Name: Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Découvrez un protocole de séquençage bisulfite et un pipeline bioinformatique pour quantifier précisément la méthylation de l'ADN mitochondrial. Cette méthode améliore la fiabilité des analyses en mitoépigénétique.

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Novo Nordisk Foundation Centre for Basic Research métabolique est un centre de recherche indépendant à l’Université de Copenhague, partiellement financé par un don sans restriction de la Novo Nordisk Foundation.

1. traitement de l’Enzyme de Restriction
<ol><li>Linéariser ADNmt en traitant l’ADN humain total avec l’enzyme de restriction BamHI, qui coupe à position 14258 dans l’ADN mitochondrial humain. Remarque : Pour souris ADN, utiliser l’enzyme de restriction BglII dans des conditions identiques comme ci-dessous.</li>
	<li>Pour chaque échantillon où la méthylation de l’ADN mitochondrial doit être évaluée, préparer un tube de réaction de 0,2 mL et ajouter le mélange : 3 suivant μg ADN génomique (quantifié par fluorimétrie), 15 μl tampon de 3, 3 μL BamHI et l’eau jusqu'à 150 μL</li>
	<li>Placer les tubes dans un thermocycleur pendant 4 h à 37 ° C.</li>
</ol>2. Conversion de bisulfite
<ol><li>Convertir BamHI-a traité l’ADN à l’aide de bisulfite de sodium comme décrit ailleurs29.</li>
	<li>Utiliser 200-500 ng BamHI-a traité l’ADN de chaque réaction de conversion dans un volume total de 20 μL. La récupération de l’ADN est de 50 à 70 %.</li>
	<li>Éluer l’ADN Bisulfite-converti en tampon d’élution 10 μL.</li>
	<li>Quantifier l’ADN monocaténaire par fluorimétrie.</li>
	<li>En option : Stocker ADN bisulfite-converti à-20 ° C avant de passer le reste du protocole. Pour le stockage à long terme, stocker l’ADN bisulfite-converti à-80 ° C</li>
</ol>3. conception du Bisulfite de séquençage des amorces
<ol><li>Concevoir des amorces pour l’ordonnancement de bisulfite en utilisant les outils en ligne Methprimer30 et BiSearch31,32. Remarque : Methprimer et BiSearch permettent de rechercher des séquences de liaison d’amorces sur les séquences génomiques où les cytosines sont converties en thymines, de la même façon au bisulfite après traitement.</li>
	<li>D’amplification optimale et non biaisée, éviter dinucléotides dans les amorces et la taille de l’amplicon entre 100-300 bp de conception.</li>
	<li>S’assurer que les amorces sont spécifiques de l’ADN mitochondrial, à l’aide de la fonction de BiSearch Recherche de Primer. Insérer les amorces déjà conçu bisulfite converti, cocher la case de bisulfite et incluent un génome de référence et les paramètres de la PCR. NOTE : Une liste de produits PCR possibles s’affichera.</li>
	<li>Copiez le haut 1-5 séquences d’amorces et les coller dans un formulaire de commande pour la synthèse d’oligonucléotide. NOTE : Une liste de l’homme et des séquences d’amorces d’ADNmt souris qui a été validé en laboratoire est affiché dans le tableau 1.</li>
	<li>Des amorces de test à l’aide de bisulfite converti PCR Après électrophorèse sur gel d’agarose, tel que décrit à l’étape 4. Tester et optimiser toutes les paires d’amorces séparément et que la taille de l’amplicon correct apparaît sur le gel d’agarose. Remarque : Si le multiplexage amorces sont nécessaires, ajoutez plusieurs amorces à une simple réaction de PCR et visualiser les produits PCR sur gel d’agarose ou, une méthode plus résolutoire comme l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, pour distinguer des produits similaires taille.</li>
</ol>4. bisulfite converti PCR et Gel Extraction
<ol><li>Pour amplifier les régions d’intérêt, effectuer la PCR à l’aide d’une polymérase de Taq de démarrage à chaud. En bref, mix 100 ng converti ADN, 500 amorces sens et anti-sens µM, 1 µL dNTP mix (10 µM de chaque dNTP) et polymérase à 7,5 U/réaction dans un volume total de 50 µL. PCR exécuter dans les conditions suivantes : 5 min à 95 ° C (60 s 94 ° C ; 60 s 55 ° C * ; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 cycles ; 10 min 72 ° C. Utiliser les amorces soit séparément ou multiplexées.</li>
	<li>Facultatif : Lorsque le multiplexage des amorces, utilisation 200 ng converti ADN ainsi que les conditions suivantes de cyclisme : 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C ; 90 s 55 ° C * ; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 cycles ; 10 min 72 ° C. Remarque : La température peut varier selon la température de fusion d’amorces.</li>
	<li>Produits PCR soumis au gel d’électrophorèse sur agarose à 2 % à 100 volts.</li>
	<li>Sous la douce lumière UV, extraire des produits PCR avec un scalpel et ajouter aux microtubes. Ne pas exposer les produits PCR à la lumière UV excessive afin d’éviter des dommages à l’ADN. Éviter les temps d’exposition plus de 30 s.</li>
	<li>Purifier les produits PCR à l’aide de gel de purification comme décrit plus haut3.</li>
	<li>Quantifier l’ADN purifié de l’étape 4,5 à l’aide de fluorométrie. Passez à l’étape 5 ou Banque d’échantillons à-20 ° C.</li>
</ol>5. bisulfite séquençage bibliothèque préparation
<ol><li>Effectuer la préparation de la bibliothèque des produits PCR du bisulfite-converti. En option : multiplex produits PCR à ce stade.</li>
	<li>Effectuer fin-réparation à l’aide de jusqu'à 100 ng de produit PCR. Ajouter 3 préparation enzymatique µL fin et tampon de réaction réparation fin µL 6.5 (x 10) à 55,5 produit de PCR µL dans un tube de 0,2 mL. Placer et incuber les tubes dans un thermocycleur pendant 30 min à 20 ° C, suivie de 30 min à 65 ° C.</li>
	<li>Ligaturer les adaptateurs de séquençage en mélangeant l’ADN de fin-réparé alliant 15 µL Blunt/TA ligase, 2,5 µL adaptateur et exhausteur de ligature 1 µL. Si vous utilisez &lt; 100 produit de PCR ng comme entrée, diluer adaptateur 10 fois.</li>
	<li>Placez le mélange (étape 5.3) dans un thermocycleur et incuber pendant 15 min à 20 ° C. Mettre en pause le thermocycleur et ajouter 3 µl utilisateur Enzyme au tube. Mélanger et placer le tube dans le thermocycleur et incuber 15 min à 37 ° C.</li>
	<li>Taille sélectionnez l’ADN adaptateur-ligaturé à l’aide de perles Solid Phase réversible immobilisation (SPRI) avec des proportions variables de perles à l’ADN, selon la taille de produit PCR.</li>
	<li>Ajouter 13,5 µL H2O à ADN ligaturé à l’adaptateur d’étape 5.4 et 55 µL resuspendues SPRI Perles. Incuber à température ambiante pendant 5 min et place le tube sur un support magnétique. La solution est claire, transférer le surnageant dans un nouveau tube et jeter le tube contenant les perles. Remarque : Le surnageant contient l’ADN adaptateur-ligaturé et grands fragments non désirés sont liés aux talons mis au rebut.</li>
	<li>Ajouter 25 µL resuspendues SPRI perles au surnageant de point 5.6, mélanger, laisser incuber 5 min à température ambiante. Placer le tube sur le support magnétique et éliminer le surnageant lorsque la solution est claire. Remarque : Le surnageant mis au rebut contient des séquences d’ADN non désirées, alors que l’ADN adaptateur-ligaturé est lié aux perles.</li>
	<li>Bien que le tube sur le support magnétique, ajouter 200 µL 80 % d’éthanol (fraîchement préparé) pour laver les perles. Incuber 30 s et retirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape pour un total de 2 lavages.</li>
	<li>Alors que le tube soit sur support magnétique avec un couvercle ouvert d’air secs perles pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le tube de l’aimant, éluer l’ADN dans 23 µL de tampon d’élution et mélanger. Incuber à température ambiante pendant 2 min.</li>
	<li>Placer le tube sur un support magnétique et lorsque la solution est claire, transférer 2 µL dans une plaque à 96 puits PCR pour l’amplification PCR-pré (étape 5.14).</li>
	<li>Transférer le µL environ 21 reste dans un nouveau tube de 0,2 mL pour l’amplification PCR (étape 5.17). Remarque : Veillez à ne pas transférer les perles Perles peuvent inhiber les réactions enzymatiques des prochaines étapes.</li>
	<li>Passez à l’étape 5.14 ou Banque d’échantillons à-20 ° C.</li>
	<li>Effectuer l’amplification pre-PCR par RT-qPCR pour estimer le nombre de cycles nécessaire pour amplifier l’ADN ligaturé à l’adaptateur. Par réaction, ajouter ce qui suit dans la PCR 96 puits contenant l’ADN 2 µL (étape 5.11) sur plaque : 0,4 amorce d’Index µL, 0,4 amorce PCR universelle µL, 7,2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR master mix.</li>
	<li>Placer la plaque dans une machine PCR en temps réel et la plaque sous réserve des conditions suivantes : 30 s à 98 ° C (10 s 98 ° C ; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 cycles ; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Estimer le nombre de cycles d’amplification nécessaire pour chaque échantillon en soustrayant un Ct-valeur à la valeur Ct de la RT-qPCR de pré-amplification correspondant à la fin de la phase linéaire de la réaction PCR.</li>
	<li>Amplifier l’ADN ligaturé à l’adaptateur de l’étape 5.12 en mélangeant : 21 µL ADN, 25 µL PCR master mix, amorce de Index 1 µL, amorces de PCR universelle 1 µL et µL 2 H2O. Dans un thermocycleur, soumettre chaque échantillon aux conditions suivantes : 30 s à 98 ° C (10 s 98 ° C ; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [Ct calculée à l’étape 5.16] cycles ; 5 min 65 ° C. Remarque : N’oubliez pas d’utiliser uniquement une amorce d’Index par échantillon permettant de multiplexage. L’index est inséré au cours de la PCR.</li>
	<li>Purifier les perles SPRI de l’ADN amplifiés et éluer dans 22 µL de tampon d’élution.</li>
	<li>Contrôle qualité de la bibliothèque par la méthode de gel électrophorèse ou alternative. Recherchez les tailles de pointe bibliothèque correcte (taille de produit PCR et adaptateur).</li>
	<li>Estimer la taille moyenne de paires de bases du ou des produits bibliothèque par l’analyse du frottis : dans les paramètres globaux avancés, double-cliquez sur «tableau» selon l’analyse du frottis. Définir la zone de 100-1000 bp, puis cliquez sur OK. Sous la Table de la région, la région définie apparaît et bibliothèque de taille moyenne (bp) est calculée.</li>
	<li>Quantifier les bibliothèques par fluorimétrie. Passez à l’étape 6 ou bibliothèques de magasin à-20 ° C.</li>
</ol>6. prochaine génération séquençage
<ol><li>Calculer la concentration de nM de bibliothèques en utilisant la formule : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Diluer les bibliothèques à la même nM de concentration par exemple 2 nM (choisissez 4 nM, 2 nM, 1 nM, soit 0,5 nM selon les concentrations de bibliothèque). Mettre en commun toutes les bibliothèques pour réaliser un bassin de 2 bibliothèques nM.</li>
	<li>Dénaturer et diluer les bibliothèques suivant le guide d’instrument de séquençage. En bref : dénaturer la piscine nM 2 en ajoutant 0,2 N NaOH et incuber à température ambiante pendant 5 min. diluer le pool dénaturé à une dilution finale de 22:00. Dénaturer et diluer une bibliothèque de contrôles disponible dans le commerce à une dilution finale de 12:05. Dans un nouveau tube, côtoient la piscine de 22:00 20 % bibliothèque de contrôles 12:05. Remarque : Conversion de Bisulfite introduit une complexité très faible. 20 % contrôle bibliothèque spike-dans se traduira de meilleure qualité de séquençage.</li>
	<li>Exécuter une séquence de bout jumelé bp 150 à l’aide d’un instrument de séquençage en profondeur.</li>
</ol>7. calcul analyse - estimation méthylation niveaux
<ol><li>Générer des fichiers .fastq (ici appelés sample1_R1.fastq.gz et sample1_R2.fastq.gz), création d’un index de bismark du génome entier d’intérêt (ici dans un dossier appelé bismarkIndex) et s’assurer que la séquence génomique de chrM est disponible en fasta format (ici dans un dossier appelé Arca).</li>
	<li>Pré-traiter lectures pour éliminer les adaptateurs et biais introduit par les amorces : utilisez l’outil Trim_galore33. Retirez deux nucléotides de l’extrémité 5' de la se de lit avant et arrière. trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2 -o. /--jumelé trim1--sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Aligner les lectures prétraitées à l’ensemble du génome à l’aide de Bismark34 Bismark--queue d’aronde--bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz Remarque : Si un autre dispositif d’alignement est utilisé, s’assurer que les lectures qui ne peuvent pas être particulièrement bien alignés sont ignorées.</li>
	<li>Extrait lit cartographie du chromosome M, ici en utilisant Samtools35 samtools Trier -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM samtools index sample1_sorted.bam samtools Découvre -u sample1_sorted.bam chrM | samtools tri - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Extraire les informations de méthylation bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--complet--genome_folder. /./sample1_chrM.bam chrM</li>
	<li>Utiliser le .bedGraph, le .cov ou les fichiers CX_report.txt pour une analyse plus approfondie. Utilisez le fichier sample1_chrM.CX_report.txt pour la visualisation et l’analyse.</li>
	<li>Effectuer d’écrêtage plus loin dans l’étape de prétraitement, si plusieurs régions sont interrogées et un biais d’apprêt peut être visible dans les parcelles de M-partialité générées au cours du mappage. Reportez-vous à la documentation de Bismark pour plus d’informations.</li>
</ol>8. computational Analysis - Test des différences
<ol><li>Vérifiez que le fichier CX_report.txt contient 7 colonnes, chromosome (ici RMca), position, strand, nombre de lectures méthylés, le nombre de lectures non méthylés, C contexte et séquence environnant, pour tous les C sur le chromosome M.</li>
	<li>Comme le CX_report couvre chrM dans son intégralité, vérifier le sous-ensemble à l’ou les régions qui est amplifié.</li>
	<li>Utilisez les tests non paramétriques des différences entre les échantillons, tels que le test exact d’un pêcheurs pour individuel C ou un signe-test pour l’ensemble de la région. NOTE : Quantification sera souvent proche de 0 % de méthylation, qui est la raison pourquoi l’hypothèse de normalité n’est pas adaptée.</li>
	<li>De même, pour la visualisation, soit visualiser les quantiles ou calculer des intervalles de confiance de proportion binomiale.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes à déclarer.

Ici, nous fournissons un protocole de bisulfite de séquençage qui est spécifiquement conçu pour interroger la méthylation de l’ADN mitochondrial. Les différences avec le bisulfite de séquençage protocoles utilisés pour l’ADN génomique réside dans l’utilisation d’une étape de digestion préalable des enzymes de restriction et une analyse bioinformatique arrêt des faux positifs découlant de séquences NUMT.
Nous fournissons un protocole pour éviter les artefacts de bisulfite de séquençage lors d’e...

Le génome mitochondrial est une structure circulaire double brin de base environ 16,5 kilos (Ko), constituant un lourd et un brin de lumière. Le génome mitochondrial est présent en plusieurs exemplaires dans chaque cellule, maternellement hérité et encode les éléments essentiels de la chaîne respiratoire des complexes1. Semblables aux génomes bactériens et à la différence du génome nucléaire, le génome mitochondrial est organisé dans nombreuses structures secondaires et tertiaires, comme structures enroulé et surenroulé2, qui peuvent rendre l’accès difficile pendant le séquencement expériences,3.
Dans le noyau, la méthylation de l’ADN est une marque épigénétique étudiée qui joue un rôle dans de nombreux processus, notamment dans la régulation de l’expression des gènes. Dans les génomes de mammifères, la méthylation de l’ADN se produit principalement sur la position de l’anneau de pyrimidine de deoxycytidines, pour la plupart sur des dinucléotides CG (ou CpG) 5. Méthylation de la cytosine se trouve à 70 % de tous les CpG dans le génome des cellules somatiques et représente environ 1 % du total que des bases de l’ADN4. Méthylations de l’ADN ont également été recensés dans des contextes non-CpG, tels que le CpA, CpT et CpC et existent en différentes quantités dans l’ADN nucléaire, avec des valeurs jusqu'à 25 % de tous les cytosines méthylées dans les cellules souches embryonnaires5,6,7.
Alors que la méthylation de la cytosine du génome nucléaire est largement acceptée, l’existence de méthylation de l’ADN (ADN mitochondrial) mitochondriale est encore controversée. La première étude d’instruction ADNmt méthylation a été réalisée dans des cellules cultivées où la méthylation de l’ADN mitochondrial a été facilement détectée, mais à des niveaux inférieurs par rapport à l’ADN nucléaire8. Dans les cellules humaines et murines, méthylation de l’ADN mitochondrial a été également détectée à faibles doses (2-5 %). À l’aide d’essais en s’appuyant sur 5 méthylcytosine capture comme immunoprécipitation d’ADN méthylée (MeDIP) suivie d’une PCR quantitative, méthylation de l’ADN mitochondrial a aussi détectée dans diverses souris et les humains et les cellules lignes9,10, 11,,12. Utilisant des anticorps contre la 5-méthylcytosine dans une analyse ELISA ou spectrométrie de masse, des niveaux importants de méthylation de l’ADN ont été détectés des fractions mitochondriales purifiée13,14,15, 16. Toutefois, la plupart des essais dans les études susmentionnées a utilisé des techniques qui ne visaient pas à procurer une quantification absolue de méthylation de l’ADN à la résolution de base unique.
Analyse quantitative et résolutoire méthylation d’ADN peut être réalisée par une technique nommée « bisulfite de séquençage », qui tire parti de la propriété de bisulfite de sodium pour convertir non méthylé cytosine en uracile en simple brin ADN contexte17 . Moyen du séquençage de bisulfite, une constellation d’études a détecté la présence de la méthylation de la cytosine à différents niveaux. Méthylation de l’ADN mitochondrial dans la région de la boucle D, de la 12 s ou de la région de 16 s était facilement détectable à l’humain18,19,20,21,22,23 et souris24 tissus et cellules, cependant, avec une variabilité intrigante, de 1 à 20 % du totales cytosines dans toutes les études.
En comparaison avec ces nombreuses études, seules quelques études, y compris de notre groupe, ont contesté la présence de l’ADN mitochondrial méthylation3,25,26,27 ou conteste la pertinence biologique de niveaux très faibles d’ADNmt niveaux (inférieur à 2 %)28. Récemment, nous avons rapporté l’observation d’un artefact de bisulfite de séquençage potentiel au bisulfite ensemble mitochondrial séquençage3. On a démontré que la structure secondaire de l’ADN mitochondrial pourrait conduire à de faux positifs dans le séquençage de bisulfite, surestimant ainsi des niveaux de méthylation. Nous fournissons ici un protocole visant à prévenir un artefact de bisulfite de conversion de l’ADNmt. Ce protocole utilise une simple digestion enzymatique de l’ADN afin de perturber les structures secondaires de l’ADNmt et autorise l’accès complet au bisulfite selon un protocole de séquençage de bisulfite. En outre, nous fournissons un accompagnement pipeline bioinformatiques pour l’analyse du séquençage de bisulfite.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>Kit de méthylation-foudre de l’ADN EZ</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA</td><td>assay Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de test Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td><td>Qiagen</td><td># 203603&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit pour Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligoes pour Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>Puce ADN haute sensibilité</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit haute sensibilité dsDNA test</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs MiSeq v2 300 cycles</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle PhiX v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Système de détection PCR en temps réel</td><td>Biorad&nbsp ;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Instrument MiSeq</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’adn mitochondrial

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification de la méthylation de l’ADN peut être réalisée en utilisant le séquençage de bisulfite, qui tire parti de la propriété de bisulfite de sodium pour convertir non méthylé cytosine en uracile, dans un contexte d’ADN simple brin. Le séquençage du bisulfite peut être ciblée (par PCR) ou effectuée sur l’ensemble du génome et fournit une quantification absolue de la méthylation de la cytosine à la résolution de base unique. Compte tenu de la nature distincte de l’ADN nucléaire et mitochondrial, notamment dans la structure secondaire, adaptations des méthodes de séquençage de bisulfite pour étudier la méthylation de la cytosine dans l’ADN mitochondrial se référera. Structure secondaire et tertiaire de l’ADNmt peut en effet conduire à bisulfite de séquençage des artefacts conduisant à des faux positifs en raison de la piètre accès incomplet dénaturation de bisulfite à l’ADN simple brin. Nous décrivons ici un protocole utilisant une digestion enzymatique de l’ADN avec BamHI couplé avec pipeline analyse bioinformatique pour permettre une quantification précise de la cytosine niveaux de méthylation de l’ADN mitochondrial. En outre, nous fournissons des lignes directrices pour concevoir les amorces de séquençage de bisulfite spécifiques d’ADN mitochondrial, afin d’éviter de cibler les segments nucléaire MiTochondrial indésirables (NUMTs) inséré dans le génome nucléaire.

Deux étapes dans le présent protocole sont cruciales lors d’enquêtes sur la méthylation de l’ADN mitochondrial. 1) l’ouverture de la structure secondaire et 2) le design des amorces de spécifique de l’ADN mitochondriales.
Par digestion de l’ADN du génome humain avec l’enzyme de restriction BamHI (Figure 1), la structure de l’ADN mitochondriale sera réduite à la position de nucléotides 14 258 et la s...

Nous présentons ici un protocole pour permettre une quantification précise de la méthylation de l’ADN (ADN mitochondrial) mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons une digestion enzymatique de l’ADN avec BamHI couplé avec un pipeline d’analyse bio-informatique qui peut être utilisé pour éviter une surestimation des niveaux de méthylation de l’ADNmt causée par la structure secondaire de l’ADNmt.

Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

L’objectif global de ce protocole de séquençage au bisulfite et de ce pipeline bioinformatique est d’obtenir une quantification précise de la méthylation de l’ADN mitochondrial. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mitoépigénétique, telles que : la méthylation de l’ADN mitochondrial modifie-t-elle la maladie humaine ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification précise de la méthylation de l’ADN mitochondrial.L’étape cruciale lors de l’étude de la méthylation de l’ADN mitochondrial consiste à linéariser l’ADN mitochondrial par digestion BamH1 avant le traitement au bisulfite de sodium. Le site de l’enzyme de restriction BamH1 est représenté sur cette carte du génome mitochondrial humain. Les cinq régions du génome mitochondrial qui seront étudiées par séquençage au bisulfite sont également présentées.Boucle de déplacement, ARNt phénylalanine et ribosome 12S, ribosome 16S, NADH déshydrogénase 5, gène codant pour l’ARNm du cytochrome B. Après avoir conçu les amorces pour le séquençage du bisulfite, à l’aide d’outils en ligne tels que décrits dans le protocole textuel, la spécificité de l’amorce envers le génome mitochondrial est vérifiée à l’aide de BiSearch. Les séquences d’amorces sont ajoutées à la fonction BiSearch.La case bisulfite est cochée et un génome de référence est sélectionné. Les résultats de la recherche montreront les produits PCR potentiels générés sur des chaînes sensorielles et antisens. Pour amplifier les régions d’intérêt du génome mitochondrial converti au bisulfite, effectuez une PCR à l’aide d’une polymérase Taq à démarrage à chaud.Si vous utilisez les amorces séparément, mélangez 100 nanogrammes d’ADN converti, 500 micromolaires d’amorces sens et antisens, un mélange dNTP dNTP d’un microlitre et une polymérase à 7,5 unités par réaction dans un volume total de 50 microlitres. Exécutez la PCR dans les conditions suivantes : cinq minutes à 95 degrés Celsius, une minute à 94 degrés Celsius, une minute à 55 degrés Celsius, une minute à 72 degrés Celsius pendant 35 cycles, suivie de 10 minutes à 72 degrés Celsius. Pour multiplexer les amorces, utilisez 200 nanogrammes d’ADN converti dans les conditions de cycle suivantes : cinq minutes à 95 degrés Celsius, une minute à 94 degrés Celsius, 1,5 minute à 55 degrés Celsius et 1,5 minute à 72 degrés Celsius pendant 35 cycles, suivis de 10 minutes à 72 degrés Celsius.Lorsque la PCR est terminée, effectuez une électrophorèse sur gel sur les produits PCR, à l’aide d’un agarose à 2 % à 100 volts. L’extraction des produits PCR du gel d’agarose doit se faire de manière à minimiser l’exposition aux UV et le risque de dommages à l’ADN. Prenez une photo du gel sous la lumière UV.Ensuite, très rapidement, marquez autour du produit PCR avec un scalpel et éteignez la lumière UV. Ensuite, coupez lentement le produit PCR sans l’exposer à la lumière UV. Placez les tranches de gel dans des tubes de microcentrifugation et purifiez les produits PCR en utilisant la purification sur gel comme décrit dans le protocole de texte.Quantifiez l’ADN purifié à l’aide de la fluorométrie. Conservez les échantillons à 20 degrés Celsius, si ce n’est pas le cas immédiatement, préparez la banque de séquençage au bisulfite. Commencez la préparation de la bibliothèque de produits PCR convertis au bisulfite en effectuant une réparation finale à l’aide d’un maximum de 100 nanogrammes de produit PCR.À chaque tube de 0,2 millilitre, ajoutez 55,5 microlitres de produit PCR, trois microlitres d’enzyme de préparation d’extrémité et 6,5 microlitres de tampon de réaction de réparation d’extrémité 10X. Incuber les tubes dans un thermocycleur à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, ligaturez les adaptateurs de séquençage en mélangeant l’ADN réparé à l’extrémité avec 15 microlitres de mélange Blunt/TA ligase, 2,5 microlitres d’adaptateur et un microlitre d’amplificateur de ligature.Placez le mélange dans un thermocycleur et incubez à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Mettez le thermocycleur en pause et ajoutez 3 microlitres d’enzyme USER dans chaque tube. Mélangez et remettez les tubes dans le thermocycleur et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Taille : sélectionnez l’ADN ligaturé par l’adaptateur à l’aide de l’immobilisation réversible en phase solide ou SPRI. Ajoutez à l’ADN ligaturé par adaptateur 13,5 microlitres d’eau et 55 microlitres de billes SPRI remises en suspension. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Placez les tubes sur un support magnétique. Lorsque la solution est claire, transférez le surnageant, contenant l’ADN ligaturé par l’adaptateur, dans un nouveau tube et jetez le tube contenant les billes. Ajouter 25 microlitres de billes SPRI remises en suspension au surnageant ; Mélangez et incubez à température ambiante pendant cinq minutes.Placez les tubes sur le support magnétique et, lorsque la solution est claire, jetez le surnageant. L’ADN ligaturé par l’adaptateur est maintenant lié aux billes. Pendant que les tubes sont sur le support magnétique, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparé dans chaque tube et incubez pendant 30 secondes pour laver les billes.Retirez et jetez le surnageant. Répétez cette étape de lavage à l’éthanol pour un total de deux lavages. Retirez l’éthanol du deuxième lavage et faites sécher les billes à l’air libre en laissant les tubes sur le support magnétique, avec le couvercle ouvert, pendant cinq minutes.Au bout de cinq minutes, retirez les tubes du support magnétique, ajoutez 23 microlitres de tampon d’élution d’ADN aux billes et mélangez. Incuber à température ambiante pendant deux minutes. Placez les tubes sur le support magnétique jusqu’à ce que la solution soit claire.Ensuite, transférez deux microlitres de la solution sur une plaque de PCR à 96 puits pour l’amplification pré-PCR. Tout en évitant soigneusement les billes, transférez le reste de la solution dans un nouveau tube de 0,2 millilitre pour l’amplification par PCR. Effectuez une amplification pré-PCR par RT-qPCR pour estimer le nombre de cycles nécessaires à l’amplification de l’ADN ligaturé par l’adaptateur.Préparez un mélange maître des éléments suivants par réaction utilisée : 0,4 microlitre d’amorce d’indice, 0,4 microlitre d’amorce PCR universelle, 7,2 microlitres d’eau et 10 microlitres de mélange maître RT-qPCR. Ensuite, mélangez le mélange principal et ajoutez 18 microlitres de mélange principal aux deux microlitres d’ADN dans la plaque PCR à 96 puits.Placez la plaque dans une machine PCR en temps réel et effectuez l’amplification dans les conditions suivantes : 30 secondes à 98 degrés Celsius, 10 secondes à 98 degrés Celsius et 75 secondes à 65 degrés Celsius pendant 20 cycles, suivies de cinq minutes à 65 degrés Celsius. Après avoir estimé le nombre de cycles d’amplification nécessaires pour chaque échantillon, comme décrit dans le protocole textuel, amplifiez l’ADN ligaturé par l’adaptateur. Pour chaque échantillon, mélangez 21 microlitres d’ADN, 25 microlitres de mélange maître PCR, un microlitre d’amorce d’index, un microlitre d’amorce PCR universelle et deux microlitres d’eau.Dans le thermocycleur, soumettez chaque échantillon aux conditions suivantes : 30 secondes à 98 degrés Celsius, 10 secondes à 98 degrés Celsius et 75 secondes à 65 degrés Celsius pour le nombre de cycles calculé, suivi de cinq minutes à 65 degrés Celsius. Purifier l’ADN amplifié à l’aide de billes SPRI, comme démontré précédemment, et éluer dans 22 microlitres de tampon d’élution. Contrôlez la qualité de la banque à l’aide d’un bioanalyseur.Recherchez les tailles de pic de bibliothèque correctes. Estimez la taille moyenne de la paire de bases des produits de bibliothèque par analyse de frottis. Dans les paramètres globaux avancés, sous Analyse du frottis, double-cliquez sur Table.Recherchez la région de 100 à 1000 paires de bases et cliquez sur OK. Sous Table des régions, la région définie s’affiche et la taille moyenne de la bibliothèque est calculée. Quantifier la bibliothèque par fluorométrie. Stockez la bibliothèque à 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête pour le séquençage et les analyses informatiques de nouvelle génération.Par séquençage au bisulfite, la méthylation de l’ADN mitochondrial a été étudiée dans l’ADN total non digéré et digéré des cellules musculaires squelettiques humaines dans cinq régions différentes du génome mitochondrial. Un carré complet représente les sites dinucléotidiques de la cytosine guanine. Le carré ouvert représente les sites dinucléotidiques de guanine non cytosine.Pour l’ADN mitochondrial non digéré, les niveaux de méthylation variaient de 0 à 15,1 % dans toutes les régions étudiées. Cependant, lorsque l’ADN a été digéré avant la conversion au bisulfite, le taux d’uncoversion a chuté à un maximum de 1 % dans toutes les régions. Cela illustre l’importance de la digestion de BamH1 avant la conversion au bisulfite pour éviter la surestimation des niveaux de méthylation de l’ADN mitochondrial.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer le séquençage du bisulfite mitochondrial, et en suivant notre pipeline bioinformatique, vous pouvez obtenir une quantification précise de la méthylation de l’ADN mitochondrial.

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Cette vidéo montre le protocole pour immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP). MeDIP est une procédure de deux jours qui extrait sélectivement des fragments d'ADN méthylé à partir d'un échantillon d'ADN génomique en utilisant des anticorps avec une spécificité pour la 5-méthylcytosine (anti-5 MC).

Immunoprécipitation ADN méthylé

L'étalon-or pour l'analyse de la méthylation de l'ADN est le séquençage génomique de l'ADN au bisulfite convertis. Cette méthode tire parti de la sensibilité accrue de la cytosine par rapport à 5-méthylcytosine (5-MeC) au bisulfite désamination dans des conditions acides. Cytosines non méthylées peuvent être distingués des cytosines méthylées après amplification par PCR de l'ADN génomique cible.

Méthylation de l&#39;ADN: bisulfite de modification et d&#39;analyse

Un flux de travail simplifié pour étudier méthylation de l'ADN et des modifications d'expression des gènes lors de début de la vie de stress est montré. A partir de la séparation maternelle des souriceaux nouveau-nés et l'isolement des tissus cérébraux distincts, nous représentons un protocole à la fois isoler l'ADN et l'ARN à partir de poinçons de tissus cérébraux pour le séquençage du bisulfite de suite et analyse RT-PCR.

Analyse de la méthylation de l&#39;ADN Optimisé et d&#39;expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

Cette vidéo décrit la technique du dot-blot pour déterminer le niveau de méthylation de l’ADN dans les chondrocytes humains in vitro via le transfert d’échantillons d’ADN sur une membrane en nylon et la visualisation ultérieure à l’aide d’anticorps monoclonaux. Cela permet de déterminer le phénotype des chondrocytes à différents stades de la culture.

5-Methylcytosine dot Blot pour déterminer l’étendue de la méthylation de l’ADN

Le séquençage au bisulfite amélioré est une méthode de préparation de banques de séquençage pour l’analyse de la méthylation de l’ADN basée sur la digestion enzymatique de restriction combinée à la conversion de la cytosine au bisulfite. Ce protocole nécessite 50 ng de matériel de départ et fournit des données de résolution de paires de bases dans des régions génomiques riches en GC.

Enhanced réduit Représentation bisulfite séquençage pour l&#39;évaluation de méthylation de l&#39;ADN à la résolution de paires de base

Le séquençage d’amplicon au bisulfite (BSAS) est une méthode de quantification de la méthylation de la cytosine dans les régions génomiques ciblées d’intérêt. Cette méthode utilise la conversion au bisulfite associée à l’amplification par PCR des régions cibles avant le séquençage de nouvelle génération pour produire une quantification absolue de la méthylation de l’ADN à un niveau spécifique à la base.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

Les ADN méthyltransférases sont des cibles potentielles de médicaments anticancéreux. Ici, un protocole est présenté pour évaluer les petites molécules pour l’inhibition de l’ADN méthyltransférase. Ce test utilise une endonucléase pour coupler la méthylation de l’ADN à la génération de fluorescence et permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel.

Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

Les tests de pyroséquençage permettent le génotypage robuste et rapide des polymorphismes mononucléotidiques de l’ADN mitochondrial dans des cellules ou des tissus hétéroplasmiques.

Génotypage de polymorphismes mononucléotidiques dans le génome mitochondrial par pyroséquençage

Une procédure d’étude de la dynamique du métabolisme de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules à l’aide d’un format de plaque multipuits et d’une imagerie automatisée par immunofluorescence pour détecter et quantifier la synthèse et la distribution de l’ADNmt est décrite. Cela peut être utilisé pour étudier les effets de divers inhibiteurs, stress cellulaires et silençage génique sur le métabolisme de l’ADNmt.

Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

Découvrez un protocole de séquençage bisulfite et un pipeline bioinformatique pour quantifier précisément la méthylation de l'ADN mitochondrial. Cette méthode améliore la fiabilité des analyses en mitoépigénétique.

Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial

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