Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de l’ARNm, par exemple si la cible de l’ARNm prédite in silico peut interagir directement avec un microARN cellulaire particulier. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle utilise des mimiques biotinylés pour tirer vers le bas l’ARNm cible. Et ces mimiques biotinylés ont une chimie mimique à base d’acides nucléiques verrouillés ou de LNA qui aide à la formation d’oligonucléotides très stables avec une très grande affinité qui peut améliorer la spécificité de la réaction.

Les implications de cette méthodologie sont qu’elle peut aller de la compréhension de la biologie du microARN à des thérapies basées sur les microARN. C’est principalement parce que nous savons tous que les microARN jouent un rôle essentiel dans tous les aspects de la biologie cellulaire. Donc, en identifiant les cibles des microARN, ce sont les ARNm, nous pouvons certainement fournir des connaissances essentielles qui seraient importantes pour la découverte et les traitements.

La démonstration du protocole sera faite par Sabyasachi Dash, un étudiant diplômé de notre laboratoire. Pour enduire les billes magnétiques de streptavidine, commencez par tourbillonner complètement les billes pour les remettre en suspension. Ensuite, transférez 30 microlitres de billes en suspension dans un tube de microfuge sans nucléase de deux millimètres.

Laissez le tube rempli de la suspension à billes magnétiques sur l’aimant pendant deux minutes. Au bout de deux minutes, retirez le surnageant à l’aide d’une micropipette lorsque les billes sont tirées vers le côté du tube en contact avec l’aimant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de lavage aux billes.

Après avoir ajouté le tampon de lavage, retirez le tube de l’aimant. Ensuite, faites tourbillonner les perles pendant 15 secondes pour les laver. Ensuite, transférez le tube contenant les billes magnétiques sur l’aimant pendant deux minutes.

Une fois l’incubation terminée, extrayez le surnageant et jetez-le. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de libération de RNase aux billes. Agitez les billes pendant 15 secondes pour mélanger la solution de RNase.

Ensuite, incubez les perles à température ambiante pendant cinq minutes. Après cinq minutes d’incubation, transférez le tube contenant les billes magnétiques sur l’aimant pendant deux minutes. Après l’incubation, extrayez le surnageant et jetez-le.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de remise en suspension aux billes et vortex pendant 15 secondes. Après le vortex, incubez le tube à température ambiante pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, transférez le tube avec les billes magnétiques sur l’aimant pendant deux minutes.

Au bout de deux minutes, retirez le surnageant et jetez-le. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution de blocage des billes aux billes. Pour remettre les billes en suspension dans la solution de blocage, agitez-la abondamment à température ambiante pendant 15 secondes.

Ensuite, laissez le tube sur un rotateur multitube à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Pour préparer le lysat, utilisez un grattoir cellulaire et raclez les cellules HEK293T transfectées sous le capuchon laminaire. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube microfuge de deux millilitres.

Ensuite, soumettez la suspension cellulaire à une centrifugation à raison de 1 500 g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, dissoudre la pastille cellulaire dans 1x solution saline tamponnée au phosphate maintenue à pH 7,2. Répétez le processus de centrifugation, pour obtenir une pastille sans fluide résiduel.

Une fois la centrifugation terminée, transférez rapidement la pastille sur de la glace. Ensuite, préparez un tampon de lyse cellulaire fraîche. Après avoir préparé le tampon, ajoutez 260 microlitres de tampon de lyse cellulaire complet à l’échantillon dans le tube de microfuge.

Pipetez la pastille cellulaire plusieurs fois pour une suspension homogène. Pour lyser les cellules, incubez les tubes à 80 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, laissez les cellules sur de la glace.

Répétez le processus de centrifugation à 16 000 g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse de paillasse à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, transférez le surnageant contenant du lysat dans un tube microfuge stérile de 1,7 millilitre sur de la glace et expulsez la pastille. Au surnageant, ajoutez cinq molaires de chlorure de sodium pour obtenir une concentration finale d’une molaire.

Tout d’abord, préparez le tampon de lavage rétractable. Après une nuit d’incubation après le blocage des billes, transférez le tube contenant les billes magnétiques sur l’aimant pendant deux minutes. Jetez le surnageant après la période d’incubation.

Aux billes, ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage rétractable glacé. Ensuite, faites tourbillonner les perles à température ambiante pendant 15 secondes. Et incubez immédiatement à température ambiante pendant 30 à 60 secondes.

Au bout d’une minute, transférez le tube contenant les billes magnétiques sur l’aimant pendant deux minutes. Jetez le surnageant après la période d’incubation. Ensuite, mettez les billes en suspension dans 300 microlitres de tampon de lavage complet à rétraction.

Après avoir ajouté du chlorure de sodium, transférez 300 microlitres de lysat cellulaire dans un tube microfuge rempli de 300 microlitres de billes. Ensuite, laissez le mélange sur le mélangeur à nutation pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, transférez le tube sur l’aimant pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant après la période d’incubation. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage complet rétractable glacé aux billes. Une fois le tampon ajouté, faites tourbillonner les billes pendant 15 secondes à température ambiante.

Ensuite, placez le tube sur l’aimant pendant cinq minutes. Jetez le surnageant après la période d’incubation. Ensuite, dissolvez les billes dans 100 microlitres d’eau sans nucléases et stockez-les sur de la glace.

Isolez l’ARN total des billes. Ensuite, dissolvez l’ARN isolé dans 25 microlitres d’eau sans nucléases. Ensuite, mesurez la concentration d’ARN dans le spectrophotomètre.

Enfin, préparez la solution mère de travail d’ARN à 50 nanogrammes par microlitre. Ensuite, utilisez 50 nanogrammes de l’ARN isolé total pour synthétiser l’ADN complémentaire en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, ajoutez des amorces oligo à un volume final de 20 microlitres.

Placez le tube PCR sur le thermocycleur et commencez la course. Une fois la qPCR terminée, transférez neuf microlitres du mélange réactionnel PCR dans chaque puits de la plaque. À chaque puits, ajoutez un microlitre d’ADN complémentaire pour obtenir un volume final de 10 microlitres.

Ensuite, utilisez une scelleuse de plaques PCR résistante à la chaleur pour sceller la plaque PCR et chargez-la sur le thermocycleur. Ensuite, démarrez le programme sur le thermocycleur. Afin de valider les cibles de miR-125b, les niveaux d’expression des ARNm cibles de PARP-1 et p53 sont étudiés.

Il est intéressant de noter que les niveaux d’expression des ARNm PARP-1 et p53 sont comparativement plus élevés que ceux de l’ARNm d’actine, qui est le contrôle négatif. D’autres contrôles négatifs utilisés dans l’expérience sont l’absence de matrice et trois séquences brouillées biotinylées principales. De plus, les trois premières régions non traduites de PARP-1 et p53 quantifiées, montrent également des niveaux d’amplification variables.

Ceci est en comparaison avec les contrôles négatifs, tels que l’actine, l’absence de matrice et trois séquences brouillées biotinylées principales. Cette amplification de PARP-1 et p53 indique qu’il s’agit de cibles fortes de miR-125b cellulaire. Une fois maîtrisée, cette technique, qui commence par le placage des cellules, passe par la transfection des imitations de LNA marquées à la biotine et se termine par l’analyse PCR, en une semaine, si elle est correctement effectuée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de valider les cibles présumées de l’ARNm dans les cellules de mammifères. Cela peut être réalisé avec un rapport de spécificité élevée à un faible bruit en introduisant les trois premières imitations d’acides nucléiques verrouillés marquées à la biotine par transfection dans les cellules de mammifères. N’oubliez pas que travailler avec l’ARN, en particulier les petits ARN, tels que les micro-ARN, peut être très sensible et sujet à la dégradation.

Par conséquent, les précautions nécessaires doivent être prises lors de l’exécution de ce test, telles que l’utilisation d’eau sans nucléases, de tubes de microfuge sans nucléases et de tampons stériles, et des tampons et réactifs fraîchement préparés doivent être pris en compte lors de la réalisation de ce test pour obtenir une meilleure sensibilité et de meilleurs résultats.