Name: Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Découvrez la microscopie à feuille de lumière à illumination bilatérale pour l'imagerie cardiaque murine avec clarification optique. Cette technique permet l'observation rapide des changements structurels post-thérapie génique.

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Les auteurs tiennent à remercier Thao Nguyen et Atsushi Nakano d’UCLA de fournir l’échantillon de souris à l’image. Cette étude a été financée par les STARS de subventions HL118650 NIH (à Tzung K. Hsiai), HL083015 (à Tzung K. Hsiai), HD069305 (pour N. C. Chi et Tzung K. Hsiai.), HL111437 (à Tzung K. Hsiai et N. C. Chi), HL129727 (à Tzung K. Hsiai) et système de l’Université du Texas (à Nancy Lee).

Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été approuvés par les comités examen institutionnel (IACUC) à l’Université de Californie, Los Angeles, en Californie.
1. Configuration du système d’imagerie
Remarque : Voir la Figure 1 et Figure 2.
<ol><li>Récupérer un laser à onde continue (CW) avec 3 longueurs d’onde : 405 nm, 473 nm et 532 nm. Place 2 miroirs (M1 et M2) de 150 mm et en conformité avec leurs avions de miroir à 45° à la poutre. Remarque : Cette étape est effectuée afin de rediriger le laser de l’installation d’éclairage recto-verso. Le faisceau résultant sera dans la même direction que le faisceau initial.</li>
	<li>Passer le faisceau à travers un diamètre de 25 mm diaphragme iris/sténopé (PH), un filtre à densité neutre (NDF) 50 mm de diamètre avec une plage de densité optique de 0 - 4.0, une extension de faisceau (BE), une fente de 30 mm (S) avec la largeur de ~ 0 - 6 mm et un miroir (M3) , tous positionnés 150 mm les uns des autres. Placez le miroir avec son plan de symétrie entre 45° et le faisceau.</li>
	<li>Passer le faisceau à travers un séparateur de faisceau de 50/50 placé à 150 mm de M3. Placez un miroir (M6) 150 mm de la séparateur de faisceau et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° de la poutre qui est émise vers l’avant. Utilisez le faisceau réfléchi pour former un côté de la nappe de lumière double-illumination.</li>
	<li>Placez un miroir (M4) 150 mm de la séparateur de faisceau et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° de la poutre qui a été émise à un angle de 90° de la séparateur de faisceau. Placez un deuxième miroir (M5) 150 mm du M4 et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° vers le faisceau réfléchi sur M6. Utilisez le faisceau émis par M5 pour former le second côté de la nappe de lumière double-illumination.</li>
	<li>Mettre en place le système d’éclairage recto-verso de façon symétrique (voir Figure 1). Placer une lentille cylindrique (CL1) [diamètre (d) = 1 ; longueur focale (f) = 50 mm] 150 mm en ligne avec le faisceau émis par M5 sur un côté et une autre lentille cylindrique identique (CL2) 150 mm en ligne avec le faisceau émis par M6 sur l’autre côté de la double-illumination setu p. Placer 2 miroirs (M7 et M8) chaque en ligne avec des lentilles cylindriques, à une distance de 50 mm afin de refléter le faisceau à 90 °.</li>
	<li>Former un doublet achromatique d’une paire de lentilles. Placez la première lentille, L1 (d = 1 ; f = 100 mm), 100 mm de M7 et la seconde lentille, L2 (d = 1 ; f = 60 mm), 160 mm de L1. Répéter que cela de l’autre côté de la double-illumination avec des objectifs identiques (L3, L4) placés à la même distance du M8.</li>
	<li>Place miroirs, M9 et M10, 60 mm de lentilles L2 et L4, respectivement et conformément à la poutre. Placer les objectifs de l’illumination, OL1 et OL2 (d = 2 ; f = 150 mm), 150 mm de M9 et M10 et conforme à la poutre. Le faisceau émis par les objectifs constitue la nappe de lumière pour les échantillons d’imagerie.</li>
	<li>Une imprimante 3D permet d’imprimer le porte-échantillon d’acrylonitrile butadiène styrène (ABS). Incorporer un morceau de verre de couverture [indice de réfraction (RI) = 1.4745] de chaque côté de la chambre, perpendiculaire au faisceau éclairage, afin de minimiser la désadaptation de l’indice de réfraction. Placer la chambre entre les faisceaux émis par les lentilles de l’objectif.</li>
	<li>Installer un microscope stéréo avec un 1 X objectif de grossissement et une caméra à semi-conducteurs (sCMOS) oxyde de métal complémentaire scientifique perpendiculaire à l’illumination d’avion (voir Figure 2).</li>
</ol>2. imagerie système de calibrage
<ol><li>Récupérer les billes de polystyrène fluorescents qui 0.53 μm de diamètre.</li>
	<li>Préparation des échantillons de billes fluorescentes en diluant la solution de perle dans une solution correspondant d’indice de réfraction (jantes) avec agarose pointage bas point de fusion de 1 % à 1 : 150, 000. Couper un bout de tube en verre borosilicate avec un diamètre intérieur de 12 mm et un diamètre extérieur de 18 mm sur une longueur de 30 mm. Remarque : Le tube de verre de borosilicate est utilisé pour correspondre à l’indice de réfraction (1,47).</li>
	<li>Mélanger l’échantillon dilué perle avec 1 % d’agarose et Pipeter la solution perle / d’agarose dans la tubulure de borosilicate. Permettre l’agarose à se solidifier à température ambiante (23 ° C).</li>
	<li>Remplir la chambre de l’ABS (de l’étape 1.7) avec une solution de glycérol à 99,5 %. Déposer le tube de verre de borosilicate contenant les billes à l’intérieur de la chambre. Placer la chambre de l’ABS dans le système d’imagerie afin qu’il soit au centre du faisceau gaussien créé par le système de double éclairage.</li>
	<li>Fixer une platine translationnelle motorisée 3-d sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la chambre de l’ABS (voir la Figure 1).</li>
	<li>Acquisition d’images à l’aide de la caméra sCMOS à raison de 30 images par seconde (fps). En utilisant le contrôleur de moteur, déplacer l’échantillon de 1 mm dans le sens latéral et acquérir des images à chaque incrément de 1 mm à l’aide de la caméra sCMOS. Continuez jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon a été photographié.</li>
	<li>Empiler les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation (voir Table des matières). Mesurer la fonction de point propagation (PSF) du système à l’aide de ces images de perle. Utilisez cette PSF de déconvolution pendant le traitement dans les étapes ultérieures de l’image.</li>
</ol>3. préparation des échantillons
<ol><li>Disséquer les cœurs d’une souris de type sauvage P1 et par un double sarcolipin-Cre hétérozygotes knockin de souris avec le gène Rosa26-YFP (SlnCre / +; R26journaliste YFP / +) à P7. Remarque : L’euthanasie a été effectuée à l’aide de pentobarbital et la technique décrite par Robbins et al. 10. la dissection a été réalisée selon la technique décrite par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)10,11.</li>
	<li>Effectuer un produit chimique de compensation des cœurs murines, comme décrit par Kevin Sung et al. 12. Remarque : Les étapes suivantes devraient être effectuées sous une hotte étant donné que les produits chimiques utilisés sont toxiques.<ol>
<li>Rincer les coeurs en 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 x pendant 10 min. Après le rinçage, placez les coeurs dans une solution de paraformaldéhyde de 4 % et incuber les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.</li>
		<li>Placer les échantillons dans une solution de 4 % d’acrylamide contenant 0,5 % p/v de 2, 2'-Azobis dichlorhydrate. Laisser les échantillons incubés à 4 ° C durant la nuit. Après l’incubation d’une nuit ou plus, retirer les échantillons et les incuber à 37 ° C pendant 2-3 h.</li>
		<li>Rincez les échantillons avec du PBS et ensuite les placer dans une solution de dodécylsulfate de sodium 8 % p/v et 1,25 % p/v d’acide borique. Incuber les échantillons à 37 ° C jusqu'à ce qu’elles sont claires. Cela peut prendre plusieurs heures selon l’épaisseur de l’échantillon. Après compensation, supprimer les échantillons et les placer dans 1 x tampon phosphate salin pendant 1 nuit.</li>
		<li>Préparer un indice de réfraction correspondant solution avec 40 g de milieu gradient de densité non ioniques (voir Table des matières) dans 30 mL de tampon phosphate de 0,02 M (PB), 0,1 % Tween-20 et 0,01 % d’azide de sodium. Porter la solution à un pH de 7,5 à l’hydroxyde de sodium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer l’échantillon déboisée dans jantes avec un indice de réfraction de 1,46-1,48 et 1 % d’agarose. Insérer l’échantillon dans le tube en verre borosilicate et permettre l’agarose à se solidifier à température ambiante (23 ° C).</li>
	<li>Fixer une platine translationnelle motorisée 3-d sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la 3-d imprimé chambre ABS (voir la Figure 1).</li>
</ol>4. imagerie cardiaque adultes
<ol><li>Injecter 8,7 x 1012 virus du vecteur de virus adeno-associé de type 9 (AAV9) contenant un promoteur spécifique cardiaque troponine T (cTnT) et la protéine fluorescente verte (GFP) dans un volume de 100 μL dans la veine de la queue d’une souris de type sauvage de 2 mois (C57BL/6). Remarque : Le AAV9 a été développé selon la technique décrite par Yuan et al. 13. cela provoque GFP lier au canal potassium médullaire externe rénale (ROMK) produisant AAV9-cTnT-ROMK-GFP (voir Table des matières).</li>
	<li>Disséquer le coeur de souris adultes à 7,5 mois selon la technique décrite par le NHLBI11. Préparer les échantillons à l’aide de mesures 3.1 à 3.3.</li>
	<li>Connectez le contrôleur de moteur à l’actuateur moteur. Fixer le vérin sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la 3-d imprimé chambre ABS.</li>
	<li>Positionner l’échantillon pour qu’il soit au centre du faisceau gaussien créé par le système de double éclairage. Acquisition d’images à l’aide de la caméra sCMOS à un taux de 100 fps.</li>
	<li>En utilisant le contrôleur de moteur, déplacer l’échantillon de 1 mm dans le sens axial et acquérir des images à chaque incrément de 1 mm avec la caméra sCMOS. Continuez jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon a été photographié. Remarque : Le système est contrôlé par un logiciel de contrôle d’instruments développés sur mesure.</li>
	<li>Empiler les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation (voir Table des matières). Développer des images 3D à l’aide de ces piles de l’image et le logiciel de visualisation14. Donne les fibres discontinues de polyesters de l’étape 2.6 avec la pile de l’image acquise. Définir une valeur d’intensité de seuil pixel pour observer les contours du cœur et de Pseudo-colorisation des images basées sur cette intensité de gris.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le système LSFM et la technique décrite ici utilise un faisceau d’éclairage double face combiné avec une compensation optique d’image au coeur de souris post-natale à adulte stades de son développement. Un faisceau d’éclairage unique traditionnel souffre de diffusion du photon et l’absorption par les tissus plus épais et plus grands échantillons1,3. Les poutres recto-verso fournissent un éclairage plus homogène de l’échantillon, réduisant ainsi au minimum l’effet...

La microscopie en fluorescence lumière-feuille est une technique développée tout d’abord en 1903 et est aujourd'hui utilisée comme une méthode pour étudier l’expression des gènes et aussi de produire des modèles 3D ou 4D, des échantillons de tissus pour1,2,3. Cette méthode d’imagerie utilise une mince feuille de lumière pour illuminer un seul plan d’un échantillon afin que seulement ce plan est capté par le détecteur. L’échantillon peut alors être déplacé dans la direction axiale pour capturer chaque couche, une section à la fois et le rendu d’un modèle 3D après le post-traitement des images acquises4. Toutefois, en raison de l’absorption et la dispersion des photons, LSFM a été limitée à des échantillons qui sont soit une épaisseur de quelques microns ou optiquement transparent1.
Les limitations de LSFM ont conduit à des études approfondies des organismes disposant de tissus qui sont optiquement transparents, tels que le poisson-zèbre. Études portant sur la différenciation et le développement cardiaque sont souvent menées sur le poisson-zèbre, puisqu’il y a des gènes conservés entre l’homme et le poisson-zèbre5,6. Bien que ces études ont conduit à des avancées dans la recherche cardiaque liée aux cardiomyopathies6,7, il y a toujours une nécessité d’effectuer des recherches similaires sur les organismes de niveau supérieures tels que les mammifères.
Chez les mammifères tissu cardiaque présente un défi en raison de l’épaisseur et l’opacité des tissus, l’absorption due à l’hémoglobine dans les globules rouges et les rayures qui se produit en raison de l’éclairage unilatéral de l’échantillon dans le cadre de méthodes traditionnelles LSFM1 , 8. pour compenser ces limitations, nous avons proposé d’utiliser illumination recto-verso et une version simplifiée de la technique de clarté9 combiné avec un indice de réfraction correspondant solution (jantes). Par conséquent, ce système permet l’imagerie d’un échantillon qui est supérieur à 10 x 10 x 10 mm3 , tout en conservant une bonne qualité de résolution axiale et latérale des avions8.
Ce système a été tout d’abord calibré à l’aide de perles fluorescentes disposés dans différentes configurations dans le tube de verre. Puis, le système a été utilisé afin d’imager les cœurs murines postnatals et adultes. Tout d’abord, le coeur de souris après l’accouchement a été imagé à 7 jours (P7) pour révéler la cavité ventriculaire, l’épaisseur de la paroi ventriculaire, les structures de la vanne et la présence de trabeculation. Deuxièmement, une étude a été menée pour identifier les cellules qui seraient différencient en cardiomyocytes en utilisant un coeur postnatal de souris au jour 1 (P1) avec marqué Cre cardiomyocytes et protéine fluorescente jaune (YFP). Enfin, des souris adultes à 7,5 mois ont été projetés pour observer la présence de potassium médullaire externe rénale canaux (ROMK) après la thérapie de gène8.

<table><tbody><tr><td>CW Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>Excitation des fluorophores</td></tr><tr><td>Filtre à densité neutre</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>Contrôle la quantité de lumière entrant dans le système</td></tr><tr><td>Extenseur de faisceau achromatique</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>Élargit le faisceau de lumière</td></tr><tr><td>Fente mécanique</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>Contrôle la largeur du faisceau</td></tr><tr><td>Séparateur</td><td>de faisceau Thorlabs</td><td>BS013</td><td>Forme un faisceau à double éclairage</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope avec objectif 1X</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Utilisé pour l’observation d’un échantillon</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT Caméra sCMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Utilisé pour capturer des images</td></tr><tr><td>Acrylonitrile butadiène styrène (ABS)</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>Matériau utilisé pour imprimer en 3D un porte-échantillon</td></tr><tr><td>Billes de polystyrène fluorescentes</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>Utilisé pour l’étalonnage du système d’imagerie</td></tr><tr><td>Tube en verre borosilicaté</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>Tube pour l’enrobage d’échantillons</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>Remplissage pour chambre d’échantillonnage</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>Solution de rinçage pour cœurs de souris</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sciences de microscopie électronique</td><td>RT-15700</td><td>Première solution d’incubation</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>Mélangé avec du dichlorhydrate de 2,2'-Azobis pour la deuxième solution d’incubation pour le cœur de souris</td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de 2,2'-Azobis</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>Mélangé avec de l’acrylamide pour la solution de deuxième incubation pour le cœur</td></tr> <tr><td>de sourisDodécylsulfate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>Mélangé avec de l’acide borique pour une solution de troisième incubation pour le cœur de souris</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>Mélangé avec du dodécylsulfate de sodium pour une troisième solution d’incubation pour le cœur</td></tr><tr><td>de souris Sigma D2158 Sigma Aldrich</td><td></td><td>D2158</td><td>Mélangé avec du PB, du Tween-20 et de l’azoture de sodium comme solution d’adaptation de l’indice de réfraction</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>Mélangé avec Sigma D2158, PB et Sodium Azide comme solution d’adaptation à l’indice de réfraction</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Mélangé à Sigma D2158, PB et Tween-20 comme solution d’adaptation à l’indice de réfraction</td></tr><tr><td>Vecteur viral adéno-associé 9 avec un promoteur de troponine T spécifique au cardiaque marqué avec un</td><td>vecteur GFP Biolabs</td><td>VB2045</td><td>Exprime la GFP lorsqu’il est lié à l’actionneur</td></tr> de <tr><td>servomoteur ROMK DC</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Utilisé pour le mouvement axial de l’échantillon dans la feuille de lumière</td></tr><tr><td>K-Cube Contrôleur de servomoteur DC brossé</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Se connecte à l’actionneur du moteur et contrôle le mouvement de l’actionneur</td></tr><tr><td>Amira</td><td>FEI Software</td><td>N/A</td><td>Logiciel de visualisation pour la production d’images 2D et 3D</td></tr></tbody></table>

microscopie de fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

La microscopie en fluorescence lumière-feuille a été utilisée pour l’acquisition rapide des images à haute résolution axiale de micromètre à échelle millimétrique. Les techniques traditionnelles de lumière-feuille impliquent l’utilisation d’un faisceau d’éclairage unique réalisé perpendiculairement au tissu de l’échantillon. Images de grands échantillons qui sont produites à l’aide d’un faisceau d’éclairage unique contiennent des rayures ou des artefacts et souffrent d’une résolution réduite en raison de la diffusion et d’absorption de la lumière par le tissu. Cette étude utilise un faisceau d’éclairage recto-verso et une clarté simplifiée optique technique pour coeur murin de compensation. Ces techniques permettent d’imagerie profonde en enlevant des lipides du coeur et produisent un grand domaine de l’imagerie, supérieur à 10 x 10 x 10 mm3. Par conséquent, cette stratégie permet de quantifier les dimensions ventriculaires, suivre la lignée cardiaque et localiser la distribution spatiale des protéines cardiaques spécifiques et des canaux ioniques de la post natal aux coeurs de souris adulte avec un contraste suffisant et résolution.

La technique décrite ici utilise un faisceau d’éclairage double face combiné avec une compensation optique souris coeur d’échantillons de tissus pour atteindre une profondeur d’imagerie plus profonde et un plus grand volume d’imagerie avec une résolution suffisante d’imagerie (Figure 1). Pour calibrer le système, les perles fluorescentes ont été placés à l’intérieur du tube de verre et au sein du système d’imagerie. Les perles ont été imagées et visualisés da...

Cette étude utilise une technique de microscopie (LSFM) de fluorescence lumière-feuille recto-verso illumination combinée avec compensation optique pour étudier le coeur murin.

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Le principal avantage de cette technologie est qu’elle permet l’imagerie rapide de l’un ou l’autre du cœur de la souris. Et il peut être utilisé pour observer la présence de canaux d’air après la thérapie génique. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la cardiologie du développement, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la neurologie et la pneumologie.En général, les individus auront du mal avec cette technique parce que le montage d’une imagerie du cœur de souris adulte peut être difficile, et il est différent des autres techniques traditionnelles, telles que la microscopie confocale et inversée. Placez un laser à ondes continues avec trois longueurs d’onde de 405 nanomètres, 473 nanomètres et 532 nanomètres. Puis, apposer miroir un et l’aligner avec le plan miroir à 45 degrés à la poutre.Cela dirigera le laser vers le séparant de faisceau, qui forme la configuration d’éclairage à double face. Ensuite, passez le faisceau à travers un filtre de densité neutre de 50 millimètres de diamètre, un expandeur de faisceau, et un trou de broche de 25 millimètres de diamètre, tous positionnés à 150 millimètres les uns des autres. Passez le faisceau à travers un séparateurs de faisceau de 50-50, placés à 150 millimètres du sténopé.Ensuite, placez le miroir à deux 150 millimètres du séparateurs de faisceau, à 90 degrés au faisceau avant, et alignez-le de sorte que son plan miroir soit à un angle de 45 degrés par rapport au faisceau. Ensuite, placez le miroir à trois 100 millimètres du miroir deux, et alignez-le de sorte que son plan miroir est à un angle de 45 degrés au faisceau réfléchi à partir du miroir deux. Utilisez ce faisceau réfléchi pour former un côté de la feuille de lumière à double éclairage.De l’autre côté du séparant de faisceau, placez le miroir cinq de sorte que son plan de miroir soit à 45 degrés au faisceau qui est émis dans une direction avant. Utilisez le faisceau émis par le miroir cinq pour former le deuxième côté de la feuille de lumière à double éclairage. Ensuite, installez le système d’éclairage à double face de façon systémique.Placez la lentille cylindrique à deux 150 millimètres du miroir trois, et une autre lentille cylindrique identique à 150 millimètres du miroir cinq, de l’autre côté de la configuration à double éclairage. Ensuite, placez deux miroirs, chacun en ligne avec les lentilles cylindriques, à des distances de 50 millimètres pour refléter le faisceau à 90 degrés. Des deux côtés de la feuille de lumière, former un doublet achromatique à partir d’une paire de lentilles, avec la première lentille étant placé 100 millimètres du miroir précédent, et ayant un diamètre d’un pouce et une longueur focale de 100 millimètres.La deuxième lentille doit être placée à 160 millimètres de la lentille 1, avec un diamètre d’un pouce, et une longueur focale de 60 millimètres. Ensuite, placez les objectifs d’éclairage un et deux 150 millimètres des doublets achromatiques précédents, de sorte qu’ils soient en ligne avec le faisceau. Le faisceau émis par les objectifs forme la feuille de lumière pour l’imagerie des échantillons.Tout d’abord, préparer l’échantillon de perles fluorescentes en diluant une solution de perles de 0,53 micromètre, une à 150 000, dans une solution d’appariement de l’index réfractif préchauffé, avec une agarose pointante à faible fond de pourcentage. Ensuite, utilisez un morceau de tube en verre borosilicate avec un diamètre intérieur de 12 millimètres, et un diamètre extérieur de 18 millimètres, à une longueur de 30 millimètres. Pipette la solution d’agarose de perle dans le tube de borosilicate et permettent à l’agarose de se solidifier à température ambiante.Maintenant, remplissez une chambre ABS imprimée en 3D avec une solution gylcerol de 99,5 pour cent. Placer le tube en verre borosilicate, contenant les perles, à l’intérieur de la chambre. Fixez un stade translationnel motorisé 3D au tube en verre borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon à l’intérieur de la chambre ABS.Ensuite, utilisez un logiciel conçu sur mesure pour acquérir des images à l’aide de la caméra sCMOS, à raison de 30 images par seconde. À l’aide du contrôleur moteur, déplacez l’échantillon d’un millimètre dans la direction latérale et obtenez des images à chaque incrément d’un millimètre, jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été photographié. Empilez les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation et mesurez la fonction de propagation des points du système à l’aide de ces images de perles.Utilisez une solution d’appariement de l’index réfractif, avec un pH de 7,5, et dissolvez un pour cent de l’agarose dans la solution correspondante. Placez un échantillon de coeur de souris adulte effacé dans la solution d’appariement de l’index réfractif, avec un pour cent d’agarose dissous. Ensuite, insérez l’échantillon dans des tubes en verre borosilicate et laissez l’agarose se solidifier à température ambiante.Fixez une étape translationnelle motorisée 3D au tube en verre borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans une chambre ABS imprimée en 3D. Placez l’échantillon de sorte qu’il soit au centre du faisceau gaussien, créé par le système d’éclairage double. Ensuite, réglez le taux d’acquisition de la caméra sCMOS à 30 images par seconde.Maintenant, à l’aide du contrôleur moteur, déplacez l’échantillon d’un millimètre dans la direction axiane et acquérez des images à chaque incrément d’un millimètre. Continuez jusqu’à ce que l’ensemble de l’échantillon ait été illustré. Empilez les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation.Développez les images 3D à l’aide de ces piles d’images. Pour ce faire, déconvolez la fonction de propagation de points déterminée précédemment, et utilisez-la pour les piles d’images acquises. Enfin, définissez une valeur d’intensité seuil pixel pour observer les contours du cœur, et ajouter pseudo-couleur aux images, en fonction de cette intensité à l’échelle grise.Au premier jour post-natal, on peut visualiser les valves, l’atrium, le ventricule, le muscle pectinate, et la trabeculation, entre autres dispositifs. Au septième jour post-natal, les caractéristiques sont encore plus définies. L’oreillette, le ventricule, les dimensions ventriculaires de cavité, et l’épaisseur de mur de ventricule sont tous évidents.Pour étudier la différenciation des cardiomyocytes dans le cœur, les souris knock-in hétérozygotes ont été étiquetées en cre pour montrer des cardiomyocytes. Les cellules étiquetées sont montrées ici, dans chaque direction plane. Les trois plans ont été fusionnés, pour créer un rendu 3D du cœur.La région encerclée rouge dans l’encart montre deux cœurs de souris translucides après avoir subi la technique de clarté et d’être inséré dans le tube en verre borosilicate. En plus d’étudier les souris postnatales, le système d’imagerie peut également être utilisé pour étudier le cœur de souris adulte. Ici, les canaux ROMK marqués GFP sont affichés à 7,5 mois.Ceux-ci ont été principalement trouvés dans le mur ventriculaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en une à deux minutes. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’enlever toutes les bulles autour de l’échantillon dans le tube.D’autres méthodes, telles que la segmentation automatique des piles d’images, peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions liées aux lésions cardiovasculaires et à la régénération. Après son développement, cette technique a été utilisée par les chercheurs pour étudier l’architecture cardiaque dans les stades de développement postnatal et adulte chez la souris.

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Dans le cœur, les événements moléculaires coordonnent la fonction électrique et contractile de l'organe. Un ensemble de techniques de microscopie de fluorescence de champ locales présentées ici permet l'enregistrement des variables cellulaires dans les cœurs intacts. mécanismes définissant la fonction cardiaque Identifier est essentiel dans la compréhension comment le cœur fonctionne dans des situations pathologiques.

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Visualisation quantitative de l&#39;infiltration de leucocytes dans un modèle murin de myocardite fulminante par microscopie à feuilles lumineuses

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Analyse 3D simultanée des lésions cardiaques et de la réponse immunitaire dans l’infarctus aigu du myocarde reperfusé à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière

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Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

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