Différenciation, l’entretien et l’analyse des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien humain : un modèle de maladie-dans-un-plat pour les Mutations BEST1

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies rétiniennes liées aux canaux ioniques sur les mécanismes moléculaires des mutations de BEST1 et la pathologie des bestrophinopathies. Le principal avantage de cette technique est qu’elle contourne la difficulté d’obtenir directement des cellules EPR à partir de l’homme. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des bestrophinopathies, y compris la maladie de Best, car les cellules RPE peuvent être utilisées à la fois à des fins de recherche et de thérapies de remplacement cellulaire.

Lorsque la culture hPSC atteint sa confluence, remplacez le milieu de culture par quatre millilitres de milieu de différenciation par puits d’une plaque à six puits. Après deux semaines de culture, complétez le milieu de différenciation avec 100 nanogrammes par millilitre d’activine-A humaine, en changeant le milieu supplémenté trois fois par semaine pendant 14 jours supplémentaires. Le 29e jour, passer à un milieu de différenciation non supplémenté pendant huit à 10 semaines supplémentaires jusqu’à l’apparition d’amas de cellules RPE pigmentées.

Pour isoler les cellules RPE pigmentées, tenez d’abord des pipettes Pasteur en verre de neuf pouces horizontalement au-dessus de la flamme d’un bec Bunsen, à environ les deux tiers de la longueur de la partie mince de la pipette. Lorsque le verre chauffé devient mou, écartez rapidement les deux extrémités pour former une pointe en forme de micrograttoir à la nouvelle extrémité de la pipette. Vaporisez les pipettes tirées avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher à l’air libre dans une hotte de culture cellulaire.

Lorsque les pipettes sont prêtes, laver chaque puits de la culture de différenciation avec du PBS et ajouter un millilitre de trypsine à 0,05 % complété par une unité par microlitre de collagénase dans chaque puits. Après 20 à 30 minutes à 37 degrés Celsius, arrêtez la digestion avec deux millilitres de milieu RPE à 37 degrés Celsius par puits d’une plaque à six puits et placez la plaque sur une platine de microscope. À l’aide d’une pipette tirée, tapotez doucement les grappes d’EPR pigmentées.

Dès que les cellules se détachent du fond du puits, utilisez une micropipette de 20 microlitres pour transférer les cellules dissociées dans les puits individuels d’une nouvelle plaque de culture cellulaire contenant un milieu RPE. Lorsqu’environ 5 000 cellules EPR ont été ajoutées à chaque puits d’une plaque à 12 puits, porter le volume final à deux millilitres avec un milieu EPR frais et cultiver les cellules hPSC-EPR isolées pendant six à huit semaines supplémentaires jusqu’à ce qu’une monocouche de cellules EPR matures pigmentées et en forme de pavé soit observée. 24 à 72 heures avant le patch clamp, laver les cellules monocouches pigmentées avec deux millilitres de PBS, puis, après avoir retiré le PBS, ajouter un millilitre de 0,05 % de trypsine plus une unité par microlitre de collagénase aux cellules dans chaque puits d’une plaque à 12 puits pendant une période d’incubation de huit minutes à 37 degrés Celsius.

Lorsque les cellules commencent à se détacher, utilisez une micropipette d’un millilitre pour laver doucement les cellules du fond du puits et regrouper la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez un millilitre de solution de trypsine-collagénase à 37 degrés Celsius dans le puits. Incuber pendant encore huit minutes à 37 degrés Celsius, puis laver toutes les cellules restantes du fond du puits et combiner la suspension cellulaire dans le même tube conique de 15 millilitres.

Incuber les cellules dans un bain sec à 37 degrés Celsius pendant huit minutes, puis à l’aide d’une micropipette d’un millilitre, triturer doucement les cellules 10 à 15 fois. Après avoir incubé et trituré les cellules deux fois de plus, ajoutez cinq millilitres de milieu RPE à 37 degrés Celsius à la suspension unicellulaire et granulez les cellules par centrifugation. Remettre le granulé en suspension dans le volume approprié pour l’ensemencement sur des plaques pré-enduites avec des lamelles de recouvrement à 10 à 20 % de confluence et effectuer le serrage du patch à cellules entières selon les protocoles standard.

Après un isolement réussi, plus de 90 % des cellules de la population du passage zéro devraient arriver à maturité pour présenter la morphologie cellulaire caractéristique de l’EPR. Grâce à l’approche de la maladie dans une boîte basée sur hPSC-RPE, chaque mutation BEST1 spécifique au patient peut être caractérisée de manière exhaustive pour son expression protéique, son trafic membranaire et sa fonction des canaux ioniques afin d’obtenir des informations essentielles pour élucider les mécanismes pathologiques de l’EPR. Il convient de noter que certaines mutations de BEST1 peuvent affecter son expression protéique, de sorte que d’autres marqueurs RPE bien établis doivent également être vérifiés.

La différenciation des cellules souches pluripotentes humaines prend de trois à six mois, selon la lignée de cellules souches pluripotentes humaines et le type de mutation, et l’isolement des cellules pluripotentes humaines différenciées peut être terminé en deux heures s’il est effectué correctement. Lorsque vous essayez de diviser les cellules pour le patch clamp, il est important de se rappeler de triturer les cellules très doucement pour éviter une mort cellulaire excessive. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la culture cellulaire 3D de l’EPR peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont le transport des ions sur les membranes apicales et basales des cellules de l’EPR est affecté par les mutations de BEST1.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies dégénératives de la rétine pour explorer les phénotypes physiologiques et les mécanismes pathologiques des cellules EPR dérivées de patients. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de différencier les cellules souches pluripotentes en cellules d’épithélium pigmentaire rétinien et de préparer les cellules EPR pour le patch clamp de cellules entières.