Name: Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez une méthode de pulldown axée sur la biotine pour valider les cibles d'ARNm des miARN cellulaires en utilisant des mimiques LNA biotinylées. Cette technique offre une spécificité élevée pour la recherche en biologie des ARN.

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Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (NIH) subventions DA037779 (à J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 et MD007586 (au C.D.). Le travail a été également soutenu par la RCMI Grant G12MD007586, les Vanderbilt CSTC Grant UL1RR024975, le centre de recherche translationnelle Meharry (MeTRC) CSTC accorde (U54 RR026140 de RRRNC/NIH, le U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH et le centre du Tennessee pour le sida Recherche (P30 AI110527).

1. la transfection de 3'-biotinylé miRNA
Remarque : Effectuez les opérations suivantes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile.
<ol><li>Semences 4 x 10,5-5 x 105 HEK-293 t cellules / puits dans 2 mL d’achever modifié Eagle (DMEM de Dulbecco) [DMEM additionné de 10 % de sérum foetal bovin (FBS) et 1 x antibiotique strep-Pen]. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, vérifier la santé et l’adhérence des cellules plaqués sous un microscope optique. Remarque : Assurez-vous que les cellules ont adhéré et atteint la morphologie appropriée avant de passer à l’étape suivante. Les cellules HEK-293 t sont généralement prêtes pour la transfection 18 – 24 heures post placage.</li>
	<li>Dans un tube à centrifuger stérile de 1,7 mL, diluer 75 picomoles de biotinylé miRNA dans 200 µL de milieu essentiel minimal. Transférer ce mélange dans un autre 1,7 mL microtubes tube contenant un Liposome transfection basée réactif (8 µL/puits) dilué dans 200 µL de milieu essentiel minimal. Mélanger soigneusement, mais doucement, en pipettant également et incuber pendant 20 à 25 min à température ambiante pour permettre la formation de complexes transfection.</li>
	<li>Retirez la plaque de culture bien 6 anciens médias en pipettant également, doux et de reconstituer chaque puits avec 1,6 mL de fraîchement préparée DMEM complet (sans 1 x antibiotiques strep-Pen).</li>
	<li>Ajouter goutte-à-goutte les complexes de transfection (de 1,3) aux cellules de la plaque 6 puits à l’aide d’une pipette bien calibrée. Agiter doucement la plaque tout en y ajoutant les complexes afin d’assurer leur répartition uniforme dans l’ensemble de la plaque. Remarque : Cette étape est très critique pour la réalisation de transfection de haute efficacité et doit être effectuée avec soin et patience.</li>
	<li>La culture des cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant au moins 36 h.</li>
</ol>2. préparation de la Streptavidine recouvert de billes magnétiques — j’ai
<ol><li>Remettre en suspension les billes magnétiques de streptavidine soigneusement au vortex. Transférer 30 µL de suspension de la perle (par exemple) à un tube à centrifuger exempte de nucléase 2 mL.</li>
	<li>Placer le tube contenant la suspension de la perle sur le stand de séparateur de billes magnétiques (« aimant » ci-après) pendant 2 min. Après s’être assuré que les perles sont attirés par le côté du tube en contact avec l’aimant, retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de tampon de lavage perle (10 mM Tris-Cl pH de 7,5, EDTA de 0,5 mM, 1 M NaCl) aux talons. Retirer le tube de l’aimant. Vortexer pendant 15 s à température ambiante pour laver les perles.</li>
	<li>Placer le tube contenant l’aimant pendant 2 min, les perles et soigneusement retirer et jeter le surnageant.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.3 et 2.4 pour un total de trois lavages. Après l’étape de lavage final, retirez le tube de l’aimant.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de RNase libérant une solution (NaOH 0,1 M, 0,05 M NaCl) aux talons, mélanger bien au Vortex pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placer le tube contenant l’aimant pendant 2 min, les perles et soigneusement retirer et jeter le surnageant.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.6 pour un total de trois fois.</li>
	<li>Ajouter la solution de remise en suspension de perle (0,5 M de NaCl) aux talons, vortex 15 s et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placer les billes remises en suspension sur l’aimant pendant 2 min et retirer délicatement le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de perle bloquant la solution (µg 1/µL BSA, 2 µg/µL tRNA de levure) aux talons. Mélange doux Vortexer pendant 15 s à température ambiante. Incuber à 4 ° C pendant 16 h (nuit) sur un rotateur multitube.</li>
</ol>3. préparation des lysats cellulaires
<ol><li>Récolter les cellules HEK-293 t transfectées en grattant doucement à l’aide d’un grattoir de cellules stériles à l’intérieur de la hotte laminaire, puis transférer chaque échantillon dans un tube à centrifuger stériles de 2 mL.</li>
	<li>Pellet les cellules grattées par centrifugation à 1 500 g pour 5 min. Resuspendre le culot dans 1 x PBS stérile (tampon Phosphate salin), pH 7,2. Centrifuger à nouveau à 1 500 g pendant 5 min obtenir un culot gratuit des restes de fluides. Immédiatement plonger le tube contenant des granulés dans la glace.</li>
	<li>Préparer le tampon de lyse cellulaire complet frais (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH à 7,5, 5mM DTT, 0,5 % IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x inhibiteur de protéase). Remarque : Un stock de tampon de lyse cellulaire manque cocktail inhibiteur de la protéase, Superase et IGEPAL peut-être être préparé à l’avance et conservé à température ambiante. Préparer un nouveau lot de tampon de lyse cellulaire complet en ajoutant des suppléments ci-dessus aux concentrations finales recommandées pour le tampon de lyse cellulaire stock et en stockant sur glace.</li>
	<li>Ajouter 260 µL de tampon de lyse cellulaire complet glacée à chaque échantillon dans le tube à centrifuger (c.-à-d., chaque tube à centrifuger contienne des cellules prélevées d’un puits de la plaque 6 puits) et Resuspendre le culot dans une suspension homogène de pipetage.</li>
	<li>Lyse des cellules à l’aide de la méthode de gel / dégel : Incuber les tubes à-80 ° C pendant 10 à 15 min. Ensuite, permettre les cellules à dégeler sur la glace.</li>
	<li>Centrifuger la cellule résultante lysate à 16 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse de paillasse réfrigérés à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer la cellule défrichée lysate d’un tube à centrifuger stérile de 1,7 mL sur la glace. Jeter le culot. Remarque : Le volume final d’effacées lysat devrait être ~ 240 – 250 µL.</li>
	<li>Ajouter 5 M NaCl à la défrichées lysat à une concentration finale de 1M et de maintenir les échantillons sur la glace.</li>
</ol>4. préparation des billes magnétiques de streptavidine — II
<ol><li>Préparer le tampon de lavage de menu déroulant complet frais (KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl2, pH 10 mM Tris-Cl 7.5, 5 mM TNT, 1 M NaCl, 0,5 % IGEPAL, 60U/mL Superase et cocktail inhibiteur de la protéase 1 x) Remarque : Un stock de tampon de lavage de la liste déroulante manque cocktail inhibiteur de la protéase, Superase et IGEPAL peut être préparé à l’avance et conservé à température ambiante. Préparer un nouveau lot de tampon de lyse cellulaire complet en ajoutant des suppléments ci-dessus aux concentrations finales recommandées pour le tampon de lyse cellulaire stock et en stockant sur glace.</li>
	<li>Placer le tube contenant les perles préparés (de l’étape 2,9) sur l’aimant pour 2 min. Retirez avec précaution et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 150 µL de tampon de lavage glacée à menu déroulant complet aux talons. Vortexer pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 s. Place les tubes sur l’aimant pour 2 min. Retirer soigneusement et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.3 pour un total de 3 fois.</li>
	<li>Remettre en suspension les perles dans 300 µL de tampon de lavage complet de menu déroulant.</li>
</ol>5. menu déroulant des cibles ARNm-miRNA Complexes
<ol><li>Transférer 300 µL du lysat cellulaire (de l’étape 3,8) pour le tube à centrifuger contenant 300 µL de perles (de l’étape 4.5).</li>
	<li>Incuber le mélange sur un mélangeur oscillant pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Placer le tube sur l’aimant pour 5 min. Retirez avec précaution et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 300 µL de tampon de lavage glacée à menu déroulant complet aux talons. Vortexer pendant 15 s à température ambiante et place le tube sur l’aimant pendant 5 min. Retirez délicatement et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Répétez l’étape 5.4 deux fois plus.</li>
	<li>Remettre en suspension les perles dans 100 µL d’eau exempte de nucléase et incuber sur glace.</li>
</ol>6. total Extraction de l’ARN, synthèse de cDNA et qPCR
<ol><li>Extraire l’ARN total les billes remises en suspension (de l’étape 5,6) utilisant une méthode appropriée (voir Table des matières). Remettre en suspension l’extrait de l’ARN total dans 25 µL d’eau exempte de nucléase. Déterminer la concentration d’ARN et de la qualité à l’aide d’un spectrophotomètre (absorbance à 260/280). Préparation d’un stock de travail de l’ARN à 50 ng/µL.</li>
	<li>Effectuer la synthèse de cDNA, en géométrie, en utilisant 50 ng d’ARN total (de l’étape 6.1) à l’aide d’une synthèse de cDNA appropriée nécessaire (voir Table des matières) à l’aide des amorces oligo dT dans un volume final de 20 µL (tableau 1). Ensuite, charge à la tubes PCR dans l’instrument de qPCR pour effectuer des cycles thermiques selon les conditions décrites dans le tableau 2.</li>
	<li>
Effectuer qPCR sur l’ADNc (de l’étape 6.2) à l’aide de chimie SYBR Green (voir Table des matières) :
	<ol>
<li>Effectuer toutes les réactions de qPCR en géométrie dans une plaque de fond bien claire 96 dans des conditions stériles.</li>
		<li>Aliquote 9 µL du mélange réactionnel de qPCR master mix (voir tableau 3) dans chaque puits de la plaque. Ensuite, ajouter 1 µL de l’ADNc dans chaque puits afin d’obtenir un volume final de 10 µL. flasque de la PCR à l’aide de film adhésif résistant à la chaleur PCR et charger dans l’appareil qPCR</li>
		<li>Effectuez des cycles thermiques selon les conditions décrites dans le tableau 4.</li>
		<li>Normaliser les niveaux d’expression de chaque échantillon pour les niveaux d’expression du contrôle brouillé (valeurs de Ct). Utilisez ces valeurs pour calculer le pli des changements dans l’expression.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers et non financiers concurrents.

Identification de cibles ARNm des miARN cellulaire est importante pour comprendre leur fonction régulatrice. Plusieurs outils informatiques sont utilisés pour prédire des cibles fondées sur la complémentarité de séquence de semences et de la conservation de cible séquences19,20. Bien que ces outils sont utiles, ils peuvent générer des niveaux élevés de faux positifs et faux négatifs. Par conséquent, ces prédictions sont couplées avec des méthodes expérimentales c...

MicroARN (miARN) est de petite taille non-coding RNAs qui régulent négativement protein expression1. Précurseurs de miRNA résident en grappes à travers de nombreuses régions du génome, plus fréquemment dans les régions intergéniques et les introns de2,de gènes codant pour des protéines3. Biogenèse des miARN impliquent la transcription de la pri-miARN de miRNA-codage gènes4. Le pri-miARN subissent un traitement séquentiel, dans le noyau, puis dans le cytoplasme pour produire seul brin miARN matures4,5. Par la suite, les miARN matures est incorporés dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC) : un complexe de protéine-ARN de multimères qui comprend un membre de la famille Argonaute de protéines pour cible reconnaissance4,5, 6,7. MiARN matures dans le complexe RISC principalement se lie à la région 3' UTR de cibles ARNm8,9,10 , mais peut également lier occasionnellement dans le codage et la région 5' UTR des ARNm10,11 . La liaison du miARN à l’ARNm des séquences résultats translationnelle silencieux12,13,14 et dans certains cas de déstabilisation ARNm15. Puisqu’un seul miRNA peut cibler plusieurs ARNm, ces molécules régulatrices sont impliqués dans presque tous les processus cellulaires et ont été impliqués dans diverses maladies conditions16,17,18.
Compréhension détaillée de comment les miARN réglemente voies cellulaires exige une identification de l’ARNm cible. Il existe plusieurs plates-formes de bio-informatique prédire les processus putatif des interactions19,20. Ces prédictions s’appuient sur la parfaite Watson-Crick base appariement entre la séquence 2 – 8 graines des nucléotides de la miRNA et une séquence complémentaire au sein de la cible ADN messagère4,21. En outre, ces outils génèrent une structure secondaire du processus duplex, calculer les paramètres thermodynamiques de cette interaction moléculaire et voir la conservation des sites de liaison à travers les espèces afin d’améliorer la pertinence fonctionnelle de la cible prédiction. Malheureusement, ces outils ont également la limitation de la prédiction de faux objectifs faisait positives à un taux très élevé (~ 27 – 70 %)15,22. Plus important encore, ces plates-formes en silico ne reconnaissent pas les interactions non-canoniques des miARN avec leurs cibles23. Par conséquent, ces analyses prédictives sont souvent combinées avec des méthodes expérimentales pour valider les objectifs pertinents sur le plan fonctionnel.
Plusieurs approches ont été développées afin de valider expérimentalement les interactions des processus. Les expériences génétiques à l’aide d’imitations de miRNA, éponges et inhibiteurs qui modifient les niveaux des miARN dans la cellule fournissent des indices pour son effet régulateur sur la cible gene expression24,25,26. En outre, journaliste basé à dosages par co transfection d’un clone contenant la région 3' UTR de l’imite de miRNA et de l’ARNm cible ou inhibiteurs en cellules de fournissent la preuve de la fonction régulatrice des miARN26. Bien que ces méthodes sont essentielles étudier la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes de miARN, transfection efficacité et pleotropic effets des altérations cellulaires miRNA niveaux sont les principales limites de ces approches génétiques23, 26. Par conséquent, les méthodes biochimiques complémentaires qui sonde l’interaction directe entre les miARN et sa cible sont employés afin de mieux comprendre le fonctionnement cellulaire des miARN.
Une méthode couramment utilisée pour étudier l’interaction directe entre les miARN et sa cible est l’immunoprécipitation des complexes le RISC, suivie par la détection d’ARNm cible dans le complexe de27,28,,29,30 . Récemment, une méthode améliorée de piège RISC était également utilisée pour identifier les cibles de miRNA ; Il est couplé stabilisation des cibles dans les intermédiaires de RISC-miRNA-ARNm à la purification des cibles de l’ARNm. Cependant, ces methodsface les défis inhérents des interactions non spécifiques entre les ARN et la liaison à l’ARN des protéines qui sont habituellement séparés par compartiments cellulaires31,32. En outre, ces tests dépendent de la présence de la protéine AGO2 pour l’immunoprécipitation du complexe RISC33. AGO2 n’étant pas le seul argonaute de médier les interactions des processus efficaces, exclusion des autres argonautes pourrait conduire à des résultats biaisés34. Par conséquent, des stratégies alternatives sont nécessaires pour étudier la liaison directe de miRNA d’ARNm.
Dans ce rapport, nous élaborons une approche en une seule étape pour sonder une interaction directe entre un miRNA et sa cible ADN messagère. Tout d’abord, 3' biotinylated verrouillé d’acide nucléique (LNA) miRNA imite est transfectés dans des cellules de mammifères. Ensuite, le processus complexe dans le lysat cellulaire est capturées à l’aide de billes magnétiques de streptavidine enduite. La cible de l’ARNm liée à sa complémentaire miRNA est quantifiée à l’aide de qPCR.

<table><tbody><tr><td>Lignées cellulaires HEK293T cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Hi-FBS)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1x)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)&nbsp ;</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine solution (100x)</td><td>Cellgro/Mediatech</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNase&nbsp ;</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Milieu sérique réduit</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>3198-088</td><td></td></tr><tr><td>Liopfectamine 2000 Réactif de transfection</td><td>Invitrogen/ Thermofisher</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Has-miR-125b Biotinylé</td><td>Exiqon</td><td>339178/ID-27281622</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle brouillé biotinylé</td><td>Exiqon</td><td>479997-671/ID-714884</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18896</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine Perles magnétiques</td><td>Pierce</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levure</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl<subSolution >2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique, solution de sel disodique (EDTA), 0,5 M, pH 8,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Superase</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Eau libre RNAse/DNAse</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy extraction</td><td>kit Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript-Select kit de synthèse d’ADNc</td><td>Biorad</td><td>170-8897</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Amorces&nbsp ;</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-Spin</td><td>Magnet Invitrogen/Thermofisher</td><td>12320D</td><td></td></tr></tbody></table>

axée sur la biotine pulldown dosage à validate arnm cibles cellulaires miarn

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroARN (miARN) sont une classe de petits ARN non codants qui post-traductionnelle régulent l’expression des gènes cellulaires. MiARN et la lier à la région 3' non traduite (UTR) de cibler les ARNm à inhiber la traduction des protéines ou dans certains cas entraîner une dégradation des ARNm. La liaison de la miRNA pour la région 3' UTR de la cible qu'adn messagère est médié par une séquence de graine de nucléotides de 2 à 8 à l’extrémité 5' de miRNA. Alors que le rôle des miARN comme molécules régulatrices cellulaires est bien établi, identification de l’ARNm cible avec pertinence fonctionnelle demeure un défi. Outils bioinformatiques ont été utilisées pour prédire les séquences au sein de la région 3' UTR des ARNm comme des cibles potentielles pour la liaison de miRNA. Ces outils ont également été utilisés pour déterminer la conservation évolutive de telles séquences entre espèces apparentées pour tenter de prédire le rôle fonctionnel. Cependant, ces méthodes de calcul souvent génèrent des faux positifs et se limitent à prévoir canonique interaction entre l’ARNm et miRNA. Par conséquent, les procédures expérimentales qui mesurent une liaison directe de miRNA vers sa cible d’ARNm sont nécessaires pour établir des interaction fonctionnelle. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode sensible pour valider une interaction directe entre le cellulaire miARN miR-125 b et les 3' UTR de PARP-1 ARNm. Nous élaborons un protocole dans lequel mimétiques synthétiques biotinylé-miRNA ont été transfectés dans des cellules de mammifères et le complexe de miRNA-ARNm dans le lysat cellulaire a été tiré vers le bas avec la Streptavidine des billes magnétiques. Enfin, la cible qu'adn messagère dans la complexe d’acides nucléiques tiré vers le bas a été quantifiée à l’aide d’une stratégie axée sur le qPCR.

MiARN réglemente les processus cellulaires en se liant à l’ARNm cible. Identification des cibles ARNm sont donc une clé pour comprendre le fonctionnement du miRNA. Ici, nous élaborons une méthode pour identifier les cibles ARNm de miRNA cellulaire. Ce protocole est adapté à partir de Wani et al. 35 avec la modification d’utilisant biotinylé axée sur la LNA miRNA imite à menu déroulant cibles ARNm. L’utilisation des oligonucléotides axée sur la LNA imite am...

Ce rapport décrit une méthode rapide et fiable pour la validation de cibles ARNm des miARN cellulaire. La méthode utilise biotinylé synthétique basé sur Locked Nucleic Acid LNA miRNA imite pour capturer les cibles ARNm. Par la suite, streptavidine des billes magnétiques travaillent à menu déroulant la cible ADN messagère pour la quantification par qPCR polymerase chain reaction.

Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de l’ARNm, par exemple si la cible de l’ARNm prédite in silico peut interagir directement avec un microARN cellulaire particulier. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle utilise des mimiques biotinylés pour tirer vers le bas l’ARNm cible. Et ces mimiques biotinylés ont une chimie mimique à base d’acides nucléiques verrouillés ou de LNA qui aide à la formation d’oligonucléotides très stables avec une très grande affinité qui peut améliorer la spécificité de la réaction.Les implications de cette méthodologie sont qu’elle peut aller de la compréhension de la biologie du microARN à des thérapies basées sur les microARN. C’est principalement parce que nous savons tous que les microARN jouent un rôle essentiel dans tous les aspects de la biologie cellulaire. Donc, en identifiant les cibles des microARN, ce sont les ARNm, nous pouvons certainement fournir des connaissances essentielles qui seraient importantes pour la découverte et les traitements.La démonstration du protocole sera faite par Sabyasachi Dash, un étudiant diplômé de notre laboratoire. Pour enduire les billes magnétiques

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Génétique

La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome de collecte de l'ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l'application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

Les microARN (miARN) sont des régulateurs importants de l'expression génique et ont été montrés à jouer un rôle dans de nombreux processus biologiques. Afin de mieux comprendre les interactions miARN-UTR, nous avons créé une collection pangénomique de journalistes UTR 3 luciférase jumelé avec un nouveau gène de la luciférase et réactif de dosage, le système LightSwitch.

L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

L’identification luminescente d’éléments fonctionnels dans des régions 3' non traduites (3'UTRs) (3'LIFE) est une technique permettant d’identifier la régulation fonctionnelle dans les 3'UTR par des miARN ou d’autres facteurs régulateurs. Ce protocole utilise une méthodologie à haut débit telle que la transfection à 96 puits et les tests de luciférase pour cribler des centaines d’interactions présumées pour la répression fonctionnelle.

Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3&#39;LIFE

Nous décrivons l’utilisation d’une plateforme d’expression génique multiplexée à haut débit qui quantifie l’expression génique en codant à barres et en comptant les molécules dans les substrats biologiques sans avoir besoin d’amplification. Nous avons utilisé la plateforme pour quantifier l’expression des microARN (miARN) dans le sang total chez des sujets avec et sans syndrome du côlon irritable.

Perturbations de circulation miARN dans le syndrome du côlon irritable détectée en utilisant un multiplexée à haut débit Gene Expression Plate-forme

Cette méthode de menu déroulant RNA permet d’identifier les cibles de RNA d’un ARN long non codantes (lncRNA). Basé sur l’hybridation du fait maison, conçues anti-sens ADN sondes oligonucléotidiques spécifiques à cette lncRNA dans un tissu convenablement fixe ou une lignée cellulaire, elle permet efficacement la capture de toutes les cibles de RNA de la lncRNA.

RNA liste déroulante procédure pour identifier les cibles ARN d’un ARN Long Non codantes

Nous présentons un protocole pour évaluer les niveaux d’expression des microARN (miARN) en circulation dans les échantillons de plasma de patients atteints de cancer. En particulier, nous avons utilisé un kit disponible dans le commerce pour faire circuler l’extraction de miRNA et transcriptase inverse. Enfin, nous avons analysé un panel de 24 miARN sélectionnés à l’aide de plaques personnalisées sonde préalablement repéré en temps réel.

Détection d’un Panel de micro-ARN Custom circulant chez les Patients atteints de Cancer Colorectal métastatique

Ce protocole utilise une réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, un prédisme de sulforhodamine B (SRB), 3' régions non traduites (3' UTR) et un résultat de luciferase pour vérifier les gènes cibles d'un miRNA d'intérêt et pour comprendre les fonctions des miRNAs.

Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales

Ici, nous présentons un nouveau pipeline de miARN entièrement automatisé, mirMachine qui 1) peut identifier les miARN connus et nouveaux avec plus de précision et 2) est entièrement automatisé et disponible gratuitement. Les utilisateurs peuvent désormais exécuter un court script de soumission pour exécuter le pipeline mirMachine entièrement automatisé.

mirMachine : un guichet unique pour l’annotation des miARN végétaux

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

Le protocole décrit un test d’hybridation par immunofluorescence en tandem avec du tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine pour détecter et quantifier simultanément les microARN et les protéines multiplexées.

Amplification et reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés en tant que nouvelle méthode de détection et de quantification

Découvrez une méthode de pulldown axée sur la biotine pour valider les cibles d'ARNm des miARN cellulaires en utilisant des mimiques LNA biotinylées. Cette technique offre une spécificité élevée pour la recherche en biologie des ARN.

Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

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