Name: Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez la technique smFISH pour quantifier les ARN dans la levure à bourgeon pendant la croissance végétative et la méiose. Cette méthode révèle la variabilité de l'expression génique et la localisation subcellulaire des ARN.

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Nous remercions Anne Dodson et Stephanie Heinrich pour obtenir des conseils sur la façon d’optimiser le protocole smFISH, Xavier Darzacq pour aider avec la plateforme d’analyse, Haiyan Huang pour obtenir des suggestions sur l’analyse statistique. Ce travail a été soutenu par des fonds de la March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) et Glenn Foundation à EÜ et un NSF Graduate Research Fellowship Grant n DGE-1106400 à JC.

Remarque : Tous les tampons et les supports utilisés dans le présent protocole sont répertoriés dans le tableau 1. Les informations sur le fournisseur pour les réactifs sont répertoriées dans la Table des matières.
Jour 1/jour 1-2 :
Remarque : Pour la culture végétative, la croissance de cellules à une OD600 de 0,4 à 0,6 dans un milieu privilégié. Pour la culture méiotique, induire des cellules subissent la méiose à l’aide d’une méthode préférée (généralement mise en culture dans un OD600 de 1,85).
1. la Fixation et la Digestion de l’échantillon
<ol><li>Fixer un total de ~3.5 OD600 des cellules à 3 % de formaldéhyde.<ol>
<li>Pour la culture végétale, ajouter 5,52 mL de culture à 480 µL de 37 % de formaldéhyde dans les tubes coniques 15 mL.</li>
		<li>Pour la culture méiotique, ajouter 1840 µL de culture à 160 µL de 37 % de formaldéhyde dans les tubes de microcentrifuge de 2 mL. Inverser ~ 5 fois pour mélanger. ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique. Manipuler et l’éliminer conformément aux règlements institutionnels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer les tubes sur un tambour de rouleau à température ambiante pendant 20 min. Pour échantillons méiotiques, après fixation à température ambiante pendant 20 min, continuent de fixation durant la nuit à 4 ° c, tournant. Remarque : La fixation d’une nuit ou plus augmente la reproductibilité et la qualité des données smFISH obtenues pour les échantillons de la méiose. Temps de fixation doit être optimisé.</li>
	<li>Alors que les échantillons sont fixation, décongelez 200 mM vanadyle ribonucléosides Complexes (RVC) à 65 ° c pendant au moins 10 min.</li>
	<li>Préparer le mélange maître digestion dans un tube de 15 mL : pour 1 échantillon, mélanger 425 µL de tampon B 40 µl de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) ; pour 5 échantillons, mélanger 2125 µL de tampon B avec 200 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c). Vortex ~ 5 s pour tout remettre en suspension le VRC avant d’ajouter au mélange maître, qui apparaîtra vert brunâtre clair après addition de VRC. NOTE : Ajout de VRC durant la digestion améliore la cohérence des résultats smFISH, potentiellement en inhibant le contaminant nucléase introduit par le mélange de zymolyase, qui est purifié à partir d’extrait brut. Le montant nécessaire à cette étape de VRC doit être optimisé.</li>
	<li>Pour les échantillons végétatives, centrifuger les tubes à ~ 1057 x g pendant 3 min. Pour les échantillons méiotiques (après fixation au jour le jour), centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. décanter ou aspirer le surnageant pour déchets de formaldéhyde. Remarque : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 1,5 mL de froid tampon B par pipetage de haut en bas ou en inversant les tubes et pichenette pour mélanger. Transférer les échantillons végétatives aux tubes de 2 mL après remise en suspension.</li>
	<li>Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. Retirer la majeure partie du liquide par aspiration sous vide ou en pipettant également, laissant derrière eux de ~ 100 µL.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules de 1,5 mL de froid tampon B.</li>
	<li>Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. Retirer la majeure partie du liquide par aspiration sous vide ou en pipettant également, laissant derrière eux de ~ 100 µL.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 1,5 mL de froid tampon B. Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. aspirer le liquide complètement par le vide ou en pipettant également.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules en 425 µL du mélange principal de la digestion et brièvement vortex pour remettre en suspension. Ajouter 5 µL de 100 t zymolyase de 10 mg/mL dans chaque tube. NOTE : Vortex le zymolyase chaque fois avant d’ajouter aux tubes. Ajouter zymolyase dans chaque tube individuellement, plutôt que d’ajouter au mélange maître. Les deux étapes aident à maintenir la cohérence de la digestion chez les tubes parce que zymolyase précipite rapidement.</li>
	<li>Vortex 2-3 s pour mélanger. Placer les tubes sur un tambour de rouleau et digérer à 30 ° c pendant 15 à 30 min. Pour les cellules végétatives et les premiers stades de la méiose, cela prend habituellement environ 15 min, et pour la prophase méiotique et divisions méiotiques, cela prend habituellement environ 30 min. Remarque : Vérifiez le microscope toutes les 5 min après 15 min et arrêter la digestion lorsqu’environ 80 % des cellules apparaissent opaques et non réfraction. Partir de ce moment, les cellules sont très fragiles. Gérer les cellules doucement et évitez d’utiliser aspiration intra-utérine ou Vortex.
</li>
	<li>Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide complètement en pipettant également.</li>
	<li>Resuspendre doucement les cellules avec 1 mL de tampon B en pipettant également monter et descendre 1 ou 2 fois pour mélanger.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer tampon B liquide de pipetage. Doucement remettre en suspension les cellules dans 1 mL d’éthanol à 70 % (dilué avec de l’eau exempte de RNase).</li>
	<li>Incuber 3,5 à 4 heures à température ambiante.</li>
</ol>2. l’hybridation
<ol><li>Ramener la formamide à température ambiante (pour 50 mL partie aliquote, il faut environ 30 min au bain-marie). Remarque : Ne pas ouvrir la bouteille de formamide jusqu'à ce que la bouteille atteigne la température de la pièce pour éviter l’oxydation du formamide. ATTENTION : Le Formamide est toxique. Manipuler et l’éliminer conformément aux règlements institutionnels.</li>
	<li>Préparer le tampon de lavage 10 % formamide dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer 500 µL d’éthanol à 70 % de pipetage. Doucement pipette up et down pour remettre en suspension les cellules restantes et ensuite transférer les cellules des tubes de faible adhérence. NOTE : Utilisant des tubes à basse adhérence grandement réduit la perte de cellules pendant les lavages ultérieurs.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. retirer tout l’éthanol par pipetage.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage 10 % formamide et doucement pipette haut et en bas 2 ou 3 fois pour remettre les cellules en suspension.</li>
	<li>Laissez les cellules de s’asseoir à la température ambiante pendant environ 20 min pendant la préparation de la Solution d’hybridation. Pour 1 échantillon, mélanger 50 µL de tampon d’hybridation (température ambiante), 5 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) et 1 µL de chaque sonde (200 nM final). Pour 5 échantillons, mélangez 250 µL de tampon d’hybridation (température ambiante), 25 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) et 5 µL de chaque sonde (200 nM final).<ol>
<li>Décongeler le tampon d’hybridation (congelés à-20 ° c) à température ambiante avant d’ouvrir le tube pour éviter l’oxydation du formamide.</li>
		<li>Après avoir ajouté le 200 mM RVC, Vortexer pendant 5-10 s avant d’ajouter les sondes, qui sont conçus et achetés dans le commerce et reconstitués selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Si les deux sondes sont conjointement mis en incubation, ajouter 1 µL de la 01:10 dilution de la sonde #1, ainsi que 1 µL de la 01:10 dilution du stock sonde #2, faire une dilution finale de ~ 1/500 pour chaque sonde. La concentration nécessaire pour le meilleur rapport de signal-bruit doit être optimisé (voir Discussion pour plus de détails).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide surnageant dans les déchets dangereux en pipettant également.</li>
	<li>Ajouter au moins 50 µL de Solution d’hybridation dans chaque tube. Feuilleter les tubes à mélanger.</li>
	<li>Incuber à 30 ° c sur un tambour de rouleau au moins 16 heures dans l’obscurité.</li>
</ol>2/jour 3
3. laver et imagerie
<ol><li>Ramener la formamide à température ambiante.</li>
	<li>Préparer 10 % formamide tampon de lavage (FWB) dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Retirer les tubes de l’enrouleur de rouleau et rangez-les dans une boîte recouvert de papier pour protéger de la lumière.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide surnageant dans les déchets dangereux en pipettant également.</li>
	<li>Remettre en suspension dans 1 mL de 10 % FWB par pipetage doucement haut et en bas 2 - 3 fois.</li>
	<li>Incuber à 30 ° c pendant 30 min (non rotative) dans la zone couvertes de papier.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pour 3 min. Retirez le surnageant de déchets dangereux en pipettant également et de laisser ~ 50 µL.</li>
	<li>Pendant ce temps, préparer DAPI/FWB dans un tube conique de 15 mL : pour 1 échantillon, se mêlent 1000 µL de tampon de lavage 10 % formamide 1 µL de 5 mg/mL DAPI. Pour 10 échantillons, mélanger 10 mL de tampon de lavage 10 % formamide avec 10 µL de 5 mg/mL DAPI. Remettre en suspension dans 1 mL de DAPI/FWB par pipetage doucement haut et en bas 2 - 3 fois.</li>
	<li>Incuber à 30 ° c pendant 30 min (non rotative) dans la zone couvertes de papier.</li>
	<li>Décongeler les réactifs anti-eau de Javel sur la glace.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant complètement en pipettant également. Le cas échéant, centrifuger à nouveau pour retirer tout le liquide surnageant.</li>
	<li>Pour les échantillons qui ne sont pas immédiatement imagés, resuspendre le culot dans 50 µL de tampon de GLOX sans enzymes. Pipette de haut en bas 3 ou 4 fois pour mélanger.<ol>
<li>Conserver tous les échantillons unimaged dans la zone couvertes de papier à 4 ° c jusqu’au moment d’image. Lorsque vous êtes prêt pour l’image, centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 2 min et retirez le surnageant complètement en pipettant également. Resuspendre dans GLOX avec enzymes comme ci-dessous.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour les échantillons étant imagés immédiatement, ajouter 15 à 20 µL de tampon GLOX avec des enzymes. Doucement pipette de haut en bas pour mélanger. Remarque : Le volume ajouté peut varier selon la taille du culot cellulaire. Nous vous recommandons resuspendant le culot dans 15 µL de tampon GLOX avec des enzymes et vérifier la densité cellulaire sur le microscope. Si les cellules sont trop denses (cellules agglutinées les unes sur les autres), ajoute le tampon GLOX supplémentaire avec des enzymes. Si les cellules sont trop rares, centrifuger l’échantillon et supprimer ~ 5 µL de tampon.</li>
	<li>Pipette 5 µL sur une lamelle couvre-objet (18 mm x 18 mm, n ° 1) et de mettre la lamelle couvre-objet sur une diapositive.</li>
	<li>Mettre une lingette de laboratoire sur le dessus de la diapositive où se trouve la lamelle. Appuyez doucement sur la lingette de laboratoire pour définir la diapositive (voir liquide se détacher de ses quatre bords de la lamelle).</li>
	<li>Transférer la lame à la salle du microscope dans une boîte recouverte de papier d’aluminium.</li>
	<li>Image en utilisant un microscope à fluorescence de grand champ à fort grossissement (X 60-100) et de forte ouverture numérique. Remarque : Afin de recueillir le nombre maximal de photons émis par les sondes smFISH, microscopes confocaux sont déconseillées, car elles limitent considérablement la quantité de lumière à collecter. Ici, les données ont été recueillies sur un microscope équipé d’une 100 X, objectif 1.4 de NA, à l’aide de filtres CY5 (EX632/22, EM679/34) photographié à 1,3 s, 100 % T ; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1,3 s, 100 % T ; et DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05 à 0,1 s, T. 32-50 % Une image de référence de champ lumineux devrait également être acquise. Acquérir des tranches de 15 à 25 avec une taille d’étape de 0,1 à 0,2 µm, d’entièrement au-dessous de la mise au point du champ de vision tout à fait indiqué ci-dessus, afin de vous assurer que toutes les taches de RNA sont prises en compte.</li>
</ol>4. image Analysis
<ol><li>Analyser les données de smFISH avec smFISH publié des outils d’analyse tels que poissons-quant17 et StarSearch2, ou avec des programmes sur mesure, selon les besoins de l’expérience. Remarque : Un pipeline bonne analyse devrait permettre aux utilisateurs de déterminer un seuil pour séparer les taches de RNA vrais de l’arrière-plan et statistiques telles que les coordonnées X, Y et Z de (facultatives) et l’intensité de chaque tache, le nombre de places dans chaque cellule de sortie et éventuellement des paramètres d’ajustement comme un moyen de filtrer les fausses détections.</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li>
<li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+in+numbers%3A+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li>
<li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li>
<li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506(2011).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).</li>
<li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li>
<li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li>
<li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li>
<li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li>
<li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li>
<li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORSEN%2C+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements%3A+mRNA-mitochondria+distance%2C+from+single-cell+to+population+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417(2017).</li>
<li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-quant%3A+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li>
<li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007(2015).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li>
<li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Le protocole présenté ici est dérivé d’autres protocoles de smFISH publié2,3,21,22,23et a été spécifiquement optimisé pour le fond de la souche de levure SK1. Les paramètres optimisés inclus le nombre de cellules, durée de fixation, vitesse de centrifugation et durée, durée de la digestion, tampon de digestion, concentration de sonde et tampon d’hybridation. D’autres paramètres comme la température d’hybridation et de la durée n’étaient pas optimisés. Dans cette section, nous partageons quelques notes qui permettraient d’adapter ce protocole à n’importe quel fond de souche de levure et les conditions de croissance d’intérêt.
La paroi cellulaire de la levure de bière est un des défis majeurs contre l’obtention d’images de haute qualité smFISH dans la levure de bière parce que la paroi cellulaire empêche la pénétration de la sonde. Une digestion incomplète de la paroi cellulaire par zymolyase mène à inefficace hybridation des sondes et forte variabilité de cellule-à signal. Cependant, digestion excessive peut rendent les cellules trop fragile, conduisant à l’importante perte de cellules au cours des étapes de lavage et éclatement au cours de la préparation pour l’imagerie de cellules. Ainsi, il est essentiel d’optimiser la durée de la digestion. Il est recommandé de mener une expérience pilote smFISH de digérer l’échantillon même pour des quantités différentes de temps. Dans notre cas, nous avons obtenu les meilleures données smFISH si nous nous sommes arrêtés la digestion lorsqu’environ 80 % des cellules sont devenus non réfraction. En général, pour les mêmes conditions de croissance, différentes souches mutantes génétiques peuvent être digérées avec un timing similaire. Toutefois, la durée de la digestion se distingue par comparaison entre les différentes conditions de croissance et les différentes étapes de la méiose chez la levure de bière. Une fois que le calendrier est déterminé, la qualité de smFISH est reproductible. Remarque que pour les souches mutantes avec la synthèse de la paroi de cellules défectueuses et/ou la composition, la digestion peut être complétée en moins de 15 min. utilisation des différents lots de zymolyase peut aussi légèrement changer le moment de la digestion.
Concentration optimale de sonde est nécessaire pour obtenir un rapport signal sur bruit élevé. Nous avons conçu et acheté nos sondes de smFISH dans le commerce. Bonnes sondes (souvent 20-mers) devraient avoir un pourcentage de GC allant de 35 % à 45 %, un espacement minimum de 2 paires de bases entre les sondes et faible réactivité croisée. Nous avons utilisé un concepteur de sonde sur le web du fabricant pour générer une liste de sondes, et s’il y avait assez de sondes au choix, nous utiliserions l’algorithme BLAST dans la base de données du génome Saccharomyces pour éliminer les sondes avec plus de 17 paires de bases que se chevauchés avec d’autres régions génomiques. Nous avons choisi le plus PhotoStation colorant fluorescent (CAL Fluor 590) pour l’ensemble de la sonde qui recuits à la région unique de NDC80luti (CF 590) parce que dans cette série, le nombre de sondes qui satisfait tous les critères ci-dessus (20 sondes) était inférieur à la nombre minimum recommandé par le fabricant (~ 25 sondes). Après reconstitution de la solution de sonde suivant les instructions du fabricant, nous avons fait un 01:10 dilution de la solution mère et stocké de la solution diluée en aliquotes de 5 µL à-20 ° c. Chaque aliquote a été utilisé qu’une seule fois. Pour l’optimisation, on devrait faire série dilutions à partir du 01:10 dilué de solution et test dont la concentration donne le meilleur rapport signal sur bruit. Nous recommandons de faire une série de dilution de 1/250, 1/500, 1/1000 et 1 : 2000 de la souche originale. Dans notre cas, un facteur de dilution de 1/500 a entraîné le meilleur rapport signal-bruit, pour les ensembles de sondes CF 590 tant Q 670.
Temps de fixation optimale est également critique pour le succès smFISH dans la levure de bière. Nous trouvé que la fixation pendant la nuit à 4 ° c, plutôt que fixation à température ambiante pendant 20 min, nettement amélioré la cohérence et la qualité des résultats smFISH pour les échantillons de la méiose. Bien que nous n’avons pas testé comment du jour au lendemain la fixation peut influer sur les échantillons végétatives, fixation à la température ambiante a bien fonctionné pour cette condition de croissance. Ainsi, pour optimiser le protocole smFISH de nouvelles souches ou de conditions de croissance, nous vous recommandons commençant par temps de fixation courte à température ambiante et en augmentant le temps de fixation si forte variabilité du signal est rencontrée.
Par rapport aux autres protocoles publiés3,22,23, notre protocole utilise l’inhibiteur de RNase VRC au cours de la digestion et une concentration plus élevée de VRC au cours de l’hybridation. Ajout de VRC dans ces deux étapes a amélioré la cohérence des résultats smFISH, peut-être de mieux préserver les molécules d’ARN contre activité nucléasique, qui peuvent être apportés par le mélange de zymolyase (l’enzyme est purifié à partir des extraits bruts et peut contenir la RNase contaminants). Ainsi, nous recommandons d’utiliser la quantité de VRC énumérés dans notre protocole ou encore des concentrations plus élevées de VRC pour l’optimisation.
Une partie importante des cellules peut être perdue au cours des étapes de lavage en tampon B et le tampon de lavage de formamide. Pour réduire la perte de cellules, on pourrait augmenter la vitesse de centrifugation. Dans notre cas, en utilisant une vitesse élevée (21 000 x g) pour granuler nos échantillons au cours de la mémoire tampon B lave la perte de cellules sensiblement réduite. Cependant, les cellules deviennent très fragiles après digestion zymolyase, changement de vitesse de centrifugation n’est donc pas recommandé. Au lieu de cela, nous vous suggérons d’utiliser les tubes de faible adhérence des scientifiques aux USA, qui grandement aident les cellules à pellets pendant les lavages dans le tampon de lavage de formamide. Dans l’ensemble, notre protocole peut générer systématiquement une monocouche de cellules suffisamment denses pour l’imagerie efficace. En règle générale, les 7 champs de vue devrait produire > 130 cellules appropriés pour la quantification.
Enfin, il est important de déterminer les paramètres optimaux pour et les sorties nécessaires d’analyse d’images. Pour détecter les points de smFISH, analyse publiée programmes couramment filtrent les images raw avec un noyau gaussien pour supprimer le signal de fond et demandent aux utilisateurs de déterminer le ratio signal-bruit d’utiliser pour chaque ensemble d’images2,17. Malheureusement, il n’y a pas actuellement d’une norme unique par lequel les paramètres sont déterminés, et quelques essais empiriques de ces différents paramètres est donc nécessaire. Pour définir les paramètres nécessaires pour chacune de ces étapes, on a besoin de manière itérative différents jeux de paramètres d’entrée et vérifiez bien les résultats obtenus par chaque jeu correspond à celui de comptage manuel dans quelques cellules représentatives. Une fois un ensemble de paramètres est retrouvé, il peut être utilisé pour la plupart des images obtenues malgré les différentes conditions de croissance et les antécédents génétiques.
En outre, on peut tester si l’intensité maximale de projection des images smFISH peut être effectuée avant quantification22. Cette étape simplifie l’algorithme de détection spot et réduit considérablement les temps d’imagerie, mais au détriment des informations potentiellement utiles sur des spots individuels, tels que leur localisation subcellulaire. Dans notre cas, le nombre de molécules d’ADN messagère produite par le gène NDC80 était assez bas pour que les taches étaient bien distincts après ce traitement (pas rare pour les transcriptions en bourgeonnement levure3,7). Dans le cas où l’analyse de colocalisation est critique, le pipeline de l’analyse doit déterminer l’emplacement de chaque spot de smFISH dans chaque canal pour évaluer la colocalisation. Selon les questions spécifiques posées, autres informations telles que l’intensité de chaque spot peuvent également devoir être extrait à partir du pipeline pour une analyse ultérieure. Optimisation de la clé dans le protocole et le pipeline de l’analyse d’image est crucial dans l’obtention de la qualité des données smFISH pour étudier la question des intérêts.

Régulation dynamique de l’expression des gènes entraîne le développement d’un organisme, ainsi que sa réponse au stress environnemental, l’infection et des changements dans le métabolisme. Les études qui portent sur la régulation transcriptionnelle fondés sur les technologies qui mesurent l’abondance RNA. Une de ces méthodes, appelée seule molécule fluorescence in situ hybridation (smFISH), est utilisée pour la détection de molécules d’ARN individuels dans des cellules individuelles1,2. Cette méthode permet la mesure de la variabilité de la cellule-cellule dans l’expression des gènes et de la détermination de la localisation intracellulaire de l’ARN.
Dans la technique de smFISH plus couramment utilisés, détection d’une molécule d’ARN individuelle nécessite plusieurs sondes d’ADN courtes (souvent ~ 48 20-mer sondes) qui sont complémentaires à l’ARN cible et sont conjugués à la même colorant fluorescent. Fixation d’une seule sonde fluorescente résulte en signal faible, mais le signal provenant de l’ensemble de toutes les sondes est robuste. Cette fonctionnalité améliore considérablement le rapport signal-bruit, parce que même si une seule sonde peut exposer la liaison hors cible, tel signal devrait être très faible par rapport à celle de la cible ARN molécule3. Au sein de l’erreur de détection, le nombre de molécules d’ARN peut être compté et comparé entre les différentes conditions de croissance et entre différents mutants.
Depuis son premier développement, smFISH a été adapté pour étudier divers aspects de l' expression génique4, par exemple transcription élongation1,2, épissage5,6, transcription éclatement7 , 8 , 9, expression allélique intracellulaire10,11,12et RNA localization13,14,15. Récemment, nous avons utilisé cette méthode pour étudier l’expression des deux isoformes de la transcription du même gène, dans lequel l’isoforme de transcription court (NDC80ORF) a sa séquence entière partagée avec l’isoforme longue (NDC80luti )16. Pour identifier de façon unique les deux isoformes de l’ARNm, nous avons utilisé deux ensembles de sonde : un jeu est spécifique à la séquence unique de NDC80luti, et l’autre jeu, conjugué à un autre colorant fluorescent, se lie à la région commune des deux isoformes. Le NDC80luti RNA est identifiée comme une tache colocalized avec les deux signaux fluorescents, tandis que le NDC80ORF ARN est celui qui contient seulement le signal provenant de l’ensemble commun de la sonde. Puisque le nombre de la NDC80ORF transcriptions est calculée par une méthode de « soustraction », rendement élevé de l’hybridation de la sonde et un rapport signal sur bruit élevé sont nécessaires d’identifier smFISH taches avec confiance et de réduire les erreurs propagation.
Cet article décrit un protocole optimisé pour effectuer des smFISH dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Dans ce protocole, le nombre de cellules, de temps de fixation, temps de digestion, digestion tampon, concentration de sonde et hybridation tampon utilisée pour les expériences de smFISH ont été optimisées pour le SK1 souche fond de S. cerevisiae subir végétatif croissance ou la méiose. Cependant, nous notons également dans ce manuscrit : (1) la méthode pour vérifier la qualité des données de smFISH après l’acquisition de l’image et (2) la procédure décrite dans le protocole qui peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire pour les arrière-plans de souche différente et les conditions de croissance.

<table><tbody><tr><td>BSA, sans RNase (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Se conserve à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Magasin à 4 &deg ; C pour court terme. Vortex avant utilisation.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Magasin à -20 &deg ; C après reconstitution dans l’eau. Protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>50 % Sulfate de Dextran</td><td>Milli Pore</td><td>S4030 Conserver</td><td>à température ambiante. Liquide très visqueux. Manipulez avec patience.</td></tr><tr><td>E. coli ARNt</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Se conserve à -20 &deg ; C en aliquotes après reconstitution dans l’eau.</td></tr><tr><td>Éthanol (100 %, 200 proof)</td><td>divers</td><td></td><td>Inflammables.</td></tr><tr><td>37 % Formaldéhyde</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Conserver à température ambiante. Toxique. Utilisez et jetez avec prudence.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Conserver à 4 &deg ;C. Ouvrir une fois que la température s’est équilibrée à la température ambiante afin d’éviter l’oxydation. Toxique. Utilisez et jetez avec prudence.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>divers</td><td></td><td>Stocker à 4 &deg ; C après dissolution dans de l’eau exempte de nucléases.</td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Se conserve à -20 &deg ; C dans les aliquotes après reconstitution dans 50 mM de NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium (monobasique et dibasique)</td><td>divers</td><td></td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Bibliothèque de sondes, diluées dans TE, pH 8,0&nbsp ;</td><td>Magasin des technologies</td><td></td> de biorecherche <td>à -20 &deg ; C dans les aliquotes (5 &micro ; L) après reconstitution en TE pH 8,0, en suivant les instructions du fabricant. Protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>divers</td><td></td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Boutique à -20 &deg ; C en aliquotes.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl ribonucléoside complex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Stocker à -20 &deg ; C en aliquotes après reconstitution, en suivant les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Se magasiner à -20 &deg ; C en aliquotes après reconstitution dans l’eau.</td></tr><tr><td>Tubes à faible adhérence</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr></tbody></table>

hybridation in situ de fluorescence de la molécule unique (smfish) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Seule molécule fluorescence in situ hybridation (smFISH) est une technique puissante pour étudier l’expression des gènes dans des cellules individuelles en raison de sa capacité à détecter et compter les différentes molécules d’ARN. Complémentaire à la profondes méthodes basées sur le séquençage, smFISH fournit des informations sur la variation de cellule-cellule dans l’abondance de la transcription et la localisation subcellulaire d’un ARN donné. Récemment, nous avons utilisé smFISH pour étudier l’expression du gène NDC80 au cours de la méiose chez la levure de bière, dans lequel deux transcription isoformes existent et l’isoforme de transcription court a sa séquence entière partagée avec l’isoforme longue. Déterminer en toute confiance chaque isoforme de la transcription, nous avons optimisé des protocoles connus smFISH et obtenu haute consistance et la qualité des données de smFISH pour les échantillons acquis au cours du bourgeonnement levure la méiose. Nous décrivons ici, ce protocole optimisé, les critères que nous utilisons pour déterminer si la qualité des données de smFISH est obtenue et quelques conseils d’application du présent protocole dans d’autres souches de levures et de conditions de croissance.

Cette seule molécule fluorescence in situ hybridation protocole est optimisé afin de quantifier le nombre de molécules d’ARN dans la levure de bière au cours de la méiose et de la croissance végétative.

Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

L’objectif global de cette hybridation in situ optimisée de l’ARN d’une seule molécule, ou smFISH, est de détecter et de quantifier des molécules d’ARN individuelles sur une base cellulaire pendant la croissance végétative et la méiose de la levure bourgeonnante. Cette méthode révèle la variabilité de l’expression génique d’une cellule à l’autre lors de la localisation de l’ARN subcellulaire et constitue donc une technique puissante pour étudier la régulation des gènes. Outre les informations uniques qui peuvent être révélées par smFISH, le principal avantage de la technique est qu’une fois optimisée, elle est robuste et hautement reproductible.Une culture méiotique sera utilisée pour la démonstration de ce protocole. Pour fixer la culture dans 3 % de formaldéhyde, ajoutez 1840 microlitres de la culture à 160 microlitres de formaldéhyde à 37 % dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Retournez environ cinq fois pour mélanger.Placez le tube sur un tambour à rouleaux à température ambiante pendant 20 minutes. Après 20 minutes, continuez à fixer à quatre degrés Celsius avec rotation pendant la nuit. Le lendemain, préparez-vous à la digestion en décongelant d’abord 200 complexes millimolaires de vanadyl ribonucléoside, ou VRC, à 65 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes.Pour préparer le mélange maître de digestion, pipetez d’abord 2125 microlitres de tampon B dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, tourbillonnez le VRC chaud pendant cinq secondes pour le remettre complètement en suspension et ajoutez 200 microlitres de VRC dans le tube de 15 millilitres. Le mélange doit apparaître de couleur vert brunâtre clair.Centrifuger l’échantillon méiotique à 21 000 x g pendant une minute et demie à température ambiante. Aspirez le surnageant avec précaution, en plaçant la pointe de l’aspirateur sur le côté opposé de la pastille pour éviter de déranger la pastille. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre et demi de tampon B froid en pipetant de haut en bas pour mélanger.Centrifuger à 21 000 x g pendant une minute et demie. Retirez la majeure partie du liquide par aspiration sous vide, en laissant environ 100 microlitres. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre et demi de tampon froid B.Centrifugez les échantillons, retirez le liquide et remettez les cellules en suspension dans un millilitre et demi de tampon froid B.Centrifuger à 21 000 x g pendant une minute et demie. Aspirez complètement le liquide par pipetage. Remettez les cellules en suspension dans 425 microlitres de mélange maître de digestion et vortex brièvement.Ajoutez cinq microlitres de zymolyase dans le tube et faites un tourbillon pendant deux à trois secondes pour mélanger. Placez le tube sur un tambour à roulettes et digestez à 30 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes. Après 15 minutes, vérifiez les cellules par microscopie toutes les cinq minutes et arrêtez la digestion lorsqu’environ 80 % des cellules apparaissent non transparentes et non réfractives.Centrifugez le tube à 376 x g pendant trois minutes. Retirez complètement le surnageant. Remettez doucement les cellules en suspension avec un millilitre de tampon B en pipetant de haut en bas une à deux fois pour mélanger.Centrifugez le tube et retirez le tampon. Remettez doucement les cellules en suspension dans un millilitre d’éthanol à 70 % et incubez à température ambiante pendant trois heures et demie à quatre heures. Pour commencer la procédure d’hybridation, centrifugez le tube de cellules à 376 x g pendant trois minutes.Retirez 500 microlitres d’éthanol à 70 % du tube. Pipetez doucement de haut en bas pour remettre en suspension les cellules restantes et transférez les cellules dans un tube à faible adhérence. Le transfert de l’échantillon dans un tube à faible adhérence est essentiel pour éviter une perte excessive de cellules lors des lavages ultérieurs du formamide.Centrifugez le tube à faible adhérence et retirez tout l’éthanol. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage à 10 % de formamide dans le tube et pipetez doucement de haut en bas deux à trois fois pour remettre les cellules en suspension. Laissez les cellules prendre à température ambiante pendant environ 20 minutes pendant la préparation des solutions d’hybridation, comme décrit dans le protocole textuel.Centrifuger l’échantillon et retirer le surnageant dans les déchets dangereux. Ajoutez au moins 50 microlitres de chaque solution d’hybridation dans le tube et agitant le tube pour mélanger. Incuber à 30 degrés Celsius sur un tambour à roulettes pendant au moins 16 heures dans l’obscurité.Lorsque l’hybridation est terminée, placez le tube de cellules dans une boîte recouverte de papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Centrifugez l’échantillon à 376 x g pendant trois minutes. Éliminer le surnageant dans les déchets dangereux par pipetage.Remettez l’échantillon en suspension dans un millilitre de tampon de lavage à 10 % de formamide en pipetant doucement de haut en bas deux à trois fois. Remettez le tube de cellules dans une boîte recouverte d’une feuille d’aluminium à l’abri de la lumière et incubez à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, centrifugez l’échantillon.Retirer le surnageant des déchets dangereux par pipetage, en laissant environ 50 microlitres. Remettez l’échantillon en suspension dans un millilitre de solution DAPI en pipetant doucement de haut en bas deux à trois fois. Encore une fois, placez le tube de cellules dans la boîte recouverte de papier d’aluminium et incubez à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes.Centrifuger l’échantillon et éliminer complètement le surnageant par pipetage. Pour les échantillons qui ne seront pas imagés immédiatement, remettre la pastille en suspension dans 50 microlitres de tampon GLOX sans enzymes. Pipetez de haut en bas trois à quatre fois pour mélanger.Conserver dans la boîte recouverte de papier d’aluminium à quatre degrés Celsius jusqu’au moment de prendre l’image. Pour que les échantillons soient imagés immédiatement, ajoutez 15 à 20 microlitres de tampon GLOX avec des enzymes. Pipetez cinq microlitres sur une lamelle et placez la lamelle sur une lame.Placez une lingette de laboratoire sur la lame à l’endroit où la lamelle est placée. Appuyez doucement sur la lingette pour régler la glissière. Placez la lame dans une boîte recouverte d’une feuille d’aluminium pour la transférer dans la salle de microscope.Ce protocole a été utilisé pour examiner l’expression du gène NDC80, qui exprime deux isoformes de l’ARNm. L’isoforme de transcription longue non décodée a une extension de 400 paires de bases, cinq premières par rapport à l’isoforme courte. Deux ensembles de sondes ont été conçus.L’ensemble CF 590 se lie à la région unique des cinq premiers de l’isoforme longue, et l’ensemble Q 670 se lie à la région commune des deux isoformes. Dans des conditions optimisées, des points smFISH distincts ont été clairement identifiés pour les deux ensembles de sondes. Les deux ensembles de sondes ont été utilisés pour étudier l’expression de NDC80 pendant la croissance végétative et la méiose.Dans les cellules végétatives, un signal robuste provenant de l’ensemble de sondes Q 670 a été détecté, mais pas de l’ensemble de sondes CF 590. En revanche, un signal robuste des deux ensembles de sondes a été détecté dans la prophase méiotique, et la majorité des taches avaient un signal co-localisé. L’analyse par transfert de Northern a confirmé que l’isoforme longue était exprimée spécifiquement dans la méiose.Les cellules végétatives avaient une médiane de cinq transcrits isoformes courts par cellule, tandis que dans les cellules de prophase méiotiques, la médiane a considérablement chuté à quatre transcrits par cellule. Dans la prophase méiotique, le nombre médian de transcrits isoformes longs par cellule était de 21 et 100 % des cellules exprimaient le transcrit. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 72 heures si elle est exécutée correctement.Lors de cette procédure, il est important d’optimiser d’abord la durée de digestion et la concentration de sondes smFISH nécessaires pour obtenir le rapport signal/bruit optimal. De plus, n’oubliez pas d’ajouter du VRC pendant la digestion et l’hybridation pendant la nuit pour éviter l’activité des nucléases. Avec ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la régulation dynamique des gènes et la localisation de l’ARN subcellulaire.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un FISH à ARN moléculaire unique dans la méiose de levure en bourgeonnement.

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Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

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