Name: Tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Découvrez la préparation de tranches cerveau-hypophyse viables chez Oryzias latipes pour l'analyse électrophysiologique par patch-clamp perforé. Cette méthode permet d'étudier la communication cellulaire et les réponses aux facteurs cérébraux dans un contexte tissulaire physiologique.

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Nous remercions Mme LourdesCarreon G Tan pour son aide à maintenir l’installation chez les sujets exposés et Anthony Peltier pour les chiffres indicatifs. Ce travail a été financé par ERNM et par le Conseil de recherche norvégien, grant Grant numbers 244461 (programme d’Aquaculture) et 248828 (programme de vie numérique Norvège).

Tous les animaux de manutention a été réalisée conformément aux recommandations pour les soins et le bien-être des animaux de recherche à l’Université norvégienne des Sciences de la vie et sous la supervision des enquêteurs agréés.
1. préparation des Instruments et Solutions
Remarque : Toutes les solutions doivent être stériles. Il faudrait une attention particulière pour le pH et l’osmolarité (osmol/kg d’eau) de toutes les solutions, qui doit être soigneusement adaptée à l’environnement extracellulaire des espèces étudiées. pH et l’osmolalité doivent être ajustées avec un appareil électronique précis tels que le pH mètre et le point de congélation osmomètre respectivement.
<ol><li>
Faire 500 mL de solution extra-cellulaires sans Ca2 + (Ca2 + gratuit EC) : 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM de glucose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissoudre 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de Glucose et 1,19 g de HEPES dans 450 mL d’ultrapure (0,055 uS / cm à 25 ° C, la résistivité de 18,2 MOhm) H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.</li>
		<li>Ajuster le pH à 7,75 avec NaOH.</li>
		<li>Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 500 mL.</li>
		<li>Mélanger la solution bien avant la mesure de l’osmolalité. Ajuster à 290 à 300 mOsm avec du mannitol. Filtre de stériliser la solution en utilisant le système d’aspiration eau et 0,2 µm filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faire 500 mL de solution extra-cellulaires (EC) : 150 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM de glucose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissoudre 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, mg 61,89 MgCl2, 360,32 mg de Glucose et 1,19 g de HEPES dans 450 mL d’ultrapure H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.</li>
		<li>Ajuster le pH à 7,75 avec NaOH.</li>
		<li>Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 500 mL.</li>
		<li>Mélanger la solution bien avant la mesure de l’osmolalité. Ajuster à 290 à 300 mOsm avec du mannitol. Filtre de stériliser la solution en utilisant le système d’aspiration eau et 0,2 µm filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faire 500 mL de solution extra-cellulaires avec 0,1 % d’albumine sérique bovine (EC avec BSA) : 150 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM de glucose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissoudre 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, mg 61,89 MgCl2, 360,32 mg de Glucose et 1,19 g de HEPES dans 450 mL d’ultrapure H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.</li>
		<li>Ajuster le pH à 7,75 avec NaOH.</li>
		<li>Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 500 mL.</li>
		<li>Mélanger la solution bien avant la mesure de l’osmolalité. Ajuster à 290 à 300 mOsm avec du mannitol. Filtre de stériliser la solution en utilisant le système d’aspiration eau et 0,2 µm filtre. Ajouter 50 mg BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faire 250 mL de solution intracellulaire (IC) : 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, saccharose 20 mM.
	<ol>
<li>Dissoudre 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES et 1,712 g de saccharose dans 450 mL d’ultrapure H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.</li>
		<li>Ajuster le pH à 7,2 avec acide (N-morpholino) éthane sulfonique (MES).</li>
		<li>Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 250 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 250 mL.</li>
		<li>Mélanger la solution bien avant la mesure de l’osmolalité. Ajuster à 280-290 mOsm (inférieur à EC 10 mOsm) avec saccharose. Filtre de stériliser la solution en utilisant le système d’aspiration eau et 0,2 µm filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire 100 mL de solution d’agarose fusion faible de 2 % dans ce libre de BSA et de Ca2 + (EC exempts de 2 g de basse fusion agarose dans 100 mL de Ca2 + ). Dissoudre à l’aide d’un four à micro-ondes et placer l’agarose fondu au bain-marie à 40 ° C. Laisser refroidir jusqu'à ce qu’il atteigne 40 ° C avant de l’utiliser sur les tissus. NOTE : EC, Ca2 + EC libre peut-être être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines si stérile et solutions IC à-20 ° C, pendant plusieurs mois. Agarose peut être stocké pendant une semaine à 4 ° C et peut être réutilisé de 3 à 5 fois par brièvement au micro-ondes. Réutilisation excessive conduira à évaporation et altération de gel d’agarose et de concentration de sel et de qualité.</li>
	<li>
Faire le pont de l’agar :
	<ol>
<li>Faites chauffer les capillaires en verre borosilicaté long 7,5 mm diamètre extérieur (diamètre extérieur) 2 mm et diamètre interne (D.I.) 1,16 mm à l’aide d’un bec Bunsen à un focal point environ 1/3 d’un bout jusqu'à ce que le verre commence à plier. Retirer le verre de la flamme et laisser le verre se plier avec un angle de 120 degrés (Figure 2A).</li>
		<li>Faire fondre 2 % d’agar dans EC normal sans glucose à l’aide d’un four à micro-ondes, et alors que l’agarose est liquide remplir le verre pré-faites capillaire à l’aide de capillarité des forces en mettant une des extrémités du verre dans le liquide et attendre quelques minutes. Stocker les ponts jusqu'à l’utilisation à 4 ° C en EC sans glucose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer en verre borosilicate avec pipettes de patch de filaments à l’aide d’un extracteur adapté pipette. Consulter le manuel d’extracteur de pipette pour obtenir la résistance souhaitée électrode. Remarque : Le cône de la pipette doit être aussi court que possible. Cône court pipette est obtenue en utilisant les 4 – 6 étapes traction. La résistance de l’électrode doit être entre 2 et 6 MΩ selon la taille des cellules.</li>
	<li>
Pour éviter tout mouvement du tissu au cours des expériences de patch clamp recouvrir la surface de la chambre d’enregistrement avec 0,1 % de polyéthylènimine (PEI) en tampon borate.
	<ol>
<li>Préparer 500 mL de tampon de borate (25 mM) :<ol>
<li>Dissoudre 4,768 g de Na2B4O710 H2O dans 450 mL d’ultrapure H2O dans un bécher de verre à l’aide d’un agitateur magnétique.</li>
			<li>Ajuster le pH à 8.4 avec HCl.</li>
			<li>Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL. Remplir la fiole jaugée avec ultrapure H2O jusqu'à 500 mL et 0,2 µm filtre stérilisent la solution en utilisant le système de vide de l’eau.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer une solution 1 % of PEI (PEI de 50 % 1 mL de tampon de borate 49 mL 25 mM) et une dilution de PEI de 0,1 % en diluant 10 µL de la solution mère de 1 % dans 100 µL de tampon de borate pour usage final.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de PEI de 0,1 % sur le verre du titulaire de la tranche et laisser le revêtement à incuber pendant 1 minute. Ensuite brièvement laver le verre deux fois avec 5 mL d’ultrapure H2O et laissez l’air sec jusqu'à utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer les solutions d’amphotéricine B.
	<ol>
<li>Faire 60 mg/mL de solution par dissolution de 3 mg de poudre d’amphotéricine B à 50 µL diméthylsulfoxyde (DMSO), dans un tube de mL 1 abri de la lumière. Vortex à la vitesse maximale pendant 30 s et laisser agir pendant 15 min homogénéiser. Stocker les aliquotes dans des tubes de 3-5 à-20 ° C et utilisez une aliquote par jour. Remarque : Si la solution mère de l’amphotéricine B n’est pas clair et jaune couleur mais laiteux (toujours jaune) après 15 à 20 min de sonication faire une nouvelle solution.</li>
		<li>Faire la solution IC avec l’amphotéricine B par pipetage 2 mL de l’IC dans un bécher de verre propre avec plus de capacité de 10 mL. Ajouter 8 µL de solution mère de l’amphotéricine B dans la solution de la pipette et la composition de pipetage. Envelopper le bécher avec une feuille d’aluminium et placez sur la glace jusqu'à l’utilisation et la renouveler toutes les 3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissection et trancher avec Vibratome
<ol><li>Préparer les outils de dissection avant la dissection, y compris un tranchant et une pince solide avec des ciseaux. Nettoyer les outils (mouchoirs, brosse, pince) avec de l’éthanol et s’assurer qu’ils sont utilisés uniquement aux fins de la dissection et jamais en contact avec des tissus fixés. Conservez-les dans une boîte séparée pour éviter la contamination.</li>
	<li>Euthanasier le poisson dans l’eau froide glacée pendant 1 min.</li>
	<li>
Suivez les étapes suivantes pour disséquer rapidement le cerveau chez les sujets exposés et l’hypophyse avec une forte pince (utilisez pas plus de 3 min).
	<ol>
<li>Tout en maintenant le poisson avec la pince forte grave les deux nerfs optiques derrière les yeux avec des ciseaux ou des pinces.</li>
		<li>Ouvrir la partie dorsale du crâne de la partie postérieure de la face antérieure en brisant les os du crâne étape par étape avec une pince forte.</li>
		<li>Décollez le crâne d’un côté avec une pince forte.</li>
		<li>Sévère de la moelle épinière avec des ciseaux ou une pince forte.</li>
		<li>Doucement, prenez la moelle épinière avec la pince, retourner le cerveau postérieur à la partie antérieure et placez-le dans un plat avec la glacée Ca2 + gratuit EC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplissez un moule métallique de 1,5 à 2 cm3 avec liquide d’agarose et placez-le sur la glace.</li>
	<li>Juste avant que l’agarose se solidifie (aux environs de 25 – 30 ° C), doucement, saisir le cerveau de la moelle épinière avec la pince, sécher la pince avec un morceau de papier fin et mettre le tissu dans l’agarose. Mélanger rapidement le gel d’agarose pour diluer les traces d’EC à gauche autour du tissu et orienter le tissu et laisser le moule sur la glace pendant quelques secondes jusqu'à ce que l’agarose durcisse. Remarque : Il est essentiel pour cette étape être rapide. L’agarose se solidifie rapidement comme le moule métallique est refroidi par la glace.</li>
	<li>Coupez un bloc carré d’agarose contenant le tissu avec une lame de bistouri et le coller sur le porte-échantillon vibratome avec de la colle de la chirurgie (non toxique).</li>
	<li>Remplir la cuvette de la vibratome reçoit le porte-échantillon (cerveau-hypophysaire) avec glacée Ca2 + gratuit EC.</li>
	<li>Placez le porte-échantillon dans le vibratome et coupez le bloc de gel d’agarose pour rendre parasagittale sections de 150 µm, à l’aide de fréquence haute et la basse vitesse pour le sectionnement. Recueillir les sections sélectionnées et les placer dans la chambre d’enregistrement patch clamp avec 3 mL de glacée Ca2 + gratuit EC.</li>
	<li>Placez la harpe de la grille (Figure 2B) sur la section de tissu. Remarque : La harpe sera ainsi que le revêtement stabiliser le tissu et empêchez-le de se déplacer pendant les enregistrements de patch clamp.</li>
	<li>Après que la harpe est en place, remplacez le Ca2 + EC milieu sans la ce normal avec Ca2 + et BSA. Laisser le reste de tissu pendant 10 min.</li>
</ol>3. perforé Patch-clamp et enregistrements électrophysiologiques
<ol><li>Avant de commencer l’expérience, le chlorure d’argent fil électrodes par les étapes suivantes : tout d’abord, utilisez un papier de verre fin (p180) pour nettoyer les électrodes de fil d’argent. Ensuite, rincer avec 2 mL, éthanol à 70 %. Troisièmement, faire tremper les fils dans 2 mL, 2 – 5 % de chlore pendant 10 min. Enfin, rincez avec 2 mL, ultrapure H2O.</li>
	<li>Placez la chambre d’enregistrement avec la tranche de cerveau-hypophyse dans la platine du microscope et repérez la zone cible (hypophyse) utilisant l’objectif 10 X et inspecter les cellules à l’aide d’objectif 40. Remarque : Si la préparation est réussie, très peu de cellules rondes doit être visible. Ces cellules rondes sont généralement endommagés qui sont détacher du tissu.</li>
	<li>Placer l’électrode de mise à la terre à travers le pont de 2 % d’agar dans le bain d’EC.</li>
	<li>Localiser une cellule saine en utilisant l’objectif X 40. Remarque : Une cellule saine doit être fermement attachée à la tranche de tissu arrondie et non détachée de la tranche.</li>
	<li>Configurer l’amplificateur en tension-bride (VC ; Mode de la figure 4 a , point 1). Ouvrir le sceau tester fenêtre et appuyez sur configuration de la salle de bain (Figure 4 b point 1 et 2. Une impulsion de 5-mV permet de surveiller la résistance de pipette (Figure 4 b point 3).</li>
	<li>Remblayez l’embout de la pipette avec la solution antifongique de IC libre avant d’ajouter la solution IC avec l’amphotéricine B, à l’aide d’une seringue de remplissage-micro (voir Figure 3).</li>
	<li>Ajouter une pression légèrement positive dans la pipette à l’aide de la seringue de 1 mL. Remarque : Cela fait un petit écoulement de liquide de la pipette qui évitent la contamination de l’embout.</li>
	<li>Une fois dans le bain, évaluer la résistance de pipette de patch et assurez-vous qu’aucune particule n’est attachés à l’extrémité de la pipette (Figure 4). Remarque : Un petit morceau de ruban est attaché sur le moniteur afficher le formulaire d’enregistrement vidéo du champ de vision. Ce qui rend le positionnement de la pipette par rapport à la cellule plus facile lorsque l’objectif n’est pas en se concentrant sur la cellule.</li>
	<li>Guide de la pipette vers le bas pour la cellule à l’aide de micromanipulateurs. Remarque : Assurez-vous que la pipette est propre en recherchant les petites particules peuvent avoir attachés à l’extrémité de la pipette. Des changements soudains dans la résistance peuvent également résulter de particules coincé dans l’embout de la pipette.</li>
	<li>Réajuster la pipette lors de quelques microns au-dessus de la cellule afin que l’embout de la pipette ne touche la cellule 1/3 du milieu de la cellule, comme illustré à la Figure 5. Lorsque vous touchez la cellule, relâchez la pression et appliquer la succion douce pour faire un joint d’étanchéité. NOTE : Le temps de la pipette pénètre dans le bain à un succès joint doit être aussi courts que possible. Pas plus de 1 – 1,5 min afin d’éviter l’amphotéricine B pour atteindre l’extrémité de la pipette et la fuite dans le bain.</li>
	<li>Immédiatement basculer vers la fenêtre patch dans le logiciel de patch clamp (Figure 4 D point 1) et ont un potentiel de maintien entre-50 et -60 mV (point 2 dela Figure 4 ). Zéro out la capacitance rapide composée par la pipette de verre (point 3 dela Figure 4 ).</li>
	<li>Basculer vers la fenêtre de la cellule dans le logiciel de patch clamp (Figure 4E point 1 et 2) et commencer à surveiller la résistance accès, Ra, affichée dans la fenêtre. Après un accès suffisant à zéro la capacité de la membrane dans le logiciel de l’amplificateur (Figure 4E point 3). Remarque : Un accès suffisant peut prendre 10 à 30 min (Figure 4E point 2). Un bon accès pour les enregistrements de pince actuel devrait être inférieure à 20 M.</li>
	<li>Passer à la pince ampèremétrique, IC, dans la fenêtre du logiciel amplificateur (Figure 4F point 1). Ajuster les courants capacitifs-rapide dans la fenêtre j’ai-pince du logiciel amplificateur (Figure 4F point 2 et 3) sur la même valeur qu’en 3.12. Vérifier le potentiel de membrane (Figure 4F point 1). NOTE : Ce qui est important, si le potentiel de membrane est peu profond (typiquement au-dessus -35 mV) la cellule pourrait être endommagée. Annulez l’enregistrement et trouver une nouvelle cellule.</li>
	<li>Après avoir trouvé une cellule saine (solidement fixé au tissu avec membrane potentiel au-dessous de -40 mV), commencer les enregistrements expérimentaux comme indiqué dans protocole 33,34 les directives du fabricant.</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer

Des enregistrements électrophysiologiques utilisant la technique du patch-clamp sur des tranches de cerveau-hypophysaire nécessitent optimisation minutieuse. Des protocoles bien optimisés pour mener des enquêtes de cellules vivantes spécifiquement chez les téléostéens sont limitées, la majorité des publications à l’aide de protocoles basés sur les systèmes mammaliens. À cet égard, il est important d’être conscient du fait que plusieurs paramètres physiologiques tels que pH et l’osmolalité sont non seulement les espèces d...

L’hypophyse est un organe clef endocrine chez les vertébrés situés au-dessous de l’hypothalamus et derrière le chiasma optique. Il produit et sécrète des hormones de six à huit des types spécifiques de cellules. Hormones hypophysaires constituent un intermédiaire entre le cerveau et les organes périphériques et conduire un large éventail de processus physiologiques essentiels dont la croissance, la reproduction et la régulation de l’homéostasie. Similaire aux neurones, les cellules endocrines de l’hypophyse sont électriquement excitables avec la possibilité de tirer des potentiels d’action spontanément 1. Le rôle de ces potentiels d’action est la cellule dépendante. Dans plusieurs types de cellules de l’hypophyse chez les mammifères, les potentiels d’action peuvent élever l’intracellulaire Ca2 + suffisamment pour une libération prolongée de l’hormone 2. En outre, l’hypophyse reçoit des informations de stimulateurs et inhibiteurs du cerveau qui affecte le potentiel de membrane des cellules 3,4,5,6. En règle générale, entrée stimulatrice augmente l’excitabilité et souvent implique la libération de Ca2 + des réserves intracellulaires ainsi augmenté tir fréquence 7. Comprendre comment la cellule utilise la composition de canal d’ion et s’adapte à ces signaux du cerveau est la clé de la synthèse des hormones compréhension et libération.
La technique du patch-clamp a été développée dans les années 1970 par Sakmann et Neher 8,9,10 et encore améliorée par Hamill 11et permet des enquêtes détaillées sur les propriétés électrophysiologiques des cellules vers le bas pour les canaux ioniques isolés. Par ailleurs, la technique peut être utilisée pour l’étude de courant et tension. Aujourd'hui, serrage patch est l’étalon-or pour mesurer les propriétés électrophysiologiques de la cellule. Quatre principales configurations de la technique de patch clamp d’étanchéité ont été développés 11; la cellule-attachée, la dedans-dehors, l’extérieur-out et le patch de cellules entières. Les trois premières configurations sont généralement utilisées pour les enquêtes de canal ionique unique. Pour la quatrième, suivant la configuration cellule-attachée, un trou dans la membrane cellulaire est réalisée à pression atmosphérique Sub. Cette configuration permet également aux enquêtes de la composition de canal ionique de la cellule entière 12. Cependant, une des limites de cette technique sont que les molécules cytoplasmiques sont dilués par le patch pipette solution 13 (Figure 1A), ce qui influe sur les réponses électriques et physiologiques des cellules étudiées. En effet, certaines de ces molécules peuvent jouer un rôle important dans la transduction du signal ou la régulation des canaux ioniques différentes. Pour éviter cela, Lindau et Fernandez 14 a développé une méthode où un composé formant des pores est ajouté à la pipette. Après la configuration de la cellule-attachée, le composé sera intégrer dans la membrane plasmique sous le timbre et lentement perforer la membrane créant un contact électrique avec le cytosol (Figure 1B). Plusieurs différents antifongiques comme nystatine 15 et amphotéricine B 16, ou les agents tensio-actifs comme la saponine bêta-escine 17,18 peuvent être utilisé. Ces composés créer pores assez grands pour permettre des cations monovalents et Cl– diffusion entre le cytosol et la pipette tout en préservant les niveaux cytosoliques des macromolécules et des ions plues comme Ca2 + 15, 16.
Le défi de l’utilisation de patch perforé est la résistance série potentiellement élevés. Résistance série (R,s) ou accès résistance dépasse la résistance combinée la pipette relativement au sol. Pendant les enregistrements de patch-clamp, le Rs sera en parallèle avec la résistance de la membrane (Rm). Rm et Rs dans un travail parallèle comme un diviseur de tension. Avec la haute Rs, la tension risque de tomber le R des des erreurs dans les enregistrements. L’erreur deviendra plus grande avec les plus grands courants enregistrés. En outre, le diviseur de tension est aussi fréquence dépendant de création d’un filtre passe-bas, affectant ainsi la résolution temporelle. En effet, le patch perforé ne permette pas toujours les enregistrements d’un grand et rapide comme le voltage dépendants des courants Na+ (pour les lectures détaillées voir référence 19). En outre, Rs peuvent varier pendant les enregistrements de patch clamp, encore une fois, conduisant à des changements dans le courant enregistré. Ainsi, les faux positifs peuvent se produire dans les situations où Rs change pendant la demande de drogue.
L’électrophysiologie sur le tissu en tranches a été introduite par le laboratoire d’Andersen à l’étude des caractéristiques électrophysiologiques des neurones dans le cerveau de 20. La technique a ouvert la voie à des investigations détaillées des cellules isolées, mais aussi des circuits de communications et de la cellule de cellules dans un environnement plus intact. Une technique similaire pour faire des tranches hypophysaires a été introduite en 1998 par Guérineau et al. 21. Toutefois, il n’était pas avant 2005, cette préparation de tranches de cerveau-hypophysaire a été utilisée avec succès pour les études de patch clamp en téléostéens 22. Dans cette étude, les auteurs signalent également l’utilisation d’enregistrements perforés patch clamp. Toutefois, de loin, la plupart des études électrophysiologiques des cellules hypophysaires ont été réalisée chez les mammifères et seule une poignée d’autres vertébrés, y compris les poissons téléostéens 1,2,22,23 . Chez les téléostéens, presque toutes les études ont été réalisées sur des cellules dissociées primaire 24,25,26,27,28,29,30 .
Dans le présent document, nous décrivons un protocole optimisé pour la préparation des tranches de cerveau-hypophysaire sains du médaka poisson de modèle. L’approche représente plusieurs avantages par rapport aux cultures primaires de cellules dissociées. Tout d’abord, les cellules sont enregistrées dans un environnement relativement préservé par rapport à dissocié des conditions de culture cellulaire. Deuxièmement, préparations de tranches nous permettent d’étudier les voies indirectes médiées par les cellules de communication 22, qui n’est pas possible dans les conditions de culture de cellules dissociées. En outre, nous montrent comment effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur les tranches de tissus obtenus à l’aide de la technique de patch-clamp de la cellule entière perforé avec l’amphotéricine B comme agent formant des pores.
Médaka est un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie, présent principalement au Japon. La physiologie, embryologie et la génétique des médakas ont été largement étudiée pour plus de 100 ans 31, et c’est un modèle de recherche communément utilisé dans de nombreux laboratoires. Une importance particulière à ce document est l’organisation morphologique distincte du complexe hypothalamus-pituitaire chez les poissons téléostéens : alors que chez les mammifères et les oiseaux, les neurones hypothalamiques libèrent leurs neuro-hormones régulation hypophysaires cellules endocrines dans le système de la porte de l’éminence médiane, il y a une projection nerveuse directe des neurones hypothalamiques sur les cellules endocrines de l’hypophyse de poissons téléostéens 32. Ainsi, soigneusement conduite cerveau-hypophysaire trancher, c’est d’une importance particulière chez les poissons, nous permettant d’étudier les caractéristiques électrophysiologiques des cellules hypophysaires dans un réseau de cerveau-hypophysaire bien préservé et des cellules en particulier comment hypophysaires contrôler leur excitabilité et, partant, l’homéostasie de Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Colle chirurgicale</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Adhésif pour tissus</td></tr><tr><td>Lames en acier inoxydable</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>moules métalliques</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>harpe en acier</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes patch ultra-pures LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicate avec filament D.E. :1,5 mm, D.I. :10 mm</td></tr><tr><td>Microscope Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>sofware</td></tr><tr><td>Numériseur Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH sel de trifluoroacétate&nbsp ;</td></tr><tr><td>extracteur de pipette</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>amphotéricine B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>antibiotique poreux</td></tr><tr><td>polyéthylénamine&nbsp ;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50 % PEI solution</td></tr><tr><td>microfiler</td><td>seringue WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>verre pour le pont en gélose</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilicate avec filament D.E. :2.0 mm, I.D. :1.16 mm Logiciel</td></tr><tr><td>Micro-Manager poli au feu Logiciel</td><td></td><td></td> de <td>microscopie Open Source Logiciel de microscopie</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS caméra</td><td>Qimaging</td><td>&nbsp ; 01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicateur</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-acid</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Des études électrophysiologiques des cellules hypophysaires ont été menées dans nombreuses espèces de vertébrés, mais très peu chez les poissons téléostéens. Parmi ceux-ci, la nette majorité ont été réalisée sur des cellules primaires dissociées. Pour améliorer notre compréhension des cellules hypophysaires chez les téléostéens comment se comporter dans un milieu biologiquement plus adéquat, ce protocole montre comment préparer des tranches de cerveau-hypophysaire viables utilisant le médaka de petits poissons d’eau douce (Oryzias latipes). Faire des tranches de cerveau-hypophysaire, pH et l’osmolarité de toutes les solutions ont été ajustées aux valeurs contenues dans les fluides corporels de poissons d’eau douce vivant à 25 à 28 ° C. Après préparation de tranches, le protocole montre comment effectuer les enregistrements électrophysiologiques en utilisant la technique de patch-clamp de la cellule entière perforé. La technique du patch-clamp est un outil puissant avec résolution temporelle sans précédent et sensibilité, permettant l’étude des propriétés électriques des cellules entières intacts jusqu'à des canaux ioniques isolés. Patch perforé est unique en ce qu’il garde l’environnement intracellulaire intact empêchant des éléments de régulation dans le cytosol de dilution de la solution d’électrodes patch pipette. En revanche, lorsque vous effectuez des enregistrements de cellules entières traditionnelles, on a observé que les cellules hypophysaires médaka perdent rapidement leur capacité à tirer des potentiels d’action. Parmi les diverses techniques de perforation disponibles, ce protocole montre comment atteindre la perforation de la membrane raccordée à l’aide du fongicide amphotéricine b.

Ce protocole montre un protocole étape par étape comment réaliser des enregistrements électrophysiologiques fiables des cellules de l’hypophyse (gonadotrope), en utilisant une ligne de médakas transgéniques [Tg (lhb- hrGfpII)] où la cible des cellules (gonadotropes Lh-production) sont étiquetés avec la protéine fluorescente verte (GFP).
Au départ, les études électrophysiologiques ont été effectuées à l’aide de la config...

L’article décrit un protocole optimisé pour faire des tranches de tissus de cerveau-hypophysaire viables, en utilisant le médaka poissons téléostéens (Oryzias latipes), suivie par des enregistrements électrophysiologiques des cellules hypophysaires en utilisant la technique de patch clamp avec le configuration de patch perforé.

Tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroendocrinologie. Par exemple, comment les cellules hypophysaires communiquent-elles, réagissent-elles au facteur de libération du cerveau ? Le principal avantage de cette technique est que, par rapport à cette première culture cellulaire primaire, cette procédure permet d’étudier les cellules dans un environnement plus intact.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des propriétés électriques des cellules productrices d’hormone lutéinisante à Medaka. Avec seulement des ajustements mineurs, il peut également être utilisé pour d’autres types de cellules ou pour d’autres espèces de poissons. Tout en tenant un poisson téléostéen euthanasié avec des pinces puissantes stérilisées à l’éthanol sous un microscope à dissection, sectionnez les deux nerfs optiques derrière les yeux avec des pinces tranchantes et brisez les os du crâne de la face postérieure à la face antérieure.Utilisez la pince pour décoller le crâne et sectionner la moelle épinière. En saisissant doucement la moelle épinière à l’aide de la pince, le cerveau passe de l’orientation postérieure à l’orientation antérieure et placez l’organe dans un plat rempli de milieu extracellulaire glacé et sans calcium. Ensuite, remplissez une prise métallique d’un point de cinq à deux centimètres cubes avec de l’agarose liquide et placez le moule sur de la glace.Juste avant que l’agarose ne se solidifie, utilisez la pince pour ramasser doucement le cerveau par la moelle épinière, séchez la pince avec un morceau de papier de laboratoire et placez le cerveau dans l’agarose. Ensuite, mélangez rapidement l’agarose pour diluer toute trace de milieu extracellulaire laissée sur le tissu et ajustez l’orientation du cerveau à l’intérieur du moule si nécessaire. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, utilisez une lame de scalpel pour couper un bloc carré d’agarose autour du tissu et utilisez de la colle chirurgicale pour fixer l’échantillon sur un porte-échantillon de vibratome.Remplissez la cuvette du support de vibratome avec un milieu extracellulaire glacé et sans calcium et placez le support dans le vibratome. À l’aide d’une fréquence élevée et d’une faible vitesse, coupez le bloc d’agarose pour faire des sections parasagittales de 150 micromètres, en plaçant la section sélectionnée dans les chambres d’enregistrement de patch-clamp contenant trois millilitres de solution extracellulaire glacée et sans calcium. Il est important de se déplacer rapidement une fois que le cerveau a été ajouté à l’agarose, car le tissu se dessèchera s’il est laissé dans l’agarose moulée trop longtemps et a un accès limité à l’air avant d’être sectionné.Lorsque toutes les coupes ont été obtenues, placez une harpe sur la section de tissu et remplacez le milieu extracellulaire exempt de calcium par un milieu extracellulaire contenant du calcium complété par de l’albumen sérique bovin. Laissez ensuite reposer le mouchoir pendant 10 minutes. Pour installer le patch-clamp, placez la chambre d’enregistrement avec la tranche de l’hypophyse cérébrale sur la platine du microscope d’enregistrement du patch-clamp et utilisez l’objectif 10X pour localiser la glande pituitaire.Placez l’électrode de mise à la terre à travers le pont d’agar à 2 % dans le bain de milieu extracellulaire et utilisez l’objectif 40X pour localiser une cellule saine. Réglez l’amplificateur en mode de pince de tension et ouvrez la fenêtre de test d’étanchéité. Sélectionnez la configuration du bain et utilisez une impulsion de cinq millivolts pour surveiller la résistance de la pipette.Remplissez l’extrémité de la pipette patch avec un milieu intracellulaire sans antifongique avant d’utiliser une seringue de microremplissage pour ajouter une solution intracellulaire complétée par de l’amphotéricine B à la partie postérieure de la pipette patch. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, ajoutez une pression d’air légèrement positive dans la pipette patch afin d’éviter de contaminer la pointe de la pipette et d’évaluer la résistance de la pipette patch. Si aucune particule n’est attachée à l’extrémité de la pipette, utilisez les micromanipulateurs pour guider la pipette patch jusqu’à la cellule.Réajustez la pipette lorsqu’elle se trouve à quelques microns au-dessus de la cellule afin que la pointe de la pipette touche la cellule à un tiers de la distance du milieu de la cellule. Pour toucher la cellule, relâchez la pression et appliquez une légère aspiration pour faire un joint. Il est essentiel d’appliquer le gigaseal rapidement car une pression positive à l’intérieur de la pipette patch entraînera une fuite de solution antifongique après environ une minute d’endommagement des cellules.Lorsque le joint est en place, passez immédiatement à la fenêtre de brassage dans le logiciel de pince de réparation et ajustez le potentiel de maintien entre moins 50 et moins 60 millivolts. Mettez à zéro la capacité rapide constituée par la pipette en verre et passez à la fenêtre de la cellule pour commencer à surveiller la résistance d’accès, en mettant à zéro la capacité de la membrane dans le logiciel de l’amplificateur après un accès suffisant. Passez à la pince ampèremétrique et ajustez la valeur correcte des courants capacitifs rapides de la pipette dans la fenêtre I-Clamp, et vérifiez le potentiel de membrane résultant.Ensuite, avec la cellule fermement attachée à un tissu avec un potentiel de membrane inférieur à moins 40 millivolts, commencez les enregistrements expérimentaux selon le protocole du fabricant. Les potentiels d’action peuvent être déclenchés dans un sous-ensemble de cellules hypophysaires à l’aide d’injections de courant de cinq à neuf picoampères à partir d’un potentiel de repos compris entre moins 50 et moins 60 millivolts. Ces potentiels d’action ont une durée d’attente rapide et après environ quatre à six minutes, les potentiels d’action déclenchés ne sont plus réalisables.En passant à la configuration du patch perforé à l’aide de l’amphotéricine B, des potentiels d’action spontanés peuvent être observés dans environ 50 % des cellules enregistrées et les potentiels d’action peuvent être déclenchés dans 95 % de ces cellules sans qu’il n’y ait de réduction observable, même après une heure d’enregistrement. L’hormone de libération des gonadotrophines un, la bouffée éjectée sur les cellules dans la configuration du patch perforé révèle une réponse biphasique, au cours de laquelle les cellules sont hyperpolarisées dans la première phase de la réponse, entraînant une libération de calcium à partir des réserves internes, suivie d’une dépolarisation des cellules et d’une augmentation de la fréquence de déclenchement du potentiel d’action de un à deux hertz à trois hertz dans la deuxième phase. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que toutes les solutions doivent être adaptées à la physiologie de l’organisme expérimental que vous utilisez, dans ce cas, Medaka, et vous devez porter une attention particulière au pH car cette valeur varie entre les espèces vivant à des températures différentes.

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Nous utilisons la technique de patch-clamp pour mesurer le GABA-activé un seul canal courants (GABAA canaux, récepteurs GABA) et les courants synaptiques et tonique qu'ils génèrent dans les neurones. L'activation des canaux diminue l'excitabilité neuronale dans la santé et la...

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Tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens (Vidéo) | JoVE Journal

Tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens

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