Name: Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Découvrez la culture de tissus ovariens pour étudier le développement folliculaire et l'atresie chez la souris. Cette méthode permet l'observation en temps réel des phénomènes ovariens dans des conditions contrôlées.

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Nous remercions le Dr Naojiro Minami (Université de Kyoto) pour fournir les souris Oog1pro3.9 . Cette recherche a été financée par la SJPS (KAKENHI # JP15H06275) et la Fondation de Nitto.

Souris ont été logés dans une environnement contrôlée chambre à 23 ± 1 ° C, avec un cycle foncé h de lumière/12 12 h. Expériences et protocoles de soins des animaux ont été effectuées conformément aux directives pour l’expérimentation animale à l’Université médicale de Aichi et ont été approuvés par le Comité de l’emploi et les animalerie titulaires.
1. préparation du milieu de Culture et de la vaisselle
<ol><li>Pour préparer le milieu de culture de base, ajoutez le sérum fœtal (SVF, 5 % v/v), FSH (100 mUI/mL), LH (10 mU/mL) et la pénicilline-streptomycine (pénicilline, 100 U/mL, streptomycine, 100 mg/mL) au minimum indispensable moyen alpha (MEM-alpha) et mélanger en tubes de 50 mL. Remarque : Le volume Total de milieux de culture requis varie selon les expériences, mais 1 mL de milieu de culture est généralement suffisant pour récipients de culture 3,5 cm fond en verre.</li>
	<li>Verser 1 ml de milieu de culture mixte dans Pétri de 3,5 cm fond en verre et placer des inserts de culture cellulaire lieu 30 mm en plats. Réchauffez les plats dans un incubateur (5 % de CO2 et 37 ° C) et les médias.</li>
</ol>2. préparation de tissu ovarien
<ol><li>Tamponnée au phosphate Préchauffez salin (PBS) (−) et MEM-alpha contenant 5 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL dans un incubateur (5 % de CO2 et 37 ° C). NOTE : Environ 3 mL aliquotes de PBS (−) par l’ovaire sont suffisants pour une utilisation au cours de la dissection de l’ovaire, et 1 ml de MEM-alpha n’est pas pour stockage transitoire des ovaires unique dans les plats de 3,5 cm.</li>
	<li>
Exciser les ovaires des 4 - semaine vieilles souris ICR (nommé d’après l’Institut du cancer) femelles et couper les tissus entourant l’ovaire à l’aide de ciseaux et pince à épiler sous un microscope stéréoscopique. Réserver les ovaires retirés en milieu de culture (Voir l’étape 2.1) jusqu'à utilisation.
	<ol>
<li>Place des ovaires unique sur papier filtre imbibés de préchauffée PBS (−) (reportez-vous à l’étape 2.1) et tranche en 4 morceaux à l’aide d’une lame microtome sous un microscope stéréoscopique. Remarque : Les ovaires de 4 - semaine vieilles souris ICR sont environ 2 mm de diamètre. Le nombre de pièces dépend de la taille des ovaires ; Cependant, environ 500 µm morceaux épais permettant observations bon follicule (en morceaux plus épais que 500 mm, transparence du tissu est diminuée ; en morceaux plus mince que 500 mm, de nombreux follicules antraux sont brisés et perdus).</li>
		<li>Après dissection, placer les spécimens de l’ovaire en tranches dans le milieu de culture pré chauffé dans les plats de 3,5 cm (reportez-vous à l’étape 2.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ovaire Culture de tissus
<ol><li>Déposer environ 0,5 µL de milieu de culture par tranches de tissus ovariens sur l’insert de culture cellulaire où le tissu ovarien sera définie à l’aide d’une micropipette.</li>
	<li>Placer chaque échantillon en tranches dans une goutte de milieu de culture sur les inserts de culture cellulaire à l’aide de la pince à épiler.</li>
	<li>La culture des tissus de l’ovaire à 5 % de CO2 à 37 ° C.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture avec un milieu frais préchauffé tous les 2 jours. NOTE : Le calendrier des changements moyens pour la culture des sections d’ovaire de 4 - semaine vieilles souris ICR est présenté dans la Figure 1.<ol>
<li>Pour reproduire le pic de LH, traiter cultivées 4 - semaine vieux ovaires de souris ICR avec un milieu contenant 100 mU/mL FSH et LH pendant 12 h tous les 4 jours (Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. microscope Images d’ovaires cultivées
<ol><li>Démarrez les ovaires cultivées d’imagerie après jour 1 lorsque les tissus ayant adhéré aux traités sur les inserts de culture cellulaire et effectuer des analyses de microscopie confocale ou ombiliqués à intervalles de 24 heures pour permettre la croissance folliculaire suffisante entre les points dans le temps. NOTE : Microscopie confocale est supérieure à la microscopie inversée pour l’observation des follicules dans les ovaires de toute cultures.</li>
</ol>5. Time-lapse imagerie des ovaires cultivées
<ol><li>
Optimiser les conditions d’imagerie Time-lapse, y compris le laser des intensités et des durées d’exposition, pour le système d’imagerie (tableau 1).
	<ol>
<li>Sélectionnez ovaire appariés échantillons provenant de souris unique pour une utilisation comme groupes de traitement et de contrôle. Varier les intensités de laser et de la durée d’exposition pour obtenir les meilleures images (tableau 1).</li>
		<li>Comparer la croissance folliculaire dans chaque condition de culture de mesurer des surfaces de follicule en images des échantillons témoins à 24 h d’intervalle et en Time-lapse échantillons d’imagerie (voir étape 6). En même temps, compter le nombre d’ovocytes ovulés dans chaque ovaire et choisir les conditions optimales d’imagerie Time-lapse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Capturer des images à des intervalles de 30 min à l’aide du système d’imagerie Time-lapse dans les conditions déterminées (tableau 1).</li>
</ol>6. analyse de la croissance folliculaire
<ol><li>
Pour analyser le développement du follicule, mesurer les surfaces de follicule dans les images capturées à l’aide de logiciels ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
	<ol>
<li>Au début, définissez l’échelle de l’image en cliquant sur « Définir échelle » sous « Analyze » dans la barre d’outils. Écrire les longueurs de côté de l’image capturée et les numéros correspondants de pixels dans les champs vides de « Distance connue » et « Distance en pixels », respectivement.</li>
		<li>Cliquez sur « Mains libres » dans la barre d’outils et précisent les follicules dans les images capturées champ lumineux.</li>
		<li>Cliquez sur « Mesure » sous « Analyze » dans la barre d’outils. Remarque : Si d’autres données de mesure sont souhaitées, cliquez sur « Set mesure » sous « Analyze » dans la barre d’outils et cochez les cases appropriées dans la liste.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. l’analyse du développement folliculaire à l’aide de souris transgéniques
<ol><li>Recueillir des ovaires de 0 et 4 (P0 et P4) femelles transgéniques contenant les transgènes Oog1pro3.9 et R26-H2B-mCherret la culture sur plaquettes comme décrit dans étapes 1.1 – 3.2, sauf ne pas jours tranche le P0 et ovaires P4.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture avec milieu frais, préchauffé dans les plats de 3,5 cm dans un incubateur contenant 5 % de CO2 à 37 ° C tous les 2 jours. Remarque : La concentration de LH dans le milieu de culture des ovaires P0 et P4 peut rester constante car les surtensions LH n’existent pas chez les souris P0 et P4.</li>
	<li>Régler le microscope de visualiser les follicules primaires à seulement AcGFP1-positifs dans les ovaires de P4 (tableau 1). Remarque : Les follicules primaires et seulement primordiales sont présents dans les ovaires de souris femelle P4.</li>
	<li>Capturer des images de la culture P0 Oog1pro3.9/ ovaires de souris transgéniquesR26-H2B-mCherry à des intervalles de 30 min en utilisant les paramètres utilisés pour les ovaires P4 (voir étape 5.2).</li>
	<li>Retracer et analyser le développement folliculaire à l’aide de signaux AcGFP1 et H2B-mCHerry.</li>
</ol>

<ol><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Palma, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biotechnology+of+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">Biology and biotechnology of follicle development.</a> Sci World J. , (2012).</li>
<li>Knight, P. G., Glister, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16885529">TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development.</a> Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).</li>
<li>Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19074213">The in vitro growth and maturation of follicles.</a> Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).</li>
<li>Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li>
<li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li>
<li>Komatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Effect+of+Leukemia+Inhibitory+Factor+on+Follicular+Growth+in+Cultured+Murine+Ovarian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue.</a> Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).</li>
<li>Komatsu, K., Masubuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration-dependent+effect+of+progesterone+on+follicle+growth+in+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary.</a> J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).</li>
<li>Murase, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+dynamics%3A+visualization+and+analysis+of+follicle+growth+and+maturation+using+murine+ovarian+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture.</a> J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).</li>
<li>Ishida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+oocyte-specific+gene%2C+Oog1%2C+functions+in+both+male+and+female+meiotic+germ+cells+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice.</a> PLoS One. 8 (7), 68686(2013).</li>
<li>Minami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesin+is+a+novel+mouse+protein+expressed+in+oocytes+and+early+cleavage-stage+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos.</a> Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+factor-9+stimulates+progression+of+early+primary+but+not+primordial+rat+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development.</a> Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+%28LIF%29+promotes+the+primordial+to+primary+follicle+transition+in+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries.</a> Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-4+acts+as+an+ovarian+follicle+survival+factor+and+promotes+primordial+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development.</a> Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit+ligand+and+basic+fibroblast+growth+factor+interactions+in+the+induction+of+ovarian+primordial+to+primary+follicle+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition.</a> Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+reporter+mouse+lines+at+ROSA26+locus+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+oocyte-specific+expression+of+Cre+recombinase+activity+in+GDF-9-iCre%2C+Zp3cre%2C+and+Msx2Cre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).</li>
<li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice%3A+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li>
<li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive%2C+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, nous avons développé deux nouvelles méthodes pour l’étude de développement folliculaire dans les ovaires de souris. La première méthode consiste en l’élevage des tissus en tranches ovarienne chez la souris adulte suivie d’analyses du développement folliculaire, et la seconde implique l’utilisation de Time-lapse d’imagerie afin de visualiser le développement folliculaire précoce pendant la phase de gonadotrophine indépendant. Auparavant, nous avons utilisé la méthode de culture de tissus ovaire présente ...

Ovaires de souris femelles contiennent plusieurs milliers de follicules1, et l’ovulation périodique mûrit environ dix ovocytes à chaque cycle oestrus. Follicules sont classées en plusieurs stades de développement : primordial, primaire, secondaire, antre et follicules de Graaf, selon la forme de la couche cellulaire de la granulosa entourant chaque ovocyte. La plupart des follicules primordiaux sont en dormance, et certains d'entre eux sont activent et se développer dans les follicules primaires à chaque cycle oestrus2. Après la phase folliculaire secondaire, le développement folliculaire est principalement régie par gonadotrophines, folliculaires stimulante (FSH) et l’hormone lutéinisante (LH). Cependant, développement du follicule primordial et primaire est indépendant de gonadotrophine et les mécanismes de régulation qui régissent ces étapes restent mal inderstood3,4,5. En plus de facteurs de croissance et les hormones, le follicule primordial et primaire est régi par les interactions entre les follicules6,7. Donc, nous avons effectué des analyses de la dynamique du follicule dans les tissus de souris ovaire et a étudié les mécanismes de régulation associés à l’aide de cultures de tissus ovariens8,9,10.
Ici, nous présentons deux méthodes de modèle de culture de tissu ovarien. Le premier est utilisé pour analyser le développement folliculaire par mesure des zones folliculaires, et le second est utilisé pour étudier le mécanisme de régulation au début du développement folliculaire de primordiale au stade de follicule secondaire avec des souris transgéniques. Pour l’analyse du développement folliculaire, nous avons utilisé principalement ovaires de souris femelles 4 - semaine vieux parce qu’ils permettent de faciliter la visualisation des follicules. Pour induire l’ovulation périodique et élaboration d’un modèle in vivo follicule, nous avons reproduit de LH et l’ovulation observée, l’atrésie folliculaire et la sécrétion d’estradiol dans des conditions de culture de tissus. Images des ovaires cultivées ont été capturés, et les processus de développement du follicule ont été analysées par des changements de traçage dans la région folliculaire. Toutefois, dans les analyses de champ lumineux de la microscopie, la distinction entre les follicules primaires primordiales et au début n’était pas claire. Ainsi, nous avons développé une méthode pour détecter les petits follicules et faire la distinction entre le primordial, principal, et follicule secondaire en culture des tissus ovariens à l’aide de Oogenesin1 pro3 (Oog1). 9 et les ovaires de souris transgéniques R26-H2B-mCherry 0 et 4 jours après la naissance,11. Oog1 expression est détectable dans les ovocytes après l’entrée en méiose et augmente progressivement avec le développement du follicule, permettant l’observation de la transition de primordial à follicules primaires en utilisant des images de Time-lapse du tissu de l’ovaire cultivées11 ,,12. Même si les méthodes morphologiques ont servi à étudier les facteurs qui activent des follicules primordiaux dormants13,14,15,16, développement physiologique de follicules dans les ovaires est difficile à observer, et les effets de divers facteurs restent indéterminés. Les méthodes actuelles de culture ont été conçus pour répondre à cette pénurie en temps réel des analyses de facteurs de la cible.
Dans la présente étude, nous avons suivi le développement folliculaire à l’aide d’une méthode d’imagerie Time-lapse et caractérisé le processus du développement folliculaire. Nos nouvelles méthodes offrent un outil sans précédent pour l’étude de la physiologie des ovaires.

<table><tbody><tr><td>Hormone folliculostimulante de l’hypophyse humaine</td><td>SIGMA</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Hormone luténisante de l’hypophyse équine</td><td>SIGMA</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>MEM a, GlutaMax, sans nucléotides</td><td>Thermo Fisher</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond de verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Plat de 35 mm, lamelle n° 0, diamètre du verre de 10 mm</td></tr><tr><td>Insert de culture cellulaire Millicell</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>Diamètre : 315 mm, taille des pores : 0,4 mm, matériau : PTTE hydrophile</td></tr><tr><td>3,5 cm Plats de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>50ml / Tube à centrifuger avec capuchon d’étanchéité triple</td><td>IWAKI</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>Lames jetables à profil bas 819</td><td>Leica</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Microscope confocal</td></tr><tr><td>CellVoyager, CV1000</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td></td><td>Imagerie en accéléré</td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>KEYENCE</td><td></td><td>Imagerie en accéléré</td></tr></tbody></table>

culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Chez les mammifères femelles ovulent périodiquement un nombre d’ovocytes presque constant au cours de chaque cycle oestrus. Pour soutenir cette régularité et la périodicité, la régulation se fait au niveau de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et sur le développement de follicules dans l’ovaire. Malgré des études actives, les mécanismes de développement folliculaire ne sont pas claires, en raison des plusieurs étapes de l’activation de dormance follicule primordial à l’ovulation et la complexité de la réglementation qui diffère à chaque phase folliculaire. Afin d’étudier les mécanismes de développement folliculaire et la dynamique des follicules au cours du cycle oestral, nous avons développé un modèle de culture de tissus ovariens de souris qui peut être utilisé pour observer le développement folliculaire à l’aide d’un microscope. Développement systématique de follicule, l’ovulation périodique et l’atrésie folliculaire peuvent être reproduits dans le modèle de l’ovaire cultivées, et les conditions de culture peuvent être modulées de façon expérimentale. Ici, nous démontrons l’utilité de cette méthode dans l’étude des mécanismes de régulation du développement folliculaire et d’autres phénomènes ovariennes.

La figure 1 montre le protocole pour les changements dans les médias au cours de la culture de tissus ovarienne. Suite à ce programme, les ovaires de souris ICR 4 semaines ont été cultivés et imagé à intervalles de 24 h à l’aide de la microscopie confocale (Figure 2). Au cours de la culture de tissus de l’ovaire pendant 3 semaines, plus de follicules antrums et secondaires ont dégénéré de l’atrésie folliculaire et certains étaien...

Les cultures de tissus ovariens peuvent être utilisés comme modèles de l’atrésie folliculaire développement, ovulation et follicule et indiquer les mécanismes de régulation de processus ovariens dynamiques.

Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les ovaires concernant le développement des follicules, l’atrésie des follicules et le fonctionnement. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons reproduire les phénomènes ovariens dans des conditions de culture contrôlées pour l’observation en temps réel. Pour préparer les ovaires d’une souris de l’Institut de recherche sur le cancer âgée de quatre semaines pour la culture : Utilisez des ciseaux et une pince à épiler pour couper le tissu environnant des ovaires sous un stéréomicroscope et placez les ovaires nettoyés dans une boîte de milieu de culture frais.Lorsque tous les ovaires ont été coupés, transférez les ovaires individuels sur un morceau de papier filtre humidifié avec 37 degrés Celsius PBS et utilisez une lame de microtome pour couper chaque ovaire en quatre morceaux. Transférez les tranches dans une boîte de 3,5 centimètres de milieu de culture à 37 degrés Celsius et utilisez une micropipette pour ajouter une gouttelette d’environ 0,5 micromètre de milieu de culture sur un insert de culture cellulaire par section de tissu ovarien. Dans une deuxième boîte de culture cellulaire à fond de verre de 3,5 centimètres contenant un millimètre de milieu :À l’aide d’une pince à épiler, transférez un échantillon de tissu dans chaque gouttelette et placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire.Remplacez le surnageant dans la boîte par un milieu de culture frais à 37 degrés Celsius tous les deux jours et traitez les ovaires avec 100 milliunités par millilitre de FSH et de LH pendant 12 heures tous les quatre jours. Commencer l’imagerie des ovaires cultivés toutes les 24 heures après une journée de culture pour permettre une croissance suffisante des follicules entre les séances d’imagerie ; Capturer des images à des intervalles de 30 minutes à l’aide d’un système d’imagerie time-lapse dans des conditions expérimentales appropriées. Pour analyser le développement du follicule ovarien :Ouvrez les images dans ImageJ et ouvrez le menu d’analyse pour sélectionner définir l’échelle.Entrez les longueurs latérales des images capturées et le nombre correspondant de pixels dans les champs Distance connue et Distance en pixels, respectivement. Ensuite, utilisez l’outil à main levée pour délimiter les follicules et cliquez sur mesurer. Au cours d’une période de culture de coupe de tissu ovarien de trois semaines, la plupart des follicules antraux et secondaires sont dégénérés par l’atrésie des follicules, et certains sont ovulés.Certains follicules se développent en groupes au cours de chaque cycle de poussée de LH. Bien que le moment de l’ovulation et le nombre d’ovocytes ovulés diffèrent entre les ovaires de souris, l’ovulation à partir d’ovaires en culture se produit principalement dans les 48 heures suivant chaque poussée de LH. Notez que tous les ovocytes ovulés ne libèrent pas les premiers globules polaires après l’ovulation.Les follicules primordiaux et primaires sont présents simultanément dans les ovaires de souris du quatrième jour postnatal. Alors que seuls les follicules primordiaux sont présents dans les ovaires postnatals du jour zéro. Cependant, les follicules primaires deviennent détectables dans les ovaires postnatals en culture après 30 à 40 heures de culture, comme démontré.Les follicules primordiaux et primaires peuvent également être distingués dans les ovaires cultivés isolés d’animaux transgéniques mCherry par les noyaux positifs mCherry des cellules de la granulosa ; permettant le suivi des stades folliculaires dans les cultures de tranches d’ovaires. J’espère que cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la technologie de la reproduction pour explorer de nouvelles techniques de traitement de la fertilité.

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Developmental Biology

Biologie du développement

Culture de cellules normales dans leurs trois dimensions contexte représente une méthode alternative pour étudier les événements précoces nécessaires pour la transformation cellulaire et la tumorigenèse. Cette méthode est utilisée pour cultiver des cellules ovariennes normales et l'oviducte pour étudier les événements précoces de la formation de cancer de l'ovaire.

Les hydrogels d&#39;alginate de culture d&#39;organe en trois dimensions des ovaires et des trompes

Ce protocole décrit la culture primaire / co-culture de tissu ovarien de la souris, en utilisant des ovaires de souris nouveau-nées et des follicules ovariens provenant de souris individuelles prépubères. Les techniques de culture de soutenir le développement d'une manière hautement physiologique, ce qui permet étude de l'effet d'agents extrinsèques sur l'ovaire, et des interactions entre les follicules ovariens.

Culture et co-culture de souris ovaires et follicules ovariens

Nous présentons ici un protocole visant à quantifier les follicules dans les ovaires de jeunes souris sans sectionnement serial. Selon immunofluorescence de la totalité de l’organe et de tissus de compensation, sectionnant physique est remplacé par sectionnement optique. Cette méthode de préparation des échantillons et visualisation maintient l’intégrité de l’organe et facilite la quantification automatique des cellules spécifiques.

Toute monture Immunofluorescence et Quantification de follicule de souris cultivées ovaires

La culture in vitro du cortex ovarien bovin et l’effet du régime nutritionnel Stair-step sur le microenvironnement ovarien sont présentés. Des morceaux de cortex ovarien ont été cultivés pendant sept jours et les stéroïdes, les cytokines et les stades folliculaires ont été évalués. Le traitement diététique Stair-Step avait une augmentation de la stéroïdogenèse entraînant une progression des follicules en culture.

Culture de tissu du cortex ovarien bovin

Nous présentons ici un protocole optimisé pour l’imagerie d’ovaires entiers pour des analyses quantitatives et qualitatives utilisant l’immunocoloration à montage entier, la microscopie multiphotonique et la visualisation et l’analyse 3D. Ce protocole prend en charge un traitement à haut débit, fiable et reproductible applicable à la toxicologie, au diagnostic clinique et aux tests génomiques de la fonction ovarienne.

Immunofluorescence, clairance et microscopie multiphotonique des ovaires entiers pour l’analyse 3D quantitative de la réserve ovarienne en développement chez la souris

Nous décrivons des méthodes pour isoler les cellules somatiques ovariennes de souris à partir d’une fraction enrichie en strome de l’ovaire et pour générer des organoïdes somatiques ovariens de souris en utilisant une approche sans échafaudage.

Sonder le microenvironnement ovarien : méthodes d’isolement, culture 2D et culture organoïde des cellules somatiques ovariennes de souris

Nous présentons ici un protocole fournissant un outil pour examiner les mécanismes de régulation de gènes spécifiques au cours du développement de l’hippocampe. L’utilisation de l’électroporation ex utero et de la culture de coupes organotypiques permet la régulation à la hausse et à la baisse de l’expression des gènes d’intérêt dans les cellules individuelles et suit leur destin au cours du développement.

Ex Utero L&#39;électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue

L'objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d'acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.

Déficitaires et approche Gain de fonction d&#39;enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

Ce travail démontre une approche novatrice pour évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation des vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) par une transplantation de graisse mammaire, suivie d'une préparation tissulaire complète pour l'observation microscopique. Une stratégie de traçage de lignage pour étudier le comportement des VESC in vivo est également présentée.

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

Ici, nous présentons un protocole pour l'imagerie en direct de la fusion palatine secondaire de souris à l'aide d'une microscopie confocale. Ce protocole peut être utilisé en combinaison avec une variété de lignes de souris rapporteurs fluorescentes et avec des inhibiteurs de voie pour une vision mécaniste. Ce protocole peut être adapté pour l'imagerie en direct dans d'autres systèmes de développement.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

Découvrez la culture de tissus ovariens pour étudier le développement folliculaire et l'atresie chez la souris. Cette méthode permet l'observation en temps réel des phénomènes ovariens dans des conditions contrôlées.

Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris

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