Remodelage de membrane de vésicules géants en réponse aux Gradients d’Ion Calcium localisée

Nous présentons une technique de manipulation des vésicules géantes à l’aide de gradients d’ions calcium localisés. Le principal avantage de cette technique est la stimulation entièrement sans contact de la surface de la vésicule et la visualisation directe du remodelage de la membrane lipidique lors de l’interaction avec les ions calcium. Notre approche introduit un moyen d’aborder les détails des interactions membranaires des ions calcium, offrant de nouvelles voies pour étudier les mécanismes de remodelage de la membrane cellulaire lors de changements dans le micro-environnement cellulaire.

Pour commencer cette procédure, préparez une solution de lipides dans du chloroforme. La concentration finale de lipides dans le chloroforme est d’un milligramme par millilitre, et la masse finale est de 0,6 milligramme. Enveloppez le flacon en verre contenant le mélange de lipides avec une feuille métallique pour protéger le contenu de la lumière ambiante.

Placez le flacon d’échantillon enveloppé d’une feuille métallique dans un bécher en verre. Pour éliminer le chloroforme, évaporez le solvant dans un évaporateur rotatif pendant trois heures avec une pression atteignant sept kilopascals sous vide à 80 tr/min. Un film lipidique sec se forme au fond du flacon en verre après évaporation.

Ajoutez lentement 600 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate sur le film lipidique séché. Suite à l’ajout du tampon, ajoutez doucement six microlitres de glycérol pour protéger l’échantillon de la déshydratation complète lors de la formation d’une vésicule unilamellaire géante reliée à une vésicule multilamellaire, ou GUV-MLV. Scellez le flacon en verre à l’aide de Parafilm.

Et couvrez d’une feuille métallique pour protéger de la lumière ambiante. Conservez le flacon à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, sonicer le flacon en verre contenant la solution pendant une minute à l’aide d’un bain d’ultrasons à température ambiante.

Retirez le Parafilm et pipetez jusqu’à ce qu’une solution visuellement uniforme de petites vésicules lipidiques se forme. Aliquote 30 microlitres de la solution de petites vésicules lipidiques obtenue dans des tubes en plastique individuels de 0,5 millilitre. Décongeler un tube de plastique contenant une aliquote de la suspension congelée de petites vésicules lipidiques à température ambiante.

Vortex le tube quatre fois pendant une à deux secondes à l’aide d’un mélangeur vortex à vitesse maximale. Placez cinq microlitres de la suspension de la petite vésicule lipidique sur la surface d’une lamelle en verre pour former une petite gouttelette ronde. Utilisez une lamelle en verre sans aucune étape de pré-nettoyage.

Maintenant, placez la lamelle en verre dans un dessiccateur sous vide pendant 20 minutes. Conservez le film lipidique séché à température ambiante pendant quatre minutes. Ensuite, pipetez lentement 50 microlitres de tampon HEPES de 10 millimolaires sur le film lipidique sec pour la réhydratation.

Attendez cinq minutes pour former les complexes GUV-MLV. Centrez une lamelle en verre sur la platine du microscope. Ensuite, pipetez 300 microlitres de tampon HEPES dessus et positionnez le centre de la gouttelette au-dessus de l’objectif.

Transférez les 50 microlitres de solution préformée GUV-MLV dans la solution HEPES. Attendez 25 minutes pour permettre aux complexes GUV-MLV peu formés d’adhérer fermement à la surface de la lamelle de verre. Arrondissez les bords des capillaires en verre borosilicaté en plaçant doucement les extrémités capillaires dans la flamme d’une bougie pour éviter que la micropipette ne se brise tout en la fixant au porte-micropipette.

Tirez au moins trois capillaires en verre à l’aide d’un extracteur laser automatique. Utilisez les capillaires en verre borosilicaté référencés dans le texte pour obtenir une micropipette avec une ouverture de pointe d’environ 0,3 micron de diamètre. Pour éviter d’obstruer l’extrémité de la pipette, filtrez une solution de chlorure de calcium de cinq millimolaires dans une solution tampon HEPES à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 à 0,5 micron avant l’utilisation.

Ensuite, remplissez chaque micropipette avec huit microlitres de solution de chlorure de calcium à l’aide d’un Microloader. Connectez un support de micropipette à un micromanipulateur. Montez fermement la micropipette dans le support de micropipette.

Connectez ensuite la pompe d’injection et le support capillaire à l’aide du tube d’alimentation. Après avoir démarré la pompe d’injection, ajustez les paramètres de la pompe d’injection à une pression d’injection de 20 hectopascals. Réglez également une pression de compensation de cinq hectopascals.

Réglez le microscope en mode fond clair. Configurez-le pour le contraste d’interférence différentielle. À l’aide du micromanipulateur grossier, positionnez la micropipette au-dessus de la gouttelette contenant les complexes GUV-MLV.

Placez la pointe de la micropipette au-dessus de l’objectif et amenez la pipette jusqu’à la gouttelette à l’aide du micromanipulateur grossier. Réglez le microscope en mode fluorescence. Positionnez la pointe de la micropipette à une distance de trois microns de la surface de la membrane tout en injectant la solution de chlorure de calcium de la micropipette pour permettre la formation de MTP.

Pour déplacer le MTPS le long de la surface GUV, déplacez lentement la pointe de la pipette autour de la surface GUV à l’aide du micromanipulateur fin. Maintenez à peu près la même distance entre la surface GUV et la pointe de la micropipette tout en continuant l’injection d’ions calcium. Pour arrêter la micro-injection, éteignez la pompe d’injection.

Une image représentative de microscopie fluorescente d’un complexe GUV-MLV immobilisé à la surface d’une lamelle de verre est présentée ici. Les protubérances tubulaires membranaires générées lors de l’injection localisée d’ions calcium à la surface du GUV peuvent être observées sur ces images. La translation de la pointe de la micropipette autour de la surface de la membrane, comme indiqué par la flèche, déclenche le mouvement des protubérances tubulaires de la membrane en direction de la source d’ions calcium.

Pour résumer, nous proposons une technique qui permet un remodelage membranaire sans contact de vésicules lipidiques géantes qui ont entraîné la formation de protubérances tubulaires membranaires lors d’une stimulation localisée avec des ions calcium. Les applications futures de cette méthode comprennent la transition des vésicules lipidiques synthétiques aux membranes biologiques natives ou l’application de cette approche aux systèmes polymères dans le but de développer des plateformes de micromanipulation sans contact.