Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

Le principal avantage de cette technologie est qu’elle permet l’imagerie rapide de l’un ou l’autre du cœur de la souris. Et il peut être utilisé pour observer la présence de canaux d’air après la thérapie génique. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la cardiologie du développement, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la neurologie et la pneumologie.

En général, les individus auront du mal avec cette technique parce que le montage d’une imagerie du cœur de souris adulte peut être difficile, et il est différent des autres techniques traditionnelles, telles que la microscopie confocale et inversée. Placez un laser à ondes continues avec trois longueurs d’onde de 405 nanomètres, 473 nanomètres et 532 nanomètres. Puis, apposer miroir un et l’aligner avec le plan miroir à 45 degrés à la poutre.

Cela dirigera le laser vers le séparant de faisceau, qui forme la configuration d’éclairage à double face. Ensuite, passez le faisceau à travers un filtre de densité neutre de 50 millimètres de diamètre, un expandeur de faisceau, et un trou de broche de 25 millimètres de diamètre, tous positionnés à 150 millimètres les uns des autres. Passez le faisceau à travers un séparateurs de faisceau de 50-50, placés à 150 millimètres du sténopé.

Ensuite, placez le miroir à deux 150 millimètres du séparateurs de faisceau, à 90 degrés au faisceau avant, et alignez-le de sorte que son plan miroir soit à un angle de 45 degrés par rapport au faisceau. Ensuite, placez le miroir à trois 100 millimètres du miroir deux, et alignez-le de sorte que son plan miroir est à un angle de 45 degrés au faisceau réfléchi à partir du miroir deux. Utilisez ce faisceau réfléchi pour former un côté de la feuille de lumière à double éclairage.

De l’autre côté du séparant de faisceau, placez le miroir cinq de sorte que son plan de miroir soit à 45 degrés au faisceau qui est émis dans une direction avant. Utilisez le faisceau émis par le miroir cinq pour former le deuxième côté de la feuille de lumière à double éclairage. Ensuite, installez le système d’éclairage à double face de façon systémique.

Placez la lentille cylindrique à deux 150 millimètres du miroir trois, et une autre lentille cylindrique identique à 150 millimètres du miroir cinq, de l’autre côté de la configuration à double éclairage. Ensuite, placez deux miroirs, chacun en ligne avec les lentilles cylindriques, à des distances de 50 millimètres pour refléter le faisceau à 90 degrés. Des deux côtés de la feuille de lumière, former un doublet achromatique à partir d’une paire de lentilles, avec la première lentille étant placé 100 millimètres du miroir précédent, et ayant un diamètre d’un pouce et une longueur focale de 100 millimètres.

La deuxième lentille doit être placée à 160 millimètres de la lentille 1, avec un diamètre d’un pouce, et une longueur focale de 60 millimètres. Ensuite, placez les objectifs d’éclairage un et deux 150 millimètres des doublets achromatiques précédents, de sorte qu’ils soient en ligne avec le faisceau. Le faisceau émis par les objectifs forme la feuille de lumière pour l’imagerie des échantillons.

Tout d’abord, préparer l’échantillon de perles fluorescentes en diluant une solution de perles de 0,53 micromètre, une à 150 000, dans une solution d’appariement de l’index réfractif préchauffé, avec une agarose pointante à faible fond de pourcentage. Ensuite, utilisez un morceau de tube en verre borosilicate avec un diamètre intérieur de 12 millimètres, et un diamètre extérieur de 18 millimètres, à une longueur de 30 millimètres. Pipette la solution d’agarose de perle dans le tube de borosilicate et permettent à l’agarose de se solidifier à température ambiante.

Maintenant, remplissez une chambre ABS imprimée en 3D avec une solution gylcerol de 99,5 pour cent. Placer le tube en verre borosilicate, contenant les perles, à l’intérieur de la chambre. Fixez un stade translationnel motorisé 3D au tube en verre borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon à l’intérieur de la chambre ABS.

Ensuite, utilisez un logiciel conçu sur mesure pour acquérir des images à l’aide de la caméra sCMOS, à raison de 30 images par seconde. À l’aide du contrôleur moteur, déplacez l’échantillon d’un millimètre dans la direction latérale et obtenez des images à chaque incrément d’un millimètre, jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été photographié. Empilez les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation et mesurez la fonction de propagation des points du système à l’aide de ces images de perles.

Utilisez une solution d’appariement de l’index réfractif, avec un pH de 7,5, et dissolvez un pour cent de l’agarose dans la solution correspondante. Placez un échantillon de coeur de souris adulte effacé dans la solution d’appariement de l’index réfractif, avec un pour cent d’agarose dissous. Ensuite, insérez l’échantillon dans des tubes en verre borosilicate et laissez l’agarose se solidifier à température ambiante.

Fixez une étape translationnelle motorisée 3D au tube en verre borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans une chambre ABS imprimée en 3D. Placez l’échantillon de sorte qu’il soit au centre du faisceau gaussien, créé par le système d’éclairage double. Ensuite, réglez le taux d’acquisition de la caméra sCMOS à 30 images par seconde.

Maintenant, à l’aide du contrôleur moteur, déplacez l’échantillon d’un millimètre dans la direction axiane et acquérez des images à chaque incrément d’un millimètre. Continuez jusqu’à ce que l’ensemble de l’échantillon ait été illustré. Empilez les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation.

Développez les images 3D à l’aide de ces piles d’images. Pour ce faire, déconvolez la fonction de propagation de points déterminée précédemment, et utilisez-la pour les piles d’images acquises. Enfin, définissez une valeur d’intensité seuil pixel pour observer les contours du cœur, et ajouter pseudo-couleur aux images, en fonction de cette intensité à l’échelle grise.

Au premier jour post-natal, on peut visualiser les valves, l’atrium, le ventricule, le muscle pectinate, et la trabeculation, entre autres dispositifs. Au septième jour post-natal, les caractéristiques sont encore plus définies. L’oreillette, le ventricule, les dimensions ventriculaires de cavité, et l’épaisseur de mur de ventricule sont tous évidents.

Pour étudier la différenciation des cardiomyocytes dans le cœur, les souris knock-in hétérozygotes ont été étiquetées en cre pour montrer des cardiomyocytes. Les cellules étiquetées sont montrées ici, dans chaque direction plane. Les trois plans ont été fusionnés, pour créer un rendu 3D du cœur.

La région encerclée rouge dans l’encart montre deux cœurs de souris translucides après avoir subi la technique de clarté et d’être inséré dans le tube en verre borosilicate. En plus d’étudier les souris postnatales, le système d’imagerie peut également être utilisé pour étudier le cœur de souris adulte. Ici, les canaux ROMK marqués GFP sont affichés à 7,5 mois.

Ceux-ci ont été principalement trouvés dans le mur ventriculaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en une à deux minutes. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’enlever toutes les bulles autour de l’échantillon dans le tube.

D’autres méthodes, telles que la segmentation automatique des piles d’images, peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions liées aux lésions cardiovasculaires et à la régénération. Après son développement, cette technique a été utilisée par les chercheurs pour étudier l’architecture cardiaque dans les stades de développement postnatal et adulte chez la souris.