>
</ol>2. les Exosomes isolement-série Ultra-centrifugation et caractérisation
<ol><li>Recueillir le liquide BAL souris en tubes coniques 15 mL. Pour récolter les cellules alvéolaires, centrifuger les échantillons pendant 10 min à 1 000 g, à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer le liquide surnageant dans de nouveaux tubes coniques 15 mL, puis centrifuger les échantillons pendant 30 min à 4 000 x g à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.</li>
	<li>Recueillir le liquide surnageant dans les tubes de l’ultracentrifugation et centrifuger les échantillons pendant 60 min à 10 000 x g à 4 ° C pour éliminer les grosses particules cellulaires.</li>
	<li>Transférer le liquide surnageant dans de nouveaux tubes coniques, puis filtrer les échantillons par le biais de 0,2 µm-filtre de seringue pour enlever le restant des particules plus grosses.</li>
	<li>Prélever des échantillons dans des tubes de l’ultracentrifugation et équilibrer les tubes. Centrifuger les échantillons pendant 2 h à 140 000 x g à 4° C pour granuler les exosomes. Remarque : La taille des exosomes varie de 20 à 200 nm. 0,2 µm filtre est utilisé pour enlever les plus grosses particules qui sont plus de 200 nm de taille.</li>
	<li>Jeter les surnageants doucement. Dissoudre le culot avec 100 µL PBS ou solution de lyse et transfère exosomes des échantillons aux tubes de 1,5 mL et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Remarque : Microscope électronique en Transmission est recommandé de vérifier les exosomes isolés.</li>
	<li>Suivez l’échantillon standard de TEM protocole28de traitement. Analyser les exosomes des échantillons à l’aide de la microscopie électronique à transmission et prendre des images, balance bar 200 nm.</li>
</ol>3. préparation de miRNA et Performing miRNA-q-RT-PCR
Note : miRNA-q-RT-PCR est recommandé d’analyser le niveau d’expression des miARN.
<ol><li>Suivre le protocole d’isolement standard miRNAs et assurez-vous d’utiliser une quantité égale d’ARN purifié dans la transcription inverse monocaténaire24.</li>
	<li>Suivez le protocole standard de PCR en temps réel pour détecter les exosomal micro-ARN niveau liquide BAL. Utiliser des amorces PCR en temps réel spécifiques contre miR-155, miR-146 a et ARNsn U6. Exécutez la réaction PCR avec l’appareil PCR quantitative et normaliser les valeurs de l’expression de contrôle interne U6 snRNA. Remarque : Chaque groupe se compose des échantillons en triple24.</li>
</ol>4. les Exosomes d’étiquetage et de Purification
<ol><li>Suspendre les exosomes granule avec 100 µL de solution de suspension dans un tube en polypropylène de 1,5 mL, puis ajouter 0,4 µL du colorant exosomes dans l’autre tube avec 100 µL de la solution de suspension.</li>
	<li>Rapidement ajouter exosomes dans la solution à la solution de colorant et bien mélanger en pipettant également. Conserver les échantillons pendant 5 min à température ambiante, protéger de la lumière.</li>
	<li>Mettre une colonne exosome dans un tube d’élution de 1,5 mL. Transférer le mélange de la solution vers le centre de la colonne à centrifuger exosome.</li>
	<li>Faire tourner la colonne pendant 2 min à 800 x g à la température ambiante.</li>
	<li>Jeter la colonne et conserver l’échantillon éluée à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>5. validation des Exosomes Up prises par cellules réceptrices
<ol><li>Graines de 1 x 104 MLE 12 virus dans une lame de 8 puits chambre et des cellules de culture à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Ajouter 10 µL fluorescent-étiquetées exosomes aux cellules. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.</li>
	<li>Retirez les supports de culture et laver les cellules avec du PBS, puis fixer les cellules avec paraformaldéhyde à 1 % pendant 10 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Montez la diapositive dans le milieu de montage au DAPI.</li>
	<li>Analyser des échantillons par un microscope à fluorescence et prendre des photos, un grossissement de 40 X.</li>
</ol>6. vérification de l’Interaction entre les Exosomes et cellules réceptrices
<ol><li>Graine 2 x 105 MLE12/puits dans une plaque de culture de 12 puits contenant le milieu de culture approprié et des cellules de culture à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Ajouter 20 µg exosomes de fluide de souris BAL à cellules MLE12 et mettre en place les répétitions par groupe expérimental.</li>
	<li>24 h plus tard, laver les cellules avec du PBS et ajouter 600 µL de tampon de lyse dans le puits. Agiter la plaque doucement et recueillir des échantillons de lyse en tube 1,5 mL avec la pipette.</li>
	<li>Suivre le protocole standard d’isolement du RNA total et protocole de transcription inverse d’ADNc, complète l’ADNc monocaténaire transcription réverse29.</li>
	<li>Suivez le protocole standard de PCR en temps réel pour détecter le niveau d’expression ARNm dans les cellules réceptrices29. Utiliser des amorces PCR en temps réel spécifiques contre le TNF-α, IL-6 et ZO-1. Exécutez des réactions de PCR avec les appareils PCR quantitatives et normaliser les valeurs de l’expression au contrôle interne GAPDH. Remarque : Chaque groupe se compose d’échantillons en triple.</li>
</ol>

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Ce travail a été soutenu par examen du mérite VA 2I01BX001786-06A1 financement de RS.

Modèles murins de maladies sont couramment utilisés pour évaluer la fonction physiologique des gènes spécifiques et de réduire le coût de l’expérimentation2. La lésion pulmonaire septique aiguë décrite ici imite la réponse inflammatoire chez les humains avec SDRA. Ce modèle est pertinent pour étudier la pathogenèse moléculaire, développement de biomarqueurs et de tester de potentielles nouvelles thérapies5.
Des systèmes de co-culture sont pertine...

ALI et SDRA est les formes mortelles de l’insuffisance respiratoire avec hypoxémie sévère causée par un oedème pulmonaire non cardiogénique qui affecte environ 1 million de personnes de partout dans le monde chaque année1. L’étiologie de l’ARDS comprend atteinte directe aux poumons contre les infections ou aspiration et une variété d’injures indirectes. Ces dix dernières années, il y a eu une meilleure compréhension de la pathogenèse moléculaire de SDRA, cependant, des traitements spécifiques ciblés pour ARDS sont encore à être développé2,3.
Plusieurs modèles animaux de la lésion pulmonaire aiguë ont été développés qui fournissent un pont pour la traduction des traitements expérimentaux pour les études humaines4,5. Les modèles couramment utilisés incluent installation locale d’acide oléique, les bactéries, les LPS et la bléomycine. Autres approches incluent l’ischémie-reperfusion, perforation caecale ligature, lésion stretch induite par la ventilation mécanique, hyperoxie ou administration systémique de bactéries et de LPS5. Ces modèles offrent un système biologique utile pour tester des hypothèses cliniques et pour le développement des thérapies potentielles. Pour simuler le SDRA humaine, modèles animaux doivent reproduire l’inflammation et des lésions aiguës aux cellules épithéliales et endothéliales présentant des défauts en fonction de la barrière dans les poumons.
Exosomes sont des vésicules de la membrane avec 20-200 nm de diamètre, dont le contenu moléculaire contient des protéines, ADN, ARN et lipides, et faciliter les communications inter-cellulaires dans le microenvironnement des tissus par transfert de composition moléculaire. Exosomes sont sécrétées par différents types de cellules comme les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses et les cellules tumorales et existent en liquide de corps humain. Études indiquent que les exosomes réglementer la diaphonie entre les cellules immunitaires et les cellules du stroma au cours des maladies inflammatoires infectieuses et stériles, et leur libération anormale semble être régulés par divers stimuli naturels et expérimentales au cours physiologique et les processus pathologiques6. Tel réseau de communication peut-être jouer un rôle important dans la pathogenèse des maladies pulmonaires et peut affecter la progression physiopathologiques7,8. Sous le nom de 18-22 nucléotides ARN non codants, miRNAs existe dans les tissus et fluides corporels, plasma, sérum et module l’expression de l’ARNm à post-traductionnelles niveau9,,10.
MiARN emballés dans les exosomes influence la différenciation et la fonction des différents types de cellules, et des niveaux excessifs sont associées à une variété de maladies, y compris le cancer, maladies pulmonaires, obésité, diabète et maladies cardiovasculaires11, 12,13,14,15,16. Entrée dans les cellules réceptrices et faire la navette des miARN exosomal faciliter les communications intercellulaires modifiant l’hémostase du microenvironnement17,18. Lésion pulmonaire aiguë est un processus complexe, faisant intervenir plusieurs types de cellules avec une vaste communication intercellulaire à exosomes8. miR-155 et miR-146 a partagent le mécanisme de régulation transcriptionnel commun et contribuent à la réponse inflammatoire et de la tolérance immunitaire19,20. Des études récentes indiquent que les deux modulent la réponse inflammatoire via exosomal miARN faisant la navette entre cellules immunitaires21. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets modulateurs des miARN exosomal sur réponse alvéolaire à l’endotoxine demeurent obscures, sans aucun doute la pertinence clinique potentielle et le translationnelle implication mérite un complément d’enquête.
Modèles de co-culture sont utilisées pour définir l’interaction entre les types de cellules spécifiques dans l’environnement complexe, tels que l’inflammation et le cancer22,23. Ces plates-formes fournissent une autre stratégie pour interroger la diaphonie entre les types de cellules en particulier pour les cellules immunitaires et structurels.
Intra-trachéale, administration en aérosol, intrapéritonéale ou systémique de LPS sont largement utilisés pour induire pulmonaire expérimentale blessure24,25,26et ont montré pour induire la perméabilité épithéliale et endothéliale les défauts. Ici nous utilisons intrapéritonéales LPS pour induire un modèle septique de lésion pulmonaire aiguë chez les souris. Dans les 24h de l’administration intrapéritonéale de LPS, défauts de perméabilité sont induites dans les poumons avec le recrutement des cellules inflammatoires. En outre, nous montrons qu’exosomes de BAL contiennent miRNA-155 et miR-146 a, et induire des exosomes de LBA expression de cytokines pro-inflammatoires dans les cellules épithéliales bénéficiaires, y compris l’IL-6 et TNF-α. Ces données sont les premiers à montrer qu’exosomal miARN sont sécrétées en BAL dans ce modèle de lésion pulmonaire septique aiguë.

<table><tbody><tr><td>lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055 :B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA kit d’isolement</td><td>Thermo Fisher</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) amorce</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) amorce</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>U6snRNA amorce</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha ;( Mm00443258_m1 ) apprêt</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1&nbsp ; &nbsp ; )amorce</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp ; )amorce</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>milieu essentiel minimal (MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Solution Trysin-EDTA (0,05 %)</td><td>Les</td> exosomes <td>25300054</td><td></td>Thermo Fisher</tr><tr><td>ont été marqués avec PKH67 à travers le mini kit de liaison de cellules fluorescentes vertes PKH67&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Exosome Spin Columns (MW3000)</td><td>Thermo Fisher</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifugeuse&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger ultra-clairs</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Système de PCR rapide en temps réel</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopes électroniques à transmission (TEM)</td><td>JEOL Ltd</td><td>120 kV TEM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Olympus BX41 Olympus</td><td></td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

lavage broncho-alvéolaire exosomes en lésion induite par le lipopolysaccharide septique pulmonaire

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Lésion pulmonaire aiguë (ALI) et syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) représentent un groupe hétérogène de maladies pulmonaires qui continue d’avoir un taux élevé de morbidité et de mortalité. La pathogenèse moléculaire d’ALI sont mieux définis ; Toutefois, en raison de la complexité de la maladie thérapies moléculaires doivent encore être développées. Ici, nous utilisons un modèle de souris induite de lipopolysaccharides (LPS) de la lésion pulmonaire septique aiguë afin de délimiter le rôle des exosomes dans la réponse inflammatoire. En utilisant ce modèle, nous avons été en mesure de démontrer que les souris qui sont exposées aux LPS intrapéritonéales sécrètent exosomes dans le liquide de lavage (BAL) Broncho-alvéolaires des poumons qui sont emballés avec miRNA et cytokines qui régulent la réponse inflammatoire. En utilisant un système de modèle de culture mixte, nous montrons que les exosomes libérés des macrophages perturber l’expression des protéines de jonction serrées dans les cellules épithéliales bronchiques. Ces résultats suggèrent que la diaphonie 1) entre les cellules immunitaires et structurels innées grâce à la navette d’exosomal contribuent à la réponse inflammatoire et rupture de la barrière physique et 2) ciblant ces miARN peut fournir une nouvelle plate-forme pour traiter ALI et SDRA.

Pour provoquer des lésions pulmonaires septiques, les souris ont été traitées avec le LPS intrapéritonéales (15 mg/kg). Dans les 24h de l’administration de LPS, afflux de neutrophile a été observé dans les poumons, comme illustré dans la Figure 1 a. Souris LBA a été dessiné, suivie par l’isolement et la purification des exosomes. Morphologie des exosomes BALF a été confirmée par microscopie électronique à transmission (Figure 1 b...

Des souris exposées aux LPS intrapéritonéales sécrètent des exosomes dans le liquide de lavage (BAL) Broncho-alvéolaire qui sont emballés avec les miARN. À l’aide d’un système de culture mixte, nous montrons que les exosomes libérés dans le liquide BAL perturber l’expression des protéines de jonction serrées dans les cellules épithéliales bronchiques et augmenter l’expression des cytokines pro-inflammatoires qui accentuent les lésions pulmonaires.

Lavage broncho-alvéolaire Exosomes en lésion induite par le Lipopolysaccharide septique pulmonaire

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

L’objectif global de cette expérience est de délimiter le rôle des exosomes dans les réponses inflammatoires dans un modèle murin de lésions pulmonaires septiques aiguës induites par le LPS. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés liées à la diaphonie cellulaire dans les lésions pulmonaires aiguës et le syndrome de détresse respiratoire aiguë. En particulier la communication intercellulaire au sein de l’environnement alvéolaire-micro via la navette d’exosomes.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler et de caractériser des exosomes de lavage broncho-alvéolaire hautement purifiés dérivés de souris septiques traitées à l’endotoxine et présentant une lésion pulmonaire aiguë. La démonstration de la procédure est assurée par le Dr Zhihong Yuan et le Dr Chetna Bedi. Pour commencer, chargez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 avec 0,1 millilitre de LPS et de PBS par souris et retenez manuellement la première souris mâle C57 black 6J âgée de six à huit semaines.Administrez le LPS par voie intra-péritonéale et retournez l’animal dans sa cage. 24 heures plus tard, faites une incision de cinq millimètres au centre du cou du premier animal et utilisez une pince émoussée pour séparer doucement les muscles afin d’exposer la trachée. Ensuite, insérez doucement une aiguille de calibre 27 attachée à une seringue stérile de 10 millilitres dans la trachée et injectez un millilitre de PBS stérile.Remplacez alors immédiatement la seringue de 10 millilitres par une seringue de trois millilitres équipée d’une nouvelle aiguille de calibre 27. Aspirez le liquide de lavage broncho-alvéolaire ou BOLF et ajoutez-le dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace correctement étiqueté. Pour isoler les exosomes, centrifugez les échantillons BOLF et transférez les surnageants dans de nouveaux tubes de 15 millilitres.Centrifugez à nouveau les échantillons et transférez les surnageants dans des tubes à ultra-centrifuger pour éliminer les plus grosses particules cellulaires. Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes coniques et chargez les échantillons dans des filtres à seringue de 0,2 micron pour éliminer toutes les particules plus grosses restantes. Ajoutez les échantillons filtrés dans de nouveaux tubes à ultra-centrifuger pour granuler les exosomes.Jetez soigneusement les surnageants et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de PBS par tube. Transférez ensuite les échantillons d’exosomes dans des tubes individuels de 1,5 millilitre pour leur stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour purifier les exosomes, ajoutez 0,4 microlitre du colorant d’exosome approprié dans un tube contenant 100 microlitres de solution en suspension par échantillon et ajoutez rapidement un échantillon d’exosome décongelé dans chaque tube de colorant.Mélangez soigneusement les exosomes avec le colorant et incubez les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, placez une colonne de spin d’exosome par échantillon dans un tube d’illusion de 1,5 millilitre et transférez les solutions d’exosomes au centre de chaque colonne de spin. Ensuite, centrifugez les échantillons, jetez les colonnes et stockez les échantillons mentionnés à moins 20 degrés Celsius.Pour mesurer l’absorption d’exosomes par les cellules réceptrices, ensemencez d’abord une fois 10 à la quatrième épithéliale pulmonaire de souris 12 cellules dans 0,5 millilitre de milieu dans chaque puits d’une lame de chambre à huit puits pour une culture de 16 heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Après la décongélation, ajoutez 10 microlitres d’exosomes purifiés marqués fluorescents dans chaque puits et retournez les cultures cellulaires dans l’incubateur pendant une heure. À la fin de l’incubation, laver les cellules avec du PBS et fixer chaque co-culture avec 1 % de paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante.Retirez le fluide, puis montez la lame avec un support complété par du DAPI et imagez les échantillons par microscopie à fluorescence avec un grossissement de 40 fois. Pour vérifier l’interaction des exosomes avec les cellules réceptrices, ensemencez deux fois 10 cellules de l’épithélium pulmonaire de la cinquième souris dans deux millilitres de milieu par puits dans une plaque de culture à 12 puits contenant le milieu de culture approprié pour une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, ajoutez 20 microgrammes d’exosomes à trois puits de cellules épithéliales par groupe expérimental et retournez les cellules dans l’incubateur.Après 24 heures, retirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez 600 microlitres de tampon de lyse dans chaque puits en secouant doucement. Ensuite, transférez tout le contenu de chaque puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre et analysez les échantillons selon les protocoles PCR standard en temps réel. Dans les 24 heures suivant l’administration du LPS, un afflux de neutrophiles est observé dans les poumons des animaux traités au LPS.Après leur isolement et leur purification comme nous venons de le démontrer, la présence d’exosomes dans le BOLF provenant d’animaux atteints de lésions pulmonaires septiques peut être confirmée par microscopie électronique à transmission. L’expression de certains micro-ARN pro-inflammatoires est significativement augmentée dans les exosomes du liquide broncho-alvéolaire d’animaux traités au LPS par rapport aux souris contrôlées traitées au PBS. Les exosomes traités au LPS sont absorbés par les cellules épithéliales des bronchioles de souris, comme en témoigne la co-localisation d’exosomes marqués par un colorant fluorescent avec des cellules marquées au DAPI après une heure de co-culture.L’expression du médiateur pro-inflammatoire est significativement augmentée dans les cellules épithéliales co-cultivées avec des exosomes d’animaux traités au LPS par rapport à la co-culture avec des exosomes de souris témoins traitées au PBS. De plus, les cellules traitées avec des exosomes de souris traitées au LPS présentent une expression significativement atténuée de la zonula occludens one par rapport aux témoins, indiquant une intégrité cellulaire moins intacte après co-culture d’exosomes traités au LPS. L’injection intra-péritonéale de LPS, l’extraction du lavage broncho-alvéolaire et la délégation d’exosomes du lavage broncho-alvéolaire toutes les étapes peuvent être réalisées dans un laps de temps relativement court.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la co-culture d’exosomes et de cellules épithéliales peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’interaction entre les cellules innées et structurelles dans le micro-environnement alvéolaire pulmonaire. La communication croisée entre les cellules immunitaires innées et structurelles via la navette des exosomes contribue à la réponse inflammatoire et à la rupture de la barrière structurelle, ce qui suggère que le ciblage des micro-ARN exosomaux peut fournir une plate-forme normale pour le traitement des lésions pulmonaires aiguës et du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire des lésions pulmonaires septiques chez la souris, d’isoler le liquide de lavage broncho-alvéolaire des souris, d’isoler les exosomes du liquide de lavage et d’utiliser un modèle de co-culture pour interroger la diaphonie intracellulaire.N’oubliez pas que travailler avec le LPS peut être dangereux et que des précautions telles que le port de l’équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Génétique

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

La réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d'exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.

L&#39;utilisation de l&#39;oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l&#39;hôte une réaction immunitaire chez la souris

Nous décrivons une méthode pour induire une inflammation pulmonaire neutrophile par défi pour lipopolysaccharide aérosol par nébulisation, pour modéliser une lésion pulmonaire aiguë. En outre, des techniques chirurgicales de base pour l'isolement du poumon, l'intubation endotrachéale et lavage broncho-alvéolaire sont également décrits.

Une méthode pour générer pulmonaire Neutrophilie Utilisation Aerosolized lipopolysaccharide

lavements pulmonaires répétées chez les porcs anesthésiés induisent des lésions pulmonaires ressemblant à des aspects importants du syndrome de détresse respiratoire aiguë humaine (SDRA). A cet effet, les poumons sont à plusieurs reprises lavaged avec 0,9% de solution saline à 37 ° C. L'objectif du protocole est une atténuation reproductible d'échange de gaz et hémodynamique pour la recherche dans le SDRA.

induite Lavage-Surfactant Épuisement dans Pigs comme un modèle de syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA)

L'état de santé du poumon se reflète dans le type et le nombre de cellules immunitaires présentes dans les bronchioles du poumon. Nous décrivons une technique de lavage broncho-alvéolaire qui permet l'isolement et l'étude de cellules non adhérentes et des facteurs solubles des voies respiratoires inférieures des souris.

Lavage bronchoalvéaire des poumons murins pour analyser l&#39;infiltration cellulaire inflammatoire

Nous décrivons ici les deux protocoles d’isolement vésicule extracellulaire, centrifugation d’ultrafiltration et ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité, d’isoler des vésicules extracellulaires des échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire murine. Les vésicules extracellulaires dérivés du murin de lavage bronchoalvéolaire par ces deux méthodes sont quantifiés et caractérisés.

Isolement des vésicules extracellulaires du murin lavage broncho-alvéolaire fluide à l’aide d’une Technique de Centrifugation de l’Ultrafiltration

Présenté ici est une procédure étape par étape pour induire des dommages aigus de poumon chez les souris par l'instillation intratracheal directe de lipopolysaccharide et pour effectuer l'analyse FACS des échantillons de sang, du fluide de lavage bronchoalveolar, et du tissu de poumon. L'invasivité minimale, la manipulation simple, la bonne reproductibilité, et la titration de la sévérité de la maladie sont des avantages de cette approche.

Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal

Les souris exposées à l’ozone et à l’endotoxine bactérienne combinées montrent une mort cellulaire largement répandue, y compris celle des neutrophiles. Nous avons observé des adaptations cellulaires telles que la rupture du lamellipodia cytosquelettique, l’expression cellulaire accrue de la sous-unité complexe de synthase de V ATP β et l’angiostatin dans le lavage broncho-alvéolaire, la suppression de l’immuno-réaction de poumon et le recrutement retardé de neutrophile.

Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS

Dans cette étude, une technique d’instillation endotrachéale non invasive a démontré le développement d’AL chez les rats à l’aide d’un laryngoscope basique pour garantir une livraison précise de LPS aux poumons. Le LPS est injecté via un tube endotrachéal à l’aide d’un laryngoscope. L’ampleur de la lésion pulmonaire est évaluée à plusieurs moments.

Administration endotrachéale non invasive de lipopolysaccharide pour induire une lésion pulmonaire aiguë chez les rongeurs

Ce protocole décrit un procédé pour transfecter efficacement ARNsi dans les cytotrophoblastes villeux humaines fraîchement isolées en utilisant la microporation et l'identification des complexes ADN-protéine dans ces cellules. Les cellules transfectées peuvent être contrôlées par Western Blot et des analyses EMSA pendant la période de culture de 4 jours.

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

Découvrez l'isolation d'exosomes du lavage broncho-alvéolaire chez des souris traitées au LPS pour étudier les mécanismes de lésion pulmonaire aiguë. Cette technique permet d'analyser la communication intercellulaire et les réponses inflammatoires.

Lavage broncho-alvéolaire Exosomes en lésion induite par le Lipopolysaccharide septique pulmonaire

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