Lavage broncho-alvéolaire Exosomes en lésion induite par le Lipopolysaccharide septique pulmonaire

Des souris exposées aux LPS intrapéritonéales sécrètent des exosomes dans le liquide de lavage (BAL) Broncho-alvéolaire qui sont emballés avec les miARN. À l’aide d’un système de culture mixte, nous montrons que les exosomes libérés dans le liquide BAL perturber l’expression des protéines de jonction serrées dans les cellules épithéliales bronchiques et augmenter l’expression des cytokines pro-inflammatoires qui accentuent les lésions pulmonaires.

L’objectif global de cette expérience est de délimiter le rôle des exosomes dans les réponses inflammatoires dans un modèle murin de lésions pulmonaires septiques aiguës induites par le LPS. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés liées à la diaphonie cellulaire dans les lésions pulmonaires aiguës et le syndrome de détresse respiratoire aiguë. En particulier la communication intercellulaire au sein de l’environnement alvéolaire-micro via la navette d’exosomes.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler et de caractériser des exosomes de lavage broncho-alvéolaire hautement purifiés dérivés de souris septiques traitées à l’endotoxine et présentant une lésion pulmonaire aiguë. La démonstration de la procédure est assurée par le Dr Zhihong Yuan et le Dr Chetna Bedi. Pour commencer, chargez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 avec 0,1 millilitre de LPS et de PBS par souris et retenez manuellement la première souris mâle C57 black 6J âgée de six à huit semaines.

Administrez le LPS par voie intra-péritonéale et retournez l’animal dans sa cage. 24 heures plus tard, faites une incision de cinq millimètres au centre du cou du premier animal et utilisez une pince émoussée pour séparer doucement les muscles afin d’exposer la trachée. Ensuite, insérez doucement une aiguille de calibre 27 attachée à une seringue stérile de 10 millilitres dans la trachée et injectez un millilitre de PBS stérile.

Remplacez alors immédiatement la seringue de 10 millilitres par une seringue de trois millilitres équipée d’une nouvelle aiguille de calibre 27. Aspirez le liquide de lavage broncho-alvéolaire ou BOLF et ajoutez-le dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace correctement étiqueté. Pour isoler les exosomes, centrifugez les échantillons BOLF et transférez les surnageants dans de nouveaux tubes de 15 millilitres.

Centrifugez à nouveau les échantillons et transférez les surnageants dans des tubes à ultra-centrifuger pour éliminer les plus grosses particules cellulaires. Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes coniques et chargez les échantillons dans des filtres à seringue de 0,2 micron pour éliminer toutes les particules plus grosses restantes. Ajoutez les échantillons filtrés dans de nouveaux tubes à ultra-centrifuger pour granuler les exosomes.

Jetez soigneusement les surnageants et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de PBS par tube. Transférez ensuite les échantillons d’exosomes dans des tubes individuels de 1,5 millilitre pour leur stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour purifier les exosomes, ajoutez 0,4 microlitre du colorant d’exosome approprié dans un tube contenant 100 microlitres de solution en suspension par échantillon et ajoutez rapidement un échantillon d’exosome décongelé dans chaque tube de colorant.

Mélangez soigneusement les exosomes avec le colorant et incubez les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, placez une colonne de spin d’exosome par échantillon dans un tube d’illusion de 1,5 millilitre et transférez les solutions d’exosomes au centre de chaque colonne de spin. Ensuite, centrifugez les échantillons, jetez les colonnes et stockez les échantillons mentionnés à moins 20 degrés Celsius.

Pour mesurer l’absorption d’exosomes par les cellules réceptrices, ensemencez d’abord une fois 10 à la quatrième épithéliale pulmonaire de souris 12 cellules dans 0,5 millilitre de milieu dans chaque puits d’une lame de chambre à huit puits pour une culture de 16 heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Après la décongélation, ajoutez 10 microlitres d’exosomes purifiés marqués fluorescents dans chaque puits et retournez les cultures cellulaires dans l’incubateur pendant une heure. À la fin de l’incubation, laver les cellules avec du PBS et fixer chaque co-culture avec 1 % de paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante.

Retirez le fluide, puis montez la lame avec un support complété par du DAPI et imagez les échantillons par microscopie à fluorescence avec un grossissement de 40 fois. Pour vérifier l’interaction des exosomes avec les cellules réceptrices, ensemencez deux fois 10 cellules de l’épithélium pulmonaire de la cinquième souris dans deux millilitres de milieu par puits dans une plaque de culture à 12 puits contenant le milieu de culture approprié pour une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, ajoutez 20 microgrammes d’exosomes à trois puits de cellules épithéliales par groupe expérimental et retournez les cellules dans l’incubateur.

Après 24 heures, retirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez 600 microlitres de tampon de lyse dans chaque puits en secouant doucement. Ensuite, transférez tout le contenu de chaque puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre et analysez les échantillons selon les protocoles PCR standard en temps réel. Dans les 24 heures suivant l’administration du LPS, un afflux de neutrophiles est observé dans les poumons des animaux traités au LPS.

Après leur isolement et leur purification comme nous venons de le démontrer, la présence d’exosomes dans le BOLF provenant d’animaux atteints de lésions pulmonaires septiques peut être confirmée par microscopie électronique à transmission. L’expression de certains micro-ARN pro-inflammatoires est significativement augmentée dans les exosomes du liquide broncho-alvéolaire d’animaux traités au LPS par rapport aux souris contrôlées traitées au PBS. Les exosomes traités au LPS sont absorbés par les cellules épithéliales des bronchioles de souris, comme en témoigne la co-localisation d’exosomes marqués par un colorant fluorescent avec des cellules marquées au DAPI après une heure de co-culture.

L’expression du médiateur pro-inflammatoire est significativement augmentée dans les cellules épithéliales co-cultivées avec des exosomes d’animaux traités au LPS par rapport à la co-culture avec des exosomes de souris témoins traitées au PBS. De plus, les cellules traitées avec des exosomes de souris traitées au LPS présentent une expression significativement atténuée de la zonula occludens one par rapport aux témoins, indiquant une intégrité cellulaire moins intacte après co-culture d’exosomes traités au LPS. L’injection intra-péritonéale de LPS, l’extraction du lavage broncho-alvéolaire et la délégation d’exosomes du lavage broncho-alvéolaire toutes les étapes peuvent être réalisées dans un laps de temps relativement court.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la co-culture d’exosomes et de cellules épithéliales peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’interaction entre les cellules innées et structurelles dans le micro-environnement alvéolaire pulmonaire. La communication croisée entre les cellules immunitaires innées et structurelles via la navette des exosomes contribue à la réponse inflammatoire et à la rupture de la barrière structurelle, ce qui suggère que le ciblage des micro-ARN exosomaux peut fournir une plate-forme normale pour le traitement des lésions pulmonaires aiguës et du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire des lésions pulmonaires septiques chez la souris, d’isoler le liquide de lavage broncho-alvéolaire des souris, d’isoler les exosomes du liquide de lavage et d’utiliser un modèle de co-culture pour interroger la diaphonie intracellulaire.

N’oubliez pas que travailler avec le LPS peut être dangereux et que des précautions telles que le port de l’équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.