Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

L’objectif global de cette hybridation in situ optimisée de l’ARN d’une seule molécule, ou smFISH, est de détecter et de quantifier des molécules d’ARN individuelles sur une base cellulaire pendant la croissance végétative et la méiose de la levure bourgeonnante. Cette méthode révèle la variabilité de l’expression génique d’une cellule à l’autre lors de la localisation de l’ARN subcellulaire et constitue donc une technique puissante pour étudier la régulation des gènes. Outre les informations uniques qui peuvent être révélées par smFISH, le principal avantage de la technique est qu’une fois optimisée, elle est robuste et hautement reproductible.

Une culture méiotique sera utilisée pour la démonstration de ce protocole. Pour fixer la culture dans 3 % de formaldéhyde, ajoutez 1840 microlitres de la culture à 160 microlitres de formaldéhyde à 37 % dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Retournez environ cinq fois pour mélanger.

Placez le tube sur un tambour à rouleaux à température ambiante pendant 20 minutes. Après 20 minutes, continuez à fixer à quatre degrés Celsius avec rotation pendant la nuit. Le lendemain, préparez-vous à la digestion en décongelant d’abord 200 complexes millimolaires de vanadyl ribonucléoside, ou VRC, à 65 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes.

Pour préparer le mélange maître de digestion, pipetez d’abord 2125 microlitres de tampon B dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, tourbillonnez le VRC chaud pendant cinq secondes pour le remettre complètement en suspension et ajoutez 200 microlitres de VRC dans le tube de 15 millilitres. Le mélange doit apparaître de couleur vert brunâtre clair.

Centrifuger l’échantillon méiotique à 21 000 x g pendant une minute et demie à température ambiante. Aspirez le surnageant avec précaution, en plaçant la pointe de l’aspirateur sur le côté opposé de la pastille pour éviter de déranger la pastille. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre et demi de tampon B froid en pipetant de haut en bas pour mélanger.

Centrifuger à 21 000 x g pendant une minute et demie. Retirez la majeure partie du liquide par aspiration sous vide, en laissant environ 100 microlitres. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre et demi de tampon froid B.Centrifugez les échantillons, retirez le liquide et remettez les cellules en suspension dans un millilitre et demi de tampon froid B.

Centrifuger à 21 000 x g pendant une minute et demie. Aspirez complètement le liquide par pipetage. Remettez les cellules en suspension dans 425 microlitres de mélange maître de digestion et vortex brièvement.

Ajoutez cinq microlitres de zymolyase dans le tube et faites un tourbillon pendant deux à trois secondes pour mélanger. Placez le tube sur un tambour à roulettes et digestez à 30 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes. Après 15 minutes, vérifiez les cellules par microscopie toutes les cinq minutes et arrêtez la digestion lorsqu’environ 80 % des cellules apparaissent non transparentes et non réfractives.

Centrifugez le tube à 376 x g pendant trois minutes. Retirez complètement le surnageant. Remettez doucement les cellules en suspension avec un millilitre de tampon B en pipetant de haut en bas une à deux fois pour mélanger.

Centrifugez le tube et retirez le tampon. Remettez doucement les cellules en suspension dans un millilitre d’éthanol à 70 % et incubez à température ambiante pendant trois heures et demie à quatre heures. Pour commencer la procédure d’hybridation, centrifugez le tube de cellules à 376 x g pendant trois minutes.

Retirez 500 microlitres d’éthanol à 70 % du tube. Pipetez doucement de haut en bas pour remettre en suspension les cellules restantes et transférez les cellules dans un tube à faible adhérence. Le transfert de l’échantillon dans un tube à faible adhérence est essentiel pour éviter une perte excessive de cellules lors des lavages ultérieurs du formamide.

Centrifugez le tube à faible adhérence et retirez tout l’éthanol. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage à 10 % de formamide dans le tube et pipetez doucement de haut en bas deux à trois fois pour remettre les cellules en suspension. Laissez les cellules prendre à température ambiante pendant environ 20 minutes pendant la préparation des solutions d’hybridation, comme décrit dans le protocole textuel.

Centrifuger l’échantillon et retirer le surnageant dans les déchets dangereux. Ajoutez au moins 50 microlitres de chaque solution d’hybridation dans le tube et agitant le tube pour mélanger. Incuber à 30 degrés Celsius sur un tambour à roulettes pendant au moins 16 heures dans l’obscurité.

Lorsque l’hybridation est terminée, placez le tube de cellules dans une boîte recouverte de papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Centrifugez l’échantillon à 376 x g pendant trois minutes. Éliminer le surnageant dans les déchets dangereux par pipetage.

Remettez l’échantillon en suspension dans un millilitre de tampon de lavage à 10 % de formamide en pipetant doucement de haut en bas deux à trois fois. Remettez le tube de cellules dans une boîte recouverte d’une feuille d’aluminium à l’abri de la lumière et incubez à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, centrifugez l’échantillon.

Retirer le surnageant des déchets dangereux par pipetage, en laissant environ 50 microlitres. Remettez l’échantillon en suspension dans un millilitre de solution DAPI en pipetant doucement de haut en bas deux à trois fois. Encore une fois, placez le tube de cellules dans la boîte recouverte de papier d’aluminium et incubez à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Centrifuger l’échantillon et éliminer complètement le surnageant par pipetage. Pour les échantillons qui ne seront pas imagés immédiatement, remettre la pastille en suspension dans 50 microlitres de tampon GLOX sans enzymes. Pipetez de haut en bas trois à quatre fois pour mélanger.

Conserver dans la boîte recouverte de papier d’aluminium à quatre degrés Celsius jusqu’au moment de prendre l’image. Pour que les échantillons soient imagés immédiatement, ajoutez 15 à 20 microlitres de tampon GLOX avec des enzymes. Pipetez cinq microlitres sur une lamelle et placez la lamelle sur une lame.

Placez une lingette de laboratoire sur la lame à l’endroit où la lamelle est placée. Appuyez doucement sur la lingette pour régler la glissière. Placez la lame dans une boîte recouverte d’une feuille d’aluminium pour la transférer dans la salle de microscope.

Ce protocole a été utilisé pour examiner l’expression du gène NDC80, qui exprime deux isoformes de l’ARNm. L’isoforme de transcription longue non décodée a une extension de 400 paires de bases, cinq premières par rapport à l’isoforme courte. Deux ensembles de sondes ont été conçus.

L’ensemble CF 590 se lie à la région unique des cinq premiers de l’isoforme longue, et l’ensemble Q 670 se lie à la région commune des deux isoformes. Dans des conditions optimisées, des points smFISH distincts ont été clairement identifiés pour les deux ensembles de sondes. Les deux ensembles de sondes ont été utilisés pour étudier l’expression de NDC80 pendant la croissance végétative et la méiose.

Dans les cellules végétatives, un signal robuste provenant de l’ensemble de sondes Q 670 a été détecté, mais pas de l’ensemble de sondes CF 590. En revanche, un signal robuste des deux ensembles de sondes a été détecté dans la prophase méiotique, et la majorité des taches avaient un signal co-localisé. L’analyse par transfert de Northern a confirmé que l’isoforme longue était exprimée spécifiquement dans la méiose.

Les cellules végétatives avaient une médiane de cinq transcrits isoformes courts par cellule, tandis que dans les cellules de prophase méiotiques, la médiane a considérablement chuté à quatre transcrits par cellule. Dans la prophase méiotique, le nombre médian de transcrits isoformes longs par cellule était de 21 et 100 % des cellules exprimaient le transcrit. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 72 heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important d’optimiser d’abord la durée de digestion et la concentration de sondes smFISH nécessaires pour obtenir le rapport signal/bruit optimal. De plus, n’oubliez pas d’ajouter du VRC pendant la digestion et l’hybridation pendant la nuit pour éviter l’activité des nucléases. Avec ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la régulation dynamique des gènes et la localisation de l’ARN subcellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un FISH à ARN moléculaire unique dans la méiose de levure en bourgeonnement.