Name: Méthodes pour l’étude de la régénération de Stentor (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez les méthodes pour cultiver Stentor coeruleus et induire sa régénération cellulaire par fragmentation et traitement au saccharose. Ces protocoles permettent d'étudier la biologie cellulaire et la cicatrisation au niveau unicellulaire.

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Ce travail a été soutenu par la subvention de NIH R01 GM113602 (WFM) et NSF 1144247 (AL). Nous reconnaissons Mark Slabodnick et Natalie Kirkland pour développer les versions initiales de certains de ces protocoles et informatives. Nous remercions Karina Perlaza et Greyson Lewis pour une lecture critique du manuscrit.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Culture de Stentor présente un certain nombre de défis. Tout d’abord, pour réaliser des expériences qui nécessitent un grand nombre de cellules, il faut maintenir un grand nombre de cultures de Stentor , en tant que cultures devenus insalubres lorsque la concentration de Stentor dépasse 20 cellules/mL. Deuxièmement, les organismes qui peuvent contaminer les cultures de Stentor souvent divisent plus rapidement que Stentor et submergent la culture (un contaminant commun est rotifères). Ainsi, il est nécessaire d’inspecter la culture sous un microscope périodiquement et de supprimer les contaminants. Occasionnellement, une nouvelle culture doit être démarré à partir d’un petit nombre de cellules a sauvé manuellement d’une culture contaminée. Cela augmente le temps nécessaire pour maintenir les cultures saines de Stentor . Troisièmement, l’expansion une cellule unique dans une culture de 400 mL exige au moins un mois parce que Stentor cell cycle est de 3 à 5 jours. Quatrièmement, contrairement à d’autre modèle ciliés, Stentor rarement entrer dans la forme de kyste et ils ne peuvent pas être figés.
Un aspect important de la culture de Stentor est la sélection d’un organisme d’une alimentation appropriée. Diverses méthodes de culture de Stentor ont été décrites précédemment. L’un d’eux suggère d’utiliser du lait écrémé pour des bactéries de culture qui se nourrissent alors de Stentor. Cette technique est efficace dans la mise en culture de Stentor; application de techniques génomiques exige toutefois des échantillons purs pour éviter la confusion résultant de la génomique se lit d’organismes alimentaires non défini. En utilisant le protocole actuel, Stentor peuvent être cultivés en masse et, parce que leur nourriture, Chlamydomonas, a été séquencé, la présence de contamination génomique de l’Organization de nourriture peut être détectée et contrôlée pour. Pour des raisons inconnues, tartare dû reconstituer ses stocks en retournant à où il a trouvé Stentor avant. Avec le protocole actuel, nous avons pu garder de Stentor pour années.
Expériences de régénération avec Stentor sont généralement simples, mais il y a quelques détails essentiels à garder à l’esprit. En ce qui concerne l’article 2, coupe de Stentor dans la moitié des cellules peuvent être maîtrisées en quelques minutes. Maîtriser les procédures de microchirurgie plus avancées de Stentor peut exiger une semaine de pratique. Tout en effectuant un traitement de saccharose ou de l’urée (Section 3), si au début de l’imagerie, la plupart des cellules ont encore leurs bandes membranellar, augmenter le temps d’incubation de 10 à 30 s pour quand le traitement de saccharose est effectué ensuite. N’augmentez pas le temps de traitement de saccharose au-delà de 3 min d’incubation parce qu’elle se traduira par la mort des cellules.
Imagerie de Stentor régénération exige des méthodes pour les grosses cellules image sur de longues périodes de temps. La méthode d’imagerie, détaillée dans la Section 4 peut seulement être utilisée avec un microscope vertical. Si un microscope inversé est disponible au lieu de cela, des cellules peuvent être placés sur une diapositive ou une lamelle couvre-objet en petites chambres. Une méthode consiste à créer une chambre de gelée de pétrole et de la couverture avec une autre lamelle couvre-objet pour éviter l’évaporation. Par ailleurs, une chambre pour une cellule individuelle peut être faite en faisant un trou avec un poinçon de trou de la taille souhaitée en 1 x 1 cm2 carrés de l’entretoise de silicium (Table des matières), placer l’entretoise sur un lamelle couvre-objet, mettre des cellules dans la chambre et couvrant la chambre avec une autre lamelle. Quand l’imagerie, si Stentor ne sont pas dans le bon sens à observer les caractéristiques de chacune des étapes de la régénération, taper la plaque fermement pour rendre le contrat de la cellule. Regardez la cellule étendre afin d’identifier la phase de régénération (extension complète prend environ 45 s). Si la cellule est toujours dans la mauvaise orientation, répéter la mise sur écoute. Les images montrées dans la Figure 1 et Figure 6 ont été prises par un microscope stéréo zoom ; Cependant, toutes les expériences détaillées peuvent être effectuées à l’aide d’un 5 X binoculaire stéréo.
Un autre défi en plus de culture et d’imagerie de Stentor est le suivi de la régénération, plus précisément la quantité de temps nécessaire pour identifier les étapes. Si la régénération cellulaire est parfaitement orientée avec la région du primordium orale bien visible, identification de l’étape prend quelques secondes. Parfois, cependant, la cellule de Stentor est dans une orientation empêchant l’attribution précise des stade de régénération, ainsi prendre plus de temps à identifier. La quantité importante de temps nécessaire au stade des cellules régénératrices individuelles pourraient retarder la quantification des rejets de toutes les cellules régénératrices, diminuant ainsi la précision temporelle de la mise en scène et exiger l’observateur d’attendre et de recréer l’image sur la cellule après qu’il a déménagé à une nouvelle orientation. Par conséquent, cette expérience est temps et demande beaucoup de travail. Pour ces raisons, il serait hautement souhaitable d’élaborer des méthodes automatisées pour détecter les cellules de Stentor et assignant les étapes de la régénération de données vidéo microscopie. Il permettrait aussi d’autres expériences reproductibles, augmente dans la taille de l’échantillon et l’enlèvement de partialité humaine.
L’émergence de méthodes génomiques et protéomiques hautement sensibles a commencé à mettre des études des cellules individuelles dans reach. Pour ces analyses unicellulaires, la taille géante d’une cellule de Stentor permet un cobaye souhaitable pour des expériences de validation. Pour de telles expériences possible, cultivant Stentor est fondamentale, et si les méthodes décrites ici devraient jouer un rôle dans le développement de techniques plus avancées de cellule unique.

Les cellules ne sont pas simples sacs d’enzymes, mais plutôt très complexes machines dont les composants sont soigneusement mis à l’échelle à la bonne taille et disposés dans des positions bien définies. La morphogénèse des cellules individuelles représente un processus clé dans la cellule et de la biologie du développement, mais son mécanisme moléculaire est inconnu1,2. Alors que certaines des cellules ressemblent à des objets BLOB, organismes unicellulaires peuvent avoir extrêmement compliquées architectures, illustrées par les patrons corticales complexes chez les ciliés3,4.
Peut-être l’exemple le plus extrême d’une cellule très structurée est Stentor coeruleus, un géant eurytèles cilié vaguement apparenté à Tetrahymena et Paramecium. Stentor est 1 mm de long et est recouvert de plus de 100 bandes longitudinales de pigment bleu alternant avec des rangées de cils organisés par piles parallèles de rubans de microtubules qui courent le long de toute la cellule. La cellule est en forme de trompette (Figure 1), avec une bande de membranellar et un appareil oral (OA) à son extrémité antérieure et un pied qui s’adapte sur la cellule du substrat à son extrémité postérieure. En plus de la polarité de claire antéro-postérieur, la cellule montre également une structuration chirale distincte, tels que l’espacement entre les lignes ciliaires progressivement augmente dans le sens horaire. Cela se traduit par une discontinuité à l’intersection de la ligne plus étroite la ligne plus large et cette région de la surface cellulaire, connu comme le locus de contraste rayure, peut induire la formation de la deuxième série de structures de l’extrémité antérieure lorsque greffé sur une autre cellule5, ce qui en fait officiellement équivalent à organisateur de Spemann. Ainsi, tous les principaux processus de biologie du développement ont leurs analogues dans Stentor: axiation formation du patron et induction. Dans un embryon, ces processus sont conduits par des différences de destin entre différentes cellules, mais à Stentor, ils doivent être pilotées par des différences de destin entre les différentes régions au sein d’une seule cellule. Ce qui définit les différences entre les régions au sein de Stentor est un mystère.
Si une partie quelconque de Stentor est coupée, la pièce manquante de la cellule peut se régénérer pour produire une cellule normale en quelques heures. Si une cellule est coupé de moitié, ou même en très petits morceaux, chaque pièce se réorganise dans une cellule d’apparence normale mais en plus petite et restaure bonne proportionnalité entre cellule pièces6,7. Même de petits fragments, 1/64ème la taille de la cellule d’origine, sont capables de se régénérer dans une cellule petite mais normalement proportionnée et puis passer à la taille6. Stentor a ainsi présente une occasion unique d’étudier les mécanismes des organites taille mise à l’échelle et la cellule de régulation de la croissance en utilisant des méthodes chirurgicales qui sont généralement appliqués au niveau des tissus ou des organismes entiers.
Une des propriétés de Stentor qui lui permet de se régénérer d’un large éventail d’opérations chirurgicales est qu’elle contient un seul nodulées macronucleus (Figure 1) avec environ 50 000 copies du génome entier8. Tant qu’un fragment de cellule contenait au moins un nœud macronucléaire, il a la capacité de se régénérer complètement. Une autre propriété qui sous-tendent la capacité de régénération de Stentorest sa prodigieuse capacité de cicatrisation. Bien que plusieurs types de cellules sont capables de guérir leurs blessures9, Stentor est capable de récupérer d’une gamme extraordinaire de perturbations physiques. Un exemple de Stentor rétablissement après une perturbation radicale, ainsi que les méthodes de visualisation des flux cytoplasmique dans Stentor10 ont été rapportées. Ces méthodes permettent l’étude de l’effet de régénération comment blessant et suivantes de l’état physique du cytoplasme.
La taille énorme de stentor, la capacité de régénération extraordinaire et le fait qu’elle manifeste beaucoup des phénomènes du développement chez les embryons multicellulaires (tels que les organisateurs, axiation et structuration) a attiré de nombreux biologistes du développement au cours de le tournant du siècle dernier, dont Thomas Hunt Morgan7. Durant les années 50 et 60, les approches microchirurgicales face a montré un tableau saisissant des processus régénératifs et morphogénétiques dans cet organisme unicellulaire11. Toutefois, Stentor a été développé comme un système modèle de biologie moléculaire que récemment. Au cours des dernières années, le génome de Stentor a été séquencé et assemblé8, et la méthode pour perturber l’expression des gènes à l’aide d’Arni en se nourrissant était développé12.
Une des raisons que Stentor a été transformé en un organisme modèle pour la biologie moléculaire moderne seulement récemment était la difficulté de plus en plus de grandes cultures en raison de son long cycle de cellules (3 à 5 jours). Cependant, les méthodes modernes de génomiques et protéomiques nécessitent moins de matériel qu’ils ont utilisé pour, et le volume d’une seule cellule de Stentor est suffisant pour ces méthodes, même sans recourir à des méthodes ultrasensibles qui ont été développées pour l’analyse du single cellules qui sont plus petits que Stentor. L’article 1 du protocole détaille la procédure pour l’établissement d’une grande culture d’une seule cellule de Stentor . La même approche peut servir à établir une culture grande d’un fragment de cellules obtenue en coupant une cellule. Article 1er stipule également les lignes directrices pour le maintien des cultures saines de Stentor sur de longues périodes de temps. Article 2 du protocole prévoit la méthodologie induisant la régénération cellulaire en coupant les cellules manuellement avec une aiguille de verre. L’article 3 du protocole est dédié à deux méthodes d’induction de la régénération des structures de cellule spécifique (membranellar band et oral appareils) : traitant les cellules avec saccharose ou urée conduit à l’effusion de ces structures, suivies de leur régénération. L’article 4 du protocole détaille une méthode pour l’imagerie de cellules régénératrices individuelles sur de longues périodes de temps. L’article 4 se termine par la description des phases de régénération et de conseils sur l’analyse de la dynamique de la régénération.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus culture vivante</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii sur gélose</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Eau de source pasteurisée, bouteille de 1 litre</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose, 1500</td><td>cP Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’appoint en verre Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Récipient en verre à large ouverture avec bouchon à vis, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>Récipient en verre de 2 tasses avec couvercle en verre</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>Matériau en feuille de silicone</td><td>CultureWell Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation Posi-Click 1,7 mL</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Milieu de croissance, optimisé pour la culture Chlamydomonas</td><td>Espaceur</td> en silicone ThermoFisher <td>A1379801</td><td></td></tr>, <tr><td>feuille de silicone CultureWell, 0,25 mm d’épaisseur/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Pétrolate, vaseline, spectre blanc</td><td></td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires en verre borosilicate. OD : 1,2 mm, ID : 0,9 mm, longueur : 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, microscope stéréo zoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes pour l’étude de la régénération de stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Les cellules doivent être capables de régénérer leurs pièces à récupérer des perturbations externes. Les unicellulaires ciliés Stentor coeruleus est un organisme d’excellent modèle pour étudier la cicatrisation et la régénération des cellules suivantes. Le génome de Stentor est devenu disponible récemment, ainsi que les méthodes de la biologie moléculaire moderne, tels que l’ARNi. Ces outils permettent d’étudier la régénération de cellules individuelles au niveau moléculaire. La première section du protocole couvre des cultures de cellules de Stentor établissant des cellules individuelles ou des fragments de cellules, ainsi que des directives générales pour le maintien des cultures de Stentor . Culture de Stentor en grande quantité permet l’utilisation des outils précieux comme la biochimie, séquençage et spectrométrie de masse. Les sections suivantes du protocole couvrent différentes approches pour induire la régénération à Stentor. Couper manuellement les cellules avec une aiguille de verre permet d’étudier la régénération des pièces de grandes cellules, tout en traitant les cellules avec saccharose ou urée permet d’étudier la régénération de structures spécifiques, situé à l’extrémité antérieure de la cellule. Une méthode d’imagerie des cellules régénératrices individuelles est fournie, ainsi qu’une rubrique pour la mise en scène et l’analyse de la dynamique de la régénération. L’ensemble du processus de régénération est divisé en trois étapes. En visualisant la dynamique de la progression d’une population de cellules à travers les étapes, l’hétérogénéité dans la distribution de la régénération est démontrée.

Cultures de Stentor ont été mis en place et maintenus à partir de cellules individuelles ou des fragments de cellules à l’aide de l’article 1 du protocole fiable. Un exemple représentatif d’une culture saine grand est sur la vidéo 1.
L’évolution temporelle de la régénération a été mesurée à Stentor , à l’aide de la méthode de traitement de saccharose pour lancer la régénération décrite à l’étape 3.1, combiné avec l’imagerie et la méthode d’analyse a examiné à la Section 4 (Figure 7). Ce diagramme indique qu’il y a un écart d’un heure-long dans le temps par la population de cellules pour atteindre n’importe quel stade particulier. Ce type d’analyse permet l’étude de l’hétérogénéité temporelle dans le processus de régénération dans une population de régénération des cellules.
Ce qui suit est un résumé des propos de régénération qui a été observée à ce jour après des dizaines de traitements de saccharose (Figure 4 et Figure 6). Étape 1 est quand des cellules de Stentor ressemblent teardrops sans n’importe quelle bande de membranellar (cette étape démarre immédiatement après le lavage de saccharose). Cette étape dure de 3 à 6 h. Stage 2 est quand une bande de membranellar apparaît et développe (3 à 6 h après traitement de saccharose). Cette étape dure de 3-4 h. stade 3 est quand un primordium orale apparaît à l’extrémité postérieure de la bande de membranellar (6-8 h après traitement de saccharose), et les deux structures sont déplacés vers l’extrémité antérieure de la cellule. Cette étape dure pendant 1-2 h. Lorsque les bandes membranellar et l’appareil oral atteint l’extrémité antérieure de la cellule, ceci indique la fin de la régénération. La cellule a adopté la forme caractéristique de trompette comme Stentor . Les cellules sont complètement régénérée 8-9 h après traitement de saccharose.
<img alt="Diagramme de paramécie avec bande membraneuse, appareil buccal, vacuole alimentaire, macronoyau marqué." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> La figure 1. Instantané de Stentor. La bande de membranellar et de l’appareil par voie orale est indiqués à l’extrémité antérieure de la cellule. Le pied est à l’extrémité postérieure de la cellule. Macronucleus Stentor est nodulés. Un bien nourris, Stentor a verts alimentaire vacuoles contenant principalement Chlamydomonas. Barre d’échelle est 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Configuration du microscope de dissection ; lame de verre avec spécimen de Stentor pour observation dans la recherche en biologie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Réglage de coupe Stentor . Coupe de la cellule est réalisée en manipulant manuellement une aiguille de verre tout en regardant la cellule à l’aide d’un microscope stéréo dissection disponible dans le commerce. Le papier de soie vise à fournir le fond blanc pour voir les cellules mieux. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Séquence microscopique de cellules en division, étiquetée A-F, montrant les étapes du processus mitotique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> La figure 3. Instantanés de 3 vidéo illustrant comment couper un Stentor avec une aiguille de verre. (A) A Stentor immédiatement avant que l’aiguille touche il. (B) un Stentor a légèrement coincé entre une lame de verre et l’aiguille. (C) A contracté de Stentor en réaction à la force de l’aiguille. (D) A Stentor à couper en appuyant doucement sur la cellule avec le côté de l’aiguille. (E) A Stentor maintenant coupé en deux, mais pas séparés. Deux fragments de Stentor (F). Barre d’échelle est 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma du processus de régénération de Stentor avec étapes de choc saccharose/urée, tubes de centrifugation, étages cellulaires." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Visualisation schématique de l’article 3 et article 4 du protocole. Il s’agit d’un protocole illustré pour l’exécution de saccharose ou de traitement d’urée et d’observation de la régénération cellulaire. L’heure indiquée dans le panneau inférieur est mesurée depuis le début du cycle de lavage 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Configuration du microscope de dissection, plaque de spot à 9 puits, analyse de la réaction des micro-gouttelettes, étude optique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Le programme d’installation pour l’observation d’imagerie et/ou directe de régénération avec un microscope vertical. Dans chaque goutte de 4 µL suspendus de la lamelle couvre-objet, il y a une cellule en cours de régénération. L’eau dans les puits de la plaque de verre spot limite l’évaporation des gouttelettes. Cette configuration permet à la suite de la régénération des cellules multiples en parallèle. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse de la structure cellulaire végétale ; images microscope A-E ; Mettre l’accent sur les variations de morphologie cellulaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> La figure 6. Instantanés de Stentor dans chaque étape de la bande de membranellar et la régénération de l’appareil buccale. (A) phase 1 se caractérise par une forme de larme cellule et l’absence de la bande de membranellar. (B) stade 2 se caractérise par l’apparition de la bande de membranellar, une structure axée sur les cils qui bat en permanence. Membranellar bandes sont marqués avec des lignes pointillées blanches en panneaux B - D. (C et D) étape 3 se caractérise par l’apparition du primordium orale (marqué d’une flèche). Primordium oral ressemble à une invagination à l’extrémité postérieure de la bande de membranellar. Le primordium orale sera ensuite vers le haut vers la partie antérieure de la cellule pour devenir l’appareil oral. (E) la régénération est terminée lorsque la cellule a adopté la caractéristique forme trompette Stentor et l’appareil oral (marqué d’une flèche) s’est élargi à l’extrémité antérieure de la cellule. Barre d’échelle est 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphique à barres de distribution des étages cellulaires, temps post-choc saccharose, affichant quatre étapes sur 9 heures." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figure 7. Empilés affichage de boîte intrigue comment les proportions des cellules à tous les stades de la régénération après traitement de saccharose change au fil du temps. Le graphique montre l’hétérogénéité du calendrier des étapes de la régénération dans une population de cellules régénératrices. « Reg » indique l’achèvement de la régénération. Le nombre de cellules : 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Bécher avec culture d’algues vertes pour l’étude de la photosynthèse dans une expérience en laboratoire." src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 1"> Vidéo 1. Exemple d’une culture de Stentor en bonne santé. En règle générale, si une culture est-ce concentré, fractionnement de la culture est recommandée. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>
<img alt="Goutte au microscope ; étude de la tension superficielle du liquide ; méthode de microscopie ; l’analyse pédagogique." src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 2"> Vidéo 2. Ralentissement de Stentor avec la méthylcellulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>
<img alt="Image microscopique d’une installation microfluidique, mettant en évidence le positionnement des gouttelettes sur un fil mince." src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 3"> Vidéo de 3. Coupe Stentor. Les cellules individuelles peuvent être coupés manuellement en plusieurs morceaux sous une stéréo binoculaire en appuyant sur une aiguille de verre à travers la cellule. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problème avec la culture</td>
			<td>Recours possible</td>
			<td>Prévention possible</td>
		</tr>
<tr>
<td>La culture est submergée par les rotifères ou d’autres grands organismes.</td>
			<td>Eliminez autant de Stentor que possible dans une autre boite de culture. Puis laver les cellules trois fois.</td>
			<td>Laver soigneusement les Stentor lors de la réception, même quand leur achat auprès d’un fournisseur commercial.</td>
		</tr>
<tr>
<td>La culture est submergée par les champignons ou autres petits organismes.</td>
			<td>Identifier un coin où il y a le moins Stentor. Dans ce domaine, retirer autant que possible sans enlever beaucoup de Stentor et ajouter à nouveau PSW. Mélanger doucement, mais bien à distrubute les organismes envahisseurs. Ignorez la prochaine tétée et Stentor mangeront leur.</td>
			<td>Observez la culture régulièrement et retirer les petits contaminants en échangeant des médias aux frais PSW.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor permettent de poser sur le dessus de l’autre.</td>
			<td>Diviser la culture afin que la concentration est inférieure à 20 cellules/mL.</td>
			<td>Diviser les cultures plus souvent.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Cellules de Stentor sont accouplement.</td>
			<td>Nourrir tous les 4 jours au lieu de tous les 5 jours.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>La culture a beaucoup de déchets sombre.</td>
			<td>Enlevez autant de la matière sombre, déchets de Stentor , possible sans enlever les cellules. Si Stentor sont attachés à la matière sombre, Pipetter haut et en bas pour libérer les cellules de Stentor de leurs déchets et puis retirez le support avec les déchets sans supprimer les cellules. Ou, retirer ces Stentor et nourrir en conséquence moins.</td>
			<td>Alimentation de Stentor 1 mL moins de nourriture par 100 mL de la culture.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aspect malsain (vacuolisés/gonflé ou arrondi) Stentor.
</td>
			<td>Retirer autant que possible sans enlever plusieurs cellules de Stentor et ajouter nouveau PSW.</td>
			<td>Échanger régulièrement les médias.</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Guide de dépannage pour la culture de Stentor.

Le géant cilié, Stentor coeruleus, est un excellent système pour étudier la régénération et la guérison des plaies. Nous présentons des procédures pour établir des cultures de cellules de Stentor de cellules individuelles ou des fragments de cellules, induisant la régénération de cellules de coupe, chimiquement induisant la régénération de la bande de membranellar et appareil oral, imagerie et analyse des cellules régénération.

Méthodes pour l’étude de la régénération de Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

L’objectif global de ce protocole est de cultiver Stentor pour l’utiliser comme organisme modèle afin d’étudier la régénération au niveau de la cellule unique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que la façon dont les cellules construisent des structures à partir de parties discrètes. Les principaux avantages de Stentor sont qu’il s’agit de cellules uniques qui peuvent se régénérer et qu’elles sont assez grandes pour être opérées.En général, la partie difficile de ce protocole est que les gens sont habitués à travailler avec les cellules en tant que cultures plutôt qu’en tant qu’individus. Commencez par rechercher une boîte de Pétri contenant un échantillon de Stentor au microscope stéréoscopique à l’aide d’une lumière oblique à un grossissement de 5X. Notez que les cellules de Stentor présentent une forme de trompette lorsqu’elles sont attachées à un substrat.Lorsqu’elles ne sont pas attachées, les cellules nageuses de Stentor sont moins étendues en apparence. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférez les cellules individuelles de Stentor dans le puits d’une plaque de verre contenant au moins 100 microlitres d’eau de source pasteurisée disponible dans le commerce. Ensuite, retirez environ 90 % de l’eau du puits sans retirer les cellules Stentor et ajoutez 500 microlitres d’eau de source fraîche pasteurisée dans le puits trois fois pour laver les cellules.Pour nourrir les cellules, transférez d’abord une aliquote d’un millilitre d’une culture de Chlamydomonas dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour une centrifugation à 2 095 g pendant trois minutes à température ambiante. Remettre la pastille en suspension dans un millilitre d’eau de source pasteurisée pour une deuxième centrifugation, suivie d’une remise en suspension dans 500 microlitres d’eau de source pasteurisée. Si une culture clonale de Stentor est nécessaire, transférez 500 microlitres de milieu conditionné par culture dans des puits individuels d’une plaque de verre et transférez une cellule de Stentor dans chaque puits de milieu.Donnez à chaque culture Stentor cinq microlitres de Chlamydomonas préparée toutes les 48 heures et conservez les cultures dans un endroit ombragé. Comptez le nombre de nouvelles cellules de Stentor avant chaque repas et ajustez le volume de Chlamydomonas mis bas en conséquence. Toutes les 96 heures, pipeter doucement le milieu de culture à quelques reprises pour détacher le Stentor du ménisque de chaque puits et utiliser une pipette d’un millilitre pour aspirer soigneusement le milieu des puits sans retirer aucune cellule.Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieu frais conditionné dans chaque puits. Lorsque le nombre de cellules dans au moins un puits dépasse 20, ajouter 20 millilitres d’eau de source pasteurisée dans un bocal en verre à large ouverture stérilisé autoclavé et détacher soigneusement les cellules Stentor du fond de chaque puits comme il est démontré. Prélevez toutes les cellules de Stentor à l’aide d’une pipette d’un millilitre et transférez doucement les cellules dans le bocal en verre.Ajoutez de l’eau de source fraîche pasteurisée dans le bocal toutes les 48 heures pour maintenir la densité de Stentor à environ 20 cellules par millilitre et nourrissez les cellules de Stentor avec 200 à 1 000 microlitres de Chlamydomonas préparés. Lorsque le volume de culture atteint environ 90 % de la capacité du bocal, transférez tout le contenu du bocal dans un récipient en verre de deux tasses, en nourrissant les cultures Stentor à haut volume de deux millilitres de Chlamydomonas préparés par 100 millilitres de culture et en ajoutant de l’eau de source pasteurisée à la culture tous les quatre à cinq jours pour maintenir la densité de Stentor à environ 20 cellules par millilitre. Une fois par semaine, inspectez les cultures sous un microscope à dissection 5X à la recherche de rotifères, de champignons et d’autres croissances à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour éliminer tous les micro-organismes contaminants ainsi que toutes les cellules Stentor de forme anormale et incolores.Divisez la culture lorsque le récipient en verre est rempli à environ 90 %, en ajoutant 25 millilitres d’eau de source pasteurisée à la culture et en utilisant une pipette de 50 millilitres pour détacher le Stentor du verre, comme il est démontré. Ensuite, déplacez environ 50 % de la culture dans un nouveau récipient en verre de deux tasses. Pour induire la régénération par fragmentation cellulaire, utilisez d’abord un extracteur d’aiguille pour fabriquer plusieurs aiguilles à partir de tubes capillaires.Ensuite, récupérez un Stentor sain avec une forme de trompette définie, une couleur bleu-vert vibrante et pas de grandes vacuoles dans une gouttelette de deux microlitres. Placez la gouttelette sur une lame et ralentissez le mouvement du Stentor avec deux microlitres de méthylcellulose à 4 %. Placez la gouttelette sous un microscope à dissection et tenez l’aiguille de verre aussi parallèle que possible à la surface de coupe pour éviter la casse de l’aiguille.Appuyez doucement sur le Stentor contracté avec le côté de l’aiguille pour séparer l’extrémité antérieure de la cellule de l’extrémité postérieure de la cellule. Confirmez que les deux fragments ont au moins un nœud macronucléaire et déplacez les fragments dans des puits individuels d’une plaque de verre. Pour induire la régénération de la bande membraneuse et de l’appareil buccal, transférez 30 à 60 cellules de Stentor dans un millilitre de milieu de culture dans un tube de microcentrifugation et utilisez une pipette de 200 microlitres pour recueillir toutes les cellules du tube en un seul prélèvement de volume de 125 microlitres.Versez les cellules dans un tube contenant 500 microlitres de saccharose à 25 % fraîchement préparé et lancez un chronomètre. Après avoir fait tourner les cellules du tube dans le rack pendant une minute, collectez toutes les cellules en un seul tirage de 200 microlitres et maintenez les cellules dans la pointe de la pipette jusqu’à ce que le chronomètre affiche deux minutes de traitement au saccharose. Ensuite, éjectez le Stentor dans un tube de microcentrifugation contenant un millilitre d’eau de source pasteurisée pour trois lavages à l’essorage.Pour obtenir une image de la régénération, ajoutez 100 microlitres d’eau de source pasteurisée dans un puits d’une plaque de verre et utilisez une pointe de pipette de 20 microlitres pour prélever une cellule Stentor dans quatre microlitres de milieu de culture. Déposez la gouttelette au milieu d’une lamelle de 22 x 22 millimètres carrés et placez quatre autres gouttelettes autour de la gouttelette précédente. Retournez la lamelle et placez-la doucement sur le puits avec de l’eau de source pasteurisée.Ensuite, imagez les cellules en régénération au microscope optique avec la résolution temporelle appropriée. Au cours de la première étape de la régénération, qui se produit immédiatement après le lavage du saccharose, les cellules de Stentor ressemblent à des larmes sans aucune bande membraneuse. Après trois à six heures, une bande membraneuse apparaît.Cette étape, la deuxième, dure encore trois à quatre heures. La troisième étape se produit lorsqu’un primordium oral apparaît à l’extrémité postérieure de la bande membraneuse et que les deux structures commencent à se déplacer vers l’extrémité antérieure de la cellule. Cette étape dure une à deux heures.Lorsque la bande membraneuse et l’appareil oral atteignent l’extrémité antérieure de la cellule, la régénération est complète et la cellule aura adopté la forme caractéristique de la trompette de Stentor. Tracez le pourcentage de cellules dans chaque étape de régénération à chaque point temporel dans une boîte à moustaches empilée. La mesure du temps de régénération après la découpe cellulaire et le traitement au saccharose révèle une période d’une heure dans le temps nécessaire à la population de cellules pour atteindre un stade particulier, démontrant l’hétérogénéité temporelle du processus de régénération au sein d’une population donnée de cellules en régénération.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver Stentor, d’initier leur régénération et de la quantifier. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier d’être patient. Stentor prend trois à cinq jours pour se diviser en culture et l’identification des étapes de régénération de Stentor demande de la pratique.Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs en biologie cellulaire pour explorer la régénération chez Stentor.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Un modèle intéressant pour étudier différenciation des cellules souches au sein d'un animal vivant est le ver plat planaire. La régénération est étudiée par des expériences simples amputations qui sont facilement réalisées dans un laboratoire de base et sont susceptibles d'être (pharmacologiques et...

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Une méthode efficace pour le greffage des tissus de taille définie et cohérente entre les planaires est décrite. On y trouve aussi une description de la façon dont la technique d'immobilisation utilisée pour la transplantation peut être adapté, en collaboration avec des boucliers de plomb, pour l'irradiation partielle d'animaux vivants.

Immobilisation planaire, l&#39;irradiation partielle, et la transplantation de tissus

Un modèle d'implantation d'une endoprothèse dans l'artère carotide souris est décrite. Comparé à d'autres méthodes similaires, cette procédure est très rapide, simple et accessible, offrant la possibilité d'étudier d'une manière pratique, la réaction de la paroi vasculaire à différents stents à élution médicamenteuse et les mécanismes moléculaires de la resténose.

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Le Stentor coeruleus cilié géant est un système classique pour l’étude de la régénération et de la cicatrisation des plaies dans des cellules uniques. En imageant simultanément les cellules de Stentor à faible et à fort grossissement, il est possible de mesurer les flux cytoplasmiques avant, pendant et après la blessure.

Visualisation du flux cytoplasmique pendant la cicatrisation d’une plaie unicellulaire chez Stentor coeruleus

Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l'embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.

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Enquêter Régénération fonctionnelle en organotypiques médullaires Co-cultures Cultivé sur des tableaux multi-électrodes

Un protocole vidéo étape par étape de résection apicale est démontré dans cette étude. La résection apicale est une approche chirurgicale récemment mise en évidence dans la recherche sur la régénération cardiaque chez les mammifères. Cette étude pourrait promouvoir l’application de la résection apicale comme méthodologie standard dans la recherche sur le mécanisme sous-jacent à la régénération cardiaque.

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Ici, nous montrons comment induire et surveiller la régénération chez l’anémone de mer starlette Nematostella vectensis, un anthozoaire cnidaire modèle.  Nous montrons comment amputer et catégoriser la régénération à l’aide d’un système de stadification morphologique, et nous utilisons ce système pour révéler une nécessité d’autophagie dans la régénération des structures polypes.

Induire complète Polyp Régénération du aboral Physa de la mer Anémone Starlet Nematostella vectensis

Nous présentons un protocole pour la caractérisation de la motilité et du comportement d’une population de cellules de taille cent microns à millimètres en utilisant la microscopie à fond clair et le suivi cellulaire. Ce test révèle que Stentor coeruleus passe par quatre phases comportementalement distinctes lors de la régénération d’un appareil buccal perdu.

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Nous décrivons ici le flux de travail pour l’utilisation du système TetON afin d’obtenir une expression génique spécifique au tissu dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération.

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Découvrez les méthodes pour cultiver Stentor coeruleus et induire sa régénération cellulaire par fragmentation et traitement au saccharose. Ces protocoles permettent d'étudier la biologie cellulaire et la cicatrisation au niveau unicellulaire.

Méthodes pour l’étude de la régénération de Stentor

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