Quantifier la colonisation de Vibrio cholerae et la diarrhée dans le modèle de poisson-zèbre adulte

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vibrio cholerae, comme la façon dont le vibrio cholerae colonise la côte tranquille et rivalise avec le microbiote intestinal pour établir une niche. Le principal avantage de cette technique est que le poisson est un hôte naturel de vibrio cholerae, ce qui nous permet d’étudier le cycle de vie complet de vibrio cholerae. La démonstration de la procédure sera assurée par Dhrubajyoti Nag, un post-doctorant de mon laboratoire, et Paul Breen, un étudiant au doctorat de mon laboratoire.

Après avoir préparé les cultures de V. cholerae, inoculez le poisson-zèbre par immersion. Tout d’abord, placez quatre ou cinq poissons-zèbres dans un bécher de 400 millilitres contenant 200 millilitres d’eau d’infection stérile. Ajoutez ensuite un millilitre de culture de V. cholerae pour obtenir la concentration d’infection souhaitée.

Ensuite, couvrez le bécher avec un couvercle perforé. Après avoir préparé tous les béchers, transférez-les dans un incubateur en verre réglé à 28 degrés Celsius Pour une exposition transitoire, après environ six heures, versez l’eau du bécher à travers un filet à poisson pour recueillir le poisson. L’eau infectée doit être éliminée dans de l’eau de Javel pour tuer les bactéries.

Ensuite, placez le poisson dans 200 millilitres d’eau d’infection stérile pendant cinq minutes. Après cinq minutes, faites couler cette eau à travers un filet de pêche, en jetant l’eau dans de l’eau de Javel. Maintenant, le poisson peut aller dans un nouveau bécher propre avec 200 millilitres d’eau d’infection stérile.

Lorsque l’expérience a atteint le point final souhaité, prélever un échantillon de 15 millilitres d’eau d’infection à des fins de diagnostic. Ensuite, récupérez le poisson et éliminez l’eau infectée de manière appropriée. Orientez le côté ventral vers le haut et fixez le corps avec une épingle à travers la mâchoire inférieure et une autre épingle juste derrière l’anus.

Inclinez les deux goupilles loin du corps. Ensuite, essuyez la surface ventrale du poisson avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, stérilisez un scalpel et des ciseaux Vannas en utilisant de l’éthanol à 70 % et une flamme.

Maintenant, à l’aide du scalpel, faites une petite incision dans le sens de la longueur dans le ventre qui pénètre dans les écailles, mais ne coupez qu’aussi profondément que la peau. Ensuite, avec les ciseaux, étendez soigneusement l’incision sur toute la longueur du corps, en ne coupant pas plus profondément que le niveau de la peau. Évitez de couper l’anus.

Faites ensuite deux entailles latérales vers la tête pour élargir l’ouverture. Ensuite, épinglez la peau de chaque côté des incisions latérales sur la surface de dissection, en inclinant les broches vers l’extérieur, loin du corps. Le tractus intestinal devrait maintenant être visible sous la forme d’un tube très mince et pâle.

Maintenant, utilisez deux paires de pinces stérilisées à la flamme pour retirer soigneusement tout le tractus intestinal qui peut être assez fragile. Transférez le tissu dans un tube d’hominisation contenant des billes de verre et un millilitre de tampon froid. Ensuite, homogénéiser les tissus comme décrit dans le protocole textuel et quantifier les niveaux de colonisation intestinale.

Ensuite, faites des dilutions en série de l’homogénat intestinal et du tampon. Pour chaque poisson, préparez cinq ou six dilutions dix fois plus importantes dans des volumes d’un millilitre. Vortex les tubes pour le mélange.

Ensuite, mettez en plaques 100 à 200 microlitres de chaque dilution sur des plaques de gélose LB contenant de la streptomycine et du X-gal. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Après l’incubation d’une nuit, comptez les colonies de V. cholerae sur les plaques.

Ces bactéries produisent généralement des colonies bleu pâle sur un milieu LB avec X-gal. Si plusieurs morphologies de colonies sont observées, patchez quelques colonies de chaque morphologie différente sur une plaque TCBS différente. Sur TCBS, V. cholerae produit de grandes colonies jaunes légèrement aplaties avec des centres opaques et des périphéries translucides.

Pour déterminer les niveaux de mucine dans la diarrhée du poisson, effectuez un test sur une plaque à 96 puits. En trois exemplaires, chargez 100 microlitres d’eau d’infection pour chaque condition d’essai, y compris un blanc, dans les puits. Ensuite, mélangez 50 microlitres de solution acide périodique fraîche à 0,1 % dans chaque puits d’essai.

Utilisez le pipetage pour mélanger. Ensuite, enveloppez hermétiquement l’assiette dans du plastique et incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure à une heure et demie. Après l’incubation, refroidissez l’assiette à température ambiante.

Dans chaque puits, ajoutez 100 microlitres de solution Fuchsin et mélangez avec le pipetage. Maintenant, rembobinez l’assiette et placez-la sur une bascule à température ambiante. En 20 minutes environ, lisez la plaque à 560 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques.

Quantifier la réaction provoquée par la mucine en solution. Pour mesurer les niveaux de protéines dans la diarrhée du poisson, utilisez le test de Bradford. Mélangez 66 microlitres de l’une des normes BSA ou 66 microlitres d’eau d’infection avec 1 000 microlitres de réactif de test Bradford dans une cuvette jetable.

Maintenant, incubez les échantillons à température ambiante pendant deux minutes. Et puis lire l’absorbance à 660 nanomètres sur un spectrophotomètre. Une mesure simple de la quantité de diarrhée est la turbidité de l’eau mesurée à 600 nanomètres.

Mélangez bien l’eau, ajoutez un millilitre dans une cuvette jetable et prenez une mesure. Pour une mesure à blanc de référence, utilisez une eau d’infection propre. Les bactéries V. cholerae excrétées peuvent également être mesurées.

Cela peut être fait avec des poissons qui ont été déplacés vers de l’eau propre après avoir été inoculés. Effectuer des dilutions en série d’un aliquat d’eau de réservoir comme décrit précédemment. Ensuite, plaquez les dilutions sur des milieux sélectifs et incubez les plaques à 30 degrés Celsius pendant 24 heures.

Plus tard, comptez les colonies comme décrit précédemment, puis déterminez l’UFC. Des groupes de poissons-zèbres logés dans 200 millilitres d’eau ont été inoculés avec cinq millions d’UFC d’un choléra pandémique. Après six heures dans l’eau infestée de bactéries, les poissons passent à l’eau propre pendant 18 heures.

Les intestins de l’air ont ensuite été récoltés. Chaque poisson abritait environ 100 000 à 1 000 000 de cellules V. cholerae. L’eau d’infection a été utilisée pour d’autres essais.

Les niveaux de mucine étaient plus élevés lorsque les doses infectieuses étaient plus élevées. La DO 600 de l’eau était significativement plus élevée lorsque les poissons étaient infectés par V. cholerae. Enfin, la teneur totale en protéines dans l’eau des poissons infectés était près de deux fois supérieure à celle observée dans l’eau des poissons non infectés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter le poisson-zèbre adulte avec vibrio cholerae et quantifier la diarrhée induite par l’infection. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme les tests de transmission, peuvent être effectuées pour évaluer l’infection des poissons naïfs par des poissons précédemment infectés.