Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies glomérulaires concernant le phénotype fonctionnel et structurel du glomérule et permet l’analyse mécaniste de la pathologie rénale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est adaptable à tous les modèles cotés de maladie glomérulaire. Pour évaluer le rapport albumine-créatinine urinaire, placez une souris mâle âgée de six à huit semaines dans une cage métabolique contenant de l’eau et de la nourriture enrichissante dans une pièce calme.

Après six heures, remettez la souris dans son logement habituel et prélevez un minimum de 50 microlitres de l’échantillon d’urine de base dans chaque cage, en répétant la collecte d’urine d’une fois par semaine à une fois par mois. Au point final expérimental, prélevez les reins de l’abdomen de chaque animal et lavez les organes dans du PBS glacé. Pour examiner les glomérules corticaux, retirez et coupez en dés un pôle du cortex rénal en morceaux d’un millimètre cube.

Pour examiner les glomérules juxtamédullaires profonds, retirez et coupez en dés une petite section de la moelle en morceaux d’un millimètre cube. Ensuite, placez les fragments de chaque section de tissu dans des flacons de microscopie électronique individuels contenant cinq millilitres de solution de glutaraldéhyde à 2,5 % et stockez les échantillons à quatre degrés Celsius. Pour l’histologie des glomérules corticaux et juxtamédullaires, prélever et fixer le tiers supérieur du rein en cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.

Ensuite, transférez le tissu fixé dans cinq millilitres d’éthanol à 70 % pendant 24 heures avant de l’incorporer dans la paraffine. Pour l’analyse chimique immunofluorée des glomérules corticaux et médullaires, placez un tiers du rein dans un moule tissulaire et immergez le tissu dans un composé à température de coupe optimale. Ensuite, placez le moule sur de la glace sèche jusqu’à ce que le composé soit gelé et stockez les échantillons à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient sectionnés.

Pour l’analyse des protéines, placez des morceaux de cortex rénal de trois millimètres cubes sur deux dans des tubes en plastique de 0,5 millilitre et congelez les échantillons dans de l’azote liquide pour les stocker à 80 degrés Celsius. Pour le stockage à long terme des tissus pour l’analyse de l’ARN, après la congélation instantanée de trois morceaux de rein de deux millimètres cubes comme nous venons de le démontrer, ajoutez cinq volumes de solution de stabilisation de la RNase pour un stockage à 80 degrés Celsius. Pour l’isolement des glomérules, coupez en tranches le tissu rénal restant et placez les morceaux de tissu dans cinq millilitres de solution de ringer de mammifère complétée par 1 % d’albumine sérique bovine, ou BSA, sur de la glace pour un tamisage immédiat.

Pour isoler les glomérules, empilez des tamis avec des pores de taille croissante de microns sur un bécher en verre et placez les tranches de rein sur le tamis supérieur de 425 microns de la taille d’un pore. Ensuite, utilisez un piston de seringue et une solution de sonnerie de mammifère fraîche et glacée complétée par 1 % de BSA pour écraser le tissu rénal à travers le premier tamis. Au fur et à mesure que les morceaux de rein sont poussés, retirez le tamis supérieur et continuez à pousser les fragments de rein à travers chaque tamis à tour de rôle.

Lorsqu’il ne reste que les tamis de 100 et 70 microns, transférez la récolte glomérulaire retenue par les deux derniers tamis dans un tube conique de 50 millilitres avec 10 millilitres de solution fraîche de baguage de mammifère complétée par 1 % de BSA sur de la glace. Répartissez trois millilitres de suspension de glomérules entre deux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre et granulez les glomérules par centrifugation. Après avoir retiré le surnageant, congelez les glomérules dans de l’azote liquide pour un stockage à 80 degrés Celsius pour une extraction ultérieure des protéines et de l’ARN.

Ensuite, placez la solution glomérule restante dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pour l’injection dans un appareil de perméabilité à l’eau glomérulaire sur une platine de microscope optique. Après la capture d’un glomérule individuel intact, libérer une capsule de Bowman et des fragments tubulaires à l’aide d’une micropipette, commencer l’enregistrement et perfuser le glomérule avec une solution de sonnerie fraîche complétée par 1 % de BSA. Après 30 secondes, remplacez le perfusat par une solution de sonnerie concentrée à 8 % BSA.

Après 10 secondes de perfusion, remettez le perfusat à 1 % de solution de sonnerie BSA et arrêtez l’enregistrement. Pour une visualisation détaillée des cellules glomérulaires et de la matrice résiduelle, séchez les échantillons de cortex rénal fixes et inclus en paraffine à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis effectuez une déparaffinisation avec des immersions consécutives de xylène et d’éthanol descendant. Réhydratez les échantillons dans de l’eau distillée pendant cinq minutes et incubez les lames dans une solution acide périodique dans une armoire à fumée.

Après cinq minutes, rincez les lames avec trois lavages de cinq minutes dans 100 millilitres d’eau distillée, suivis d’une incubation de 15 minutes dans le réactif de Schiff. À la fin de l’incubation, lavez les lames à l’eau courante du robinet pendant cinq minutes et contrez la coloration à l’hématoxyline pendant trois secondes avant de rincer abondamment à l’eau courante du robinet pendant 15 minutes supplémentaires. Ensuite, déshydratez les lames avec des immersions ascendantes à l’éthanol et deux immersions consécutives de trois minutes au xylène.

Après séchage à l’air, les lames peuvent être montées avec un milieu de montage à base de xylène pour l’évaluation de leur structure glomérulaire au microscope optique à un grossissement de 400x. Les souris knock-out à facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ou VEGF-A, développent une albuminurie progressive à 10 semaines, par rapport aux témoins de type sauvage, tandis que les animaux knock-out surexprimant le VEGF165b sont protégés de cette condition. Les souris knock-out du VEGF-A ont une perméabilité à l’eau glomérulaire significativement accrue par rapport aux témoins de type sauvage, qui est partiellement sauvée par la surexpression du VEGF-A165b.

La coloration périodique à l’acide de Schiff des sections du cortex rénal chez les souris knock-out VEGF-A ne révèle aucune anomalie structurelle glomérulaire par analyse par microscopie optique. Cependant, lors de l’analyse par microscopie électronique, les souris knock-out présentent une augmentation de la largeur de la membrane basale glomérulaire, une diminution du nombre de fenestres endothéliales, une diminution de la couverture de l’espace sous-podocytaire et une augmentation de la largeur moyenne des fentes des podocytes, tandis que le nombre moyen de fentes est resté inchangé. La surexpression de VEGF165b chez les animaux knock-out VEGF-A sauve les changements de la membrane basale glomérulaire et de la largeur de la fente.

Cependant, la surexpression de VEGF165b n’affecte pas les nombres de fenestres altérés ou la couverture de l’espace des sous-podocytes. L’ARN extrait de glomérules tamisés confirme l’expression humaine de l’ARNm VEGF165b chez les souris knock-out surexprimant le VEGF165b, corrélée à une diminution de l’expression du VEGFR2 chez les souris knock-out du VEGF-A qui est sauvée par la surexpression du VEGF165b dans le knock-out chez les animaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un bilan rénal complet pour l’évaluation d’un modèle murin de maladie glomérulaire, y compris une évaluation de la perméabilité glomérulaire à l’albumine et à l’eau.