Name: Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Découvrez la génération d'organoides rétiniens et d'épithélium pigmentaire à partir de cellules iPS humaines. Cette méthode simplifie la différenciation directe et facilite les recherches en thérapies cellulaires pour les maladies rétiniennes.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres de l’équipe de Goureau pour leur contribution au cours de la mise en place des méthodes décrites ici et G. Gagliardi et M. Garita pour leur lecture critique. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’ANR (GPiPS : ANR-2010-RFCS005 ; SightREPAIR : ANR-16-CE17-008-02), l’Association de Retina France et la transfert de technologie société SATT Lutech. Il a également été effectuée dans le cadre de la LIFESENSES LABEX (ANR-10-LABX-65), soutenu par l’ANR dans le programme d’Investissements d’avenir (ANR-11-IDEX-0004-02).

Le protocole décrit dans le présent document suit les directives du Comité d’éthique de l’Institut de la Vision recherche. L’Institut de la Vision a été autorisée à la manipulation de l’échantillon humain selon le règlement Français actuel. Spécimen de manutention suit la protection des données des patients selon les principes d’Helsinki et des réglementations nationales après l’approbation éthique du « Comité de Protection des Personnes (CPP) Ile-de-France V ».
1. préparation des milieux de Culture et de la vaisselle
<ol><li>
Milieux de culture
	<ol>
<li>Utilisez iPSC moyenne, un milieu chimiquement défini, dédié à la culture de cellules souches pluripotentes dans des conditions sans chargeur16. Préparer 500 mL de milieu selon le protocole du fabricant.</li>
		<li>Moyen d’utilisation de basale iPSC (Bi), l’iPSC chimiquement défini moyen sans facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2) ou facteur de croissance transformant bêta (TGFβ).</li>
		<li>Préparer 500 mL de milieu Bi supplémenté avec supplément de 1 % de N2 (BiN2 moyen), 10 unités/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine.</li>
		<li>Préparer 500 mL de milieu des Control de base N2 (moyenne ProN2) composé de mélange de DMEM:Nutrient F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), 1 % MEM des acides aminés non essentiels, Supplément 1 % N2, 10 unités/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine.</li>
		<li>Préparer Control axée sur la B27 moyen (moyenne ProB27) composé de mélange de DMEM:Nutrient F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), 1 % MEM des acides aminés non essentiels, Supplément de 2 % B27, 10 unités/mL de pénicilline et de 10 mg/mL de streptomycine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de bateau de la culture
	<ol>
<li>
Pour la culture humaine iPSC
		<ol>
<li>Préparer 10 mL d’une solution de vitronectine contenant 5 μg/mL de vitronectine dans 1 x PBS. Dans 10 mL de PBS 1 x, ajouter 100 µL de la solution mère de vitronectine décongelés (100 x).</li>
			<li>Distribuer 2 mL de la solution de la vitronectine par Petri 6 cm correspondant à 0,5 µg/cm2. Il incuber pendant 1 heure à température ambiante (RT). Enlever la solution de la vitronectine par aspiration à l’aide d’un système d’aspiration sous vide ou une pipette de 5 mL.</li>
			<li>Ajouter 4 mL de milieu d’iPSC par plat de 6 cm.</li>
			<li>Incuber les plats dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant au moins 30 min avant utilisation.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour iPSC dérivé humaine culture cellulaire pre (hiRPE)</li>
		<li>Utilisez une matrice de qualifié par cellules souches pluripotentes ou substrat pour enrober les puits selon le protocole du fabricant. Ajouter suffisamment de matrice ou de substrat pour couvrir la surface entière de croissance. Par exemple, mettre 300 µL de matrice / puits en plaque 24 puits et 3 mL de matrice dans une fiole de2 cm T-25.</li>
		<li>Incuber les récipients de culture couché pendant au moins 1 h à 37 ° C. Enlever la matrice à l’aide de systèmes d’aspiration-aspiration ou une pipette de 5 mL.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de milieu ProN2 / puits sur plaques 24 puits et remettez le récipient de culture dans l’incubateur pendant au moins 30 min pour chauffer et pour équilibrer le milieu. Pour ballons de T-25 cm2 , reportez-vous à l’étape 5.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. le maintien et Expansion of Human CISP
<ol><li>
Entretien du CISP humaine
	<ol>
<li>Préparer 3 mL de milieu d’iPSC dans un tube de 15 mL et gardez-le à ta pendant au moins 15 min avant utilisation. Préparer un plat de 6 cm enduit tel que décrit à la section 1.2.1.</li>
		<li>Décongeler un échantillon cryogénique de CISP humaine d’un réservoir d’azote liquide ou d’un congélateur à-150 ° C par une incubation dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 s.</li>
		<li>Soigneusement désinfecter la cuvette cryogénique à l’aide d’un spray désinfectant. Transférez le cryotube le CISP humaine décongelés dans le tube de 15 mL contenant 3 mL de milieu d’iPSC préchauffée à température ambiante.</li>
		<li>Centrifuger le tube à 110 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant par aspiration à l’aide d’un système d’aspiration sous vide ou une pipette de 5 mL.</li>
		<li>Resuspendre le culot cellulaire avec 1 mL de milieu iPSC d’un plat enduit de vitronectine la culture de 6 cm à l’aide d’une pipette de 2 mL et transférer les cellules vers le plat. Retourner le plat dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant au moins 24h avant de changer le support. Remarque : Un inhibiteur de la roche, comme Y-27632 à 10 µM, peut être ajouté au milieu iPSC dans les récipients de culture de 6 cm pour réduire l’apoptose.</li>
		<li>Changer le support de tous les jours et passez la CISP humaine chaque semaine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passage des humains CISP
	<ol>
<li>Passez l’iPSC humain à une confluence de 70 à 80 %, classiquement après 7 jours de culture.</li>
		<li>Préparer des plats de 6 cm pour le passage comme indiqué au point 1.2.1. Enlever le support de l’iPSC de la vaisselle avec le CISP confluentes et ajouter 2 mL d’une solution de dissociation pendant 6 min à température ambiante. Remarque : Le temps d’incubation dépend des clones de l’iPSC. Essayez une incubation de 6 min dans un premier temps.</li>
		<li>Enlever la solution de dissociation à l’aide de systèmes d’aspiration-aspiration ou une pipette de 5 mL et ajouter 2 mL de milieu de l’iPSC préchauffée à RT. remettre en suspension les colonies iPSC en pipettant également leur haut et bas de 5-10 x avec une pipette 1 000 µL. ATTENTION : Éviter la dissociation cellulaire unique de pipetage excessive.</li>
		<li>Transférer 30 à 200 µL d’amas de cellules resuspendues dans une autre boite de culture de 6 cm. Remettez les boîtes dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant au moins 24h avant de changer le support. Remarque : Le volume des amas de cellules resuspendues nécessaires pour le passage dépend des clones de l’iPSC.</li>
		<li>Changer le support de tous les jours et passez la CISP humaine chaque semaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. génération d’organoïdes rétinienne
<ol><li>Commencer la différenciation de l’iPSC suivant le protocole schématisé à la Figure 1 a , quand les colonies atteignent une confluence de 60 à 70 % (Figure 1 b).</li>
	<li>Préparer 4 mL de milieu de Bi par plat de 6 cm. Chauffer le milieu Bi à 37 ° C. Changer le support de l’iPSC au milieu de la Bi. Notez cette fois comme jour 0 (D0).</li>
	<li>À D2, basculez les cultures dans le milieu Bi vers un milieu BiN2, préalablement chauffé à 37 ° C. Changer le milieu tous les 2-3 jours.</li>
	<li>Identifier émergente organoïdes rétinienne auto-formation neuroépithélium buds, comme illustré à la Figure 1 -1E. Remarque : Ces premiers organoïdes rétiniennes, correspondant à leur stade de développement de la cupule optique, peuvent être manuellement isolés d’expérimentation en aval.</li>
</ol>4. maturation des organoïdes rétinienne
<ol><li>D28, préparer les plaques 6 puits contenant 4 mL/puits de ProB27 additionné au départ de FGF2 10 ng/mL (Figure 1 a). NOTE : Ajouter FGF2, juste avant que les médias sont ajouté aux plaques. ATTENTION : Ne pas filtrer FGF2.</li>
	<li>Récupérer manuellement les structures rétiniennes de la vaisselle de 6 cm. Pour ce faire, isoler les structures faisant des stries perpendiculaires avec l’aiguille autour du bourgeon neuroépithéliales, comme sur la Figure 1Eet détacher l’organoïdes en les grattant délicatement avec l’aiguille.</li>
	<li>Aspirer les 10-15 organoïdes à l’aide d’une pipette µL 1 000 et de les transférer dans un seul puits de la plaque 6 puits contenant le support ProB27.</li>
	<li>Garder l’organoïdes rétinienne dans des conditions de culture flottante dans un milieu ProB27 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2. La moitié du milieu de changer tous les 2-3 jours. Remarque : Considérer l’organoïdes avec FGF2 jusqu’en D35.</li>
	<li>À D35, retirer la moitié de la moyenne et ajouter un milieu frais ProB27 préchauffée à 37 ° C sans FGF2.</li>
	<li>La moitié du milieu de changer tous les 2-3 jours pendant le temps nécessaire pour obtenir les types de cellules rétiniennes désiré selon l’émergence des types de cellules rétiniennes, comme illustré à la Figure 2.</li>
</ol>5. génération et Amplification of Human iPSC dérivés des cellules RPE (hiRPE)
<ol><li>
Génération de cellules humaines hiRPE
	<ol>
<li>Engager la CISP dans la différenciation, quand les colonies atteignent une confluence de 60 à 70 %, suivant le protocole schématisé à la Figure 3 a.</li>
		<li>Préparer 4 mL par 6 cm plat de support Bi et réchauffer le milieu Bi à 37 ° C. Changer le support de l’iPSC au milieu de la Bi. Notez cette fois comme jour 0 (D0).</li>
		<li>À D2, basculez les cultures dans le milieu Bi vers un milieu BiN2 préalablement chauffé à 37 ° C. Changer le milieu tous les 2-3 jours.</li>
		<li>À J28, changer le milieu un milieu ProN2 frais, préalablement chauffé à 37 ° C, comme illustré à la Figure 3 a. Remarque : Cette étape peut être faite après la cueillette organoïde décrite à l’étape 4.</li>
		<li>Changer le support de ProN2 tous les 2-3 jours.</li>
		<li>À D42, identifier les cellules hiRPE émergents par l’observation des taches pigmentées comme illustré à la Figure 3 b. Remarque : La pigmentation des cellules hiRPE apparaît entre D35 à D56 selon les clones de l’iPSC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplification des cellules hiRPE
	<ol>
<li>D42, préparer une plaque 24 puits préalablement revêtu avec la matrice comme indiqué au point 1.2.2 et contenant 1 mL de milieu ProN2 par puits. Placer la plaque pendant 15 minutes dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 avant utilisation.</li>
		<li>Récupérer manuellement les correctifs hiRPE du plat 6 cm. Pour isoler les taches, faire une striation perpendiculaire avec l’aiguille autour de l’épithélium pigmenté et détacher la feuille en grattant doucement il avec l’aiguille. Aspirer 10 taches pigmentées à l’aide d’une pipette µL 1 000 et de les transférer dans un seul puits de la plaque 24 puits.</li>
		<li>Gardez les patchs hiRPE en milieu ProN2 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 48 h avant de changer le support. Notez ce passage de cellule hiRPE 0 (hiRPEp0). Changer le milieu tous les 2-3 jours avec ProN2 moyen.</li>
		<li>Passez les cellules hiRPEp0 lorsque les cellules sont confluentes.<ol>
<li>Enlever le support à l’aide de systèmes d’aspiration-aspiration et laver chaque bien 1 x 1 ml de PBS à l’aide d’une pipette de 5 mL.</li>
			<li>Jetez les PBS à l’aide de systèmes d’aspiration sous vide, ajouter 200 µL / puits de 0,25 % de trypsine et il incuber pendant au moins 15 min dans un incubateur à 37 ° C. Ajouter 800 µL de milieu ProB27 pour inactiver la trypsine. Remarque : L’utilisation de ProN2 moyen d’arrêter l’activité de la trypsine n’est pas recommandée.</li>
			<li>Dissocier la feuille de hiRPE cellules de pipetage il monte et descend. Placer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et il Centrifuger pendant 5 min à 110 x g. Remarque : Un lavage supplémentaire peut être fait avec ProN2 moyen pour enlever l’excès de ProB27 moyen.</li>
			<li>Retirez le surnageant et doucement Resuspendre le culot dans 2 mL de milieu de ProN2 préchauffée à 37 ° C. Compter les cellules avec un compteur de cellules.</li>
			<li>Prendre de 1,25 millions de cellules et les placer dans une fiole de2 matrice-enduit T-25 cm (Voir l’étape 2.2.2) contenant 5 mL de milieu de ProN2 préchauffée à 37 ° C. Notez ce passage de cellule hiRPE 1 (hiRPEp1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Garder les cellules hiRPE dans le milieu de ProN2 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 48 h avant de changer le support.</li>
		<li>Modifier les médias tous les 2-3 jours. Lorsque les cellules de hiRPEp1 atteint le confluent, effectuer le prochain passage ou cryoconservation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. cryopreservation of Retinal organoïdes et hiRPE cellules
<ol><li>
Pour organoïdes ensemble rétinienne
	<ol>
<li>Sélectionnez 5 à 20 organoïdes rétiniennes à l’aide d’une pipette de transfert et les placer dans une fiole cryogénique. Enlever tout excès du milieu avec une pipette 1 000 µL sans toucher l’organoïdes au fond du tube et ajouter 250 µL de milieu de cryoconservation froid (voir Table des matières).</li>
		<li>Geler les flacons dans un récipient froid axée sur l’isopropanol à-80 ° C pendant au moins 4 h. transfert les flacons congelés à un congélateur de-150 ° C ou un réservoir d’azote liquide pour le stockage à long terme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pour les cellules de hiRPE
	<ol>
<li>Au passage 1, se dissocient les cellules hiRPE lorsque les cellules sont confluentes. Remarque : Il est déconseillée d’une cryoconservation des cellules hiRPEp0.</li>
		<li>Aspirer le milieu du flacon de2 cm de T-25 à l’aide de systèmes d’aspiration-aspiration et lavez-le 1 x avec 3 mL de PBS à l’aide d’une pipette de 5 mL.</li>
		<li>Supprimer les PBS à l’aide de systèmes d’aspiration sous vide, ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine et il incuber pendant au moins 15 min dans un incubateur à 37 ° C. Ajouter 5 mL de ProB27 moyen d’arrêter l’activité de la trypsine. Remarque : L’utilisation du milieu ProN2 pour inactiver la trypsine n’est pas recommandée.</li>
		<li>Dissocier la feuille de hiRPE cellules de pipetage il et descendre à l’aide d’une pipette 10 mL. Compter les cellules avec compteur de cellules. Placer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et il Centrifuger pendant 5 min à 110 x g. Remarque : Un lavage supplémentaire peut être effectué avec ProN2 moyen pour enlever l’excès de ProB27 moyen.</li>
		<li>Aspirer le surnageant à l’aide d’aspiration-aspiration et doucement remettre en suspension les cellules pour obtenir 2 millions de cellules en 250 µL de milieu de cryoconservation.</li>
		<li>Transférer 250 µL de suspension cellulaire par flacon cryogénique. Geler les flacons dans un conteneur congélation axée sur l’isopropanol à-80 ° C pendant au moins 4 h.</li>
		<li>Transférer les flacons congelés dans un congélateur à-150 ° C ou un réservoir d’azote liquide pour le stockage à long terme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. dégel du rétinal organoïdes et hiRPE cellules
<ol><li>
Dégel du organoïdes ensemble rétinienne
	<ol>
<li>Moyen de ProB27 chaud à 37 ° C (2 mL seront exigé pour chaque flacon cryogénique).</li>
		<li>Dans le réservoir d’azote liquide ou le congélateur-150 ° C, décongeler un flacon cryogénique contenant organoïdes rétinienne dans un bain-marie à 37 ° C pour 30 s. désinfecter la cuvette cryogénique soigneusement à l’aide d’un spray désinfectant.</li>
		<li>Ouvrir le flacon et ajouter 1 mL de milieu de ProB27 préchauffé. Transférer l’organoïdes dans un tube de 1,5 mL avec une pipette de transfert.</li>
		<li>Enlever doucement le support en pipettant également, il sans toucher les structures rétiniennes au fond du tube. Laver l’organoïdes 1 fois de plus avec 1 mL du milieu ProB27 préchauffé.</li>
		<li>Aspirer l’organoïdes avec une pipette de transfert et les placer dans 1 bien sur une plaque de 6 puits contenant le support ProB27 préchauffée et équilibrées dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2. Remarque : Placez 10-15 organoïdes rétiniennes / puits d’une plaque de 6 puits.</li>
		<li>La moitié du milieu de changer tous les 2-3 jours pendant le temps nécessaire pour obtenir les types de cellules rétiniennes désiré selon leur émergence, comme décrit à la Figure 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Décongélation des cellules hiRPE
	<ol>
<li>Moyen de ProN2 chaud à 37 ° C (8 mL seront exigé pour chaque flacon cryogénique).</li>
		<li>Dans le réservoir d’azote liquide ou le congélateur-150 ° C, décongeler un échantillon cryogénique de cellules hiRPEp1 par une incubation dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 s. désinfecter le flacon cryogénique soigneusement à l’aide de pulvérisation de la solution désinfectante.</li>
		<li>Ouvrir le tube et ajouter 1 mL de milieu de ProN2 préchauffé et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de préchauffé ProN2 milieu. Il Centrifuger pendant 5 min à 110 x g.</li>
		<li>Retirez le surnageant et doucement Resuspendre le culot dans 2 mL de milieu de ProN2 préchauffée à 37 ° C.</li>
		<li>Compter les cellules avec un compteur de cellules.</li>
		<li>Prendre de 1,25 millions de cellules et les placer dans le ballon de2 cm enduit de matrice des T-25 (Voir l’étape 2.2.2) contenant 5 mL de milieu de ProN2 préchauffée à 37 ° C. À ce stade, notez au passage que 2 (hiRPEp2).</li>
		<li>Garder les cellules hiRPEp2 en milieu ProN2 dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 48 h avant de changer le support.</li>
		<li>Modifier les médias tous les 2-3 jours. Lorsque les cellules de hiRPE atteint le confluent, effectuer le prochain passage ou cryoconservation. Remarque : Après 2 semaines de culture, 8 millions de cellules hiRPE peuvent être collectées pour les autres expérimentations.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).</li>
<li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li>
<li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li>
<li>Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibition+extends+passage+of+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).</li>
</ol>

Sacha Reichman, Olivier Goureau et José-Alain Sahel sont inventeurs sur en attente de brevets liés à la génération des cellules rétiniennes de cellules souches pluripotentes humaines.

Ce protocole décrit comment produire des cellules RPE et organoïdes rétinienne, contenant les CGR rétiniennes et photorécepteurs, de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de xeno-gratuit et sans chargeur. Compatible avec le processus de bonnes pratiques de fabrication (BPF), la méthode cultivé présenté ici permet une grande production de cellules rétiniennes dérivées iPSC comme cellules RPE, CGR et photorécepteurs pour le développement de thérapies à base de cellules souches et de la drogue découver...

La rétine fait partie intégrante du système nerveux central (CNS) et a une capacité limitée à se régénérer spontanément suite à un traumatisme ou de maladies. Par conséquent, les pathologies dégénératives entraînant la perte de cellules rétiniennes définitives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la rétinite pigmentaire (RP), glaucome et la rétinopathie diabétique, typiquement entraîner une cécité irréversible. Sauver la rétine dégénérée est un enjeu majeur pour lequel des thérapies à base de cellules souches visant à remplacer les cellules endommagées ou perdues sont l’une des plus prometteuses approches1,2,3. Cellules souches pluripotentes comme les cellules souches embryonnaires (CSE) cellules ou les cellules souches pluripotentes humaines (CISP) ont la capacité d’étendre indéfiniment en culture, et ils ont le potentiel de produire tous les types de cellules. Progrès dans notre compréhension du développement rétinienne et l’amélioration de in vitro protocoles pour iPSC humaine différenciation ont donné lieu à la génération de rétine organoïdes7,8,9, 10,11,12. Toutes les cellules rétiniennes majeurs, y compris les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) et photorécepteurs rétiniens cellules épithéliales pigmentées (RPE), ont été correctement différenciés des humains ESCs et CISP4,5, 6. basé sur la méthode SFEB (culture sans sérum des agrégats de type corps embryoïdes) développée par Eiraku et al. 13, autoformation d’organoïdes rétiniennes peut être obtenue de dérivés ESC ou iPSC embryoïdes corps-comme agrégats dans la matrice extracellulaire définis composants7,10,14. Mais ces protocoles sont complexes, nécessitant un grand nombre d’étapes n’est pas toujours compatibles avec la grande production de cellules pour les approches thérapeutiques ou de dépistage des drogues. Ainsi, le choix de la méthode pour produire des cellules de la rétine humaines est critique et la méthode doit être robuste, évolutive et efficace.
Basé sur notre précédente publication15, nous décrivons ici chaque étape pour une génération simple et efficace des cellules rétiniennes par autoformation organoïde rétinienne d’adhérents CISP humaine cultivée dans une condition de xeno-sans et sans chargeur. À partir de cultures systématiques des adhérents CISP humaine, ce protocole requiert uniquement un milieu simple successive changer pour permettre la génération de cellules iPS RPE (hiRPE) et des structures neuroretinal en 4 semaines. Après un isolement manuel, hiRPE peut être développé et les structures rétiniennes peuvent être cultivées comme flottant organoïdes où les cellules souches rétiniennes sont capables de se différencier en tous types de cellules rétiniennes dans un ordre séquentiel compatible avec l’homme en vivo retinogenesis. Enfin, pour la promotion de la recherche ou la traduction clinique, nous décrivons une méthode de cryoconservation permettant le stockage à long terme d’ensemble rétinienne organoïdes et hiRPE cellules sans affecter leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnalités.

<table><tbody><tr><td>Vitronectine (VTN-N) Protéine humaine recombinante, tronquée</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14700</td><td>Revêtement</td></tr><tr><td>CTS Vitronectine (VTN-N) Protéine humaine recombinante, tronquée</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A27940</td><td>Revêtement</td></tr><tr><td>Essential 8 ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>A1517001</td><td>medium</td></tr><tr><td>Essential 6 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1516401</td><td>moyen</td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplément</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1370701</td><td>supplément CTS</td></tr><tr><td>N-2 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td>supplément</td></tr><tr><td>B-27 Supplément (50X), sans sérum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>supplément CTS B-27 Supplement, XenoFree</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td>supplément CTS</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320074</td><td>moyen</td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td>supplément</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>antibiotique</td></tr><tr><td>CellStart CTS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1014201</td><td>Matrix CTS</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualifié, prêt à l’emploi, à facteur de croissance réduit Matrice à membrane basale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1569601</td><td>Matrix</td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire douce</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Solution de dissociation</td></tr><tr><td>Cryostem Freezing Media</td><td>clinisciences</td><td>05-710-1D</td><td>Milieu de cryoconservation</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2)</td><td>Preprotech</td><td>100-18B</td><td>FGF2</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2) sans animaux</td><td>Preprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>FGF2 Aiguille AGANI sans Xeno</td></tr><tr><td>23G</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille Flacon 25 cm&sup2 ; Falcon traité pour culture tissulaire</td><td></td><td>353109</td><td>T-25 cm&sup2 ;</td></tr><tr><td>Plaque 24 puits Plaque traitée pour culture tissulaire</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>Plaque 24 puits</td></tr><tr><td>Plaque 6 puits Plaque traitée pour culture tissulaire</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Plaque 6 puits</td></tr></tbody></table>

xeno-libre défini et exempte d’engraissement des conditions de culture pour les modèles de cellule rétinienne generation of human dérivés ipsc

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

La production de cellules spécialisées de cellules souches pluripotentes fournit un outil puissant pour développer de nouvelles approches pour la médecine régénérative. L’utilisation des cellules souches pluripotentes humaines (CISP) est particulièrement intéressante pour des études de maladies neurodégénératives, y compris les dystrophies rétiniennes, où les modèles de cellules rétiniennes dérivées iPSC marquent une avancée majeure pour comprendre et lutter contre la cécité. Dans cet article, nous décrivons un protocole simple et évolutif pour générer, mature et cryoconservé organoïdes rétinienne. Basé sur l’évolution des moyennes, le principal avantage de cette méthode est d’éviter de multiples et fastidieuses étapes généralement exigés dans une différenciation guidée du CISP. Imitant les phases précoces de développement rétinienne par modifications successives des milieux définis sur des cultures de l’iPSC humaine adhérentes, ce protocole permet la production simultanée de former des structures neuroretinal et rétine pigmentées cellules épithéliales (RPE) dans un manière efficace et reproductible en 4 semaines. Ces structures contenant des cellules souches rétiniennes (RPC) peuvent être facilement isolés pour davantage de maturation dans un état de culture flottante permettant la différenciation des appels de procédure distante dans les sept types de cellules rétiniennes présents dans la rétine humaine adulte. En outre, les auteurs décrivent des méthodes rapides pour la cryoconservation d’organoïdes rétinienne et cellules RPE pour le stockage à long terme. Combinés ensemble, les méthodes décrites ici seront utiles pour produire et bancaires dérivés iPSC rétiniens cellules ou tissus humains pour la recherche fondamentale et clinique.

La première étape de différenciation iPSC humaine cultivée dans des conditions sans chargeur16 est de fermer l’auto-renouvellement machines utilisant le milieu Bi pour encourager une différenciation spontanée (Figure 1 a). Puis, à la D2, le milieu Bi est complété avec un supplément de N2 pour orienter la différenciation CISP cellules vers les lignées nerveuses et rétiniennes. Ce processus entraîne l’apparition des bourgeons neuroretina...

La production de cellules spécialisées de la rétine de cellules souches pluripotentes est un tournant dans le développement de la thérapie à base de cellules souches pour les maladies de la rétine. Le présent document décrit une méthode simple pour une génération efficace d’organoïdes rétinienne et l’épithélium pigmentaire rétinien pour la recherche fondamentale, translationnelle et clinique.

Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions concernant la différenciation des cellules souches pluripotentes dans le domaine rétinien, telles que la génération de différents types de cellules rétiniennes à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme ou de cellules iPS. Le principal avantage de cette technique est que la cellule iPS humaine adhérente peut être directement utilisée pour la génération d’organoïdes rétiniens en ne faisant passer l’embryoïde à la formation que par changement successif de milieu de culture. L’ingénieure de laboratoire Amélie Slembrouck-Brec fera la démonstration de la méthode de génération et d’isolement des organoïdes rétiniens, et l’ingénieure de laboratoire Céline Nanteau fera la démonstration de la stratégie de production de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes ou EPR.Commencer la différenciation des cellules iPS en suivant ce schéma, que l’on peut trouver dans le protocole texte lorsque les colonies atteignent 60 à 70 % de confluence. Préparez quatre millilitres de milieu iPS basal par plat de six centimètres et réchauffez le milieu à 37 degrés Celsius. Ensuite, remplacez le milieu cellulaire iPS par le milieu iPS b

defined-xeno-free-feeder-free-culture-conditions-for-generation-human

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Le protocole suivant fournit des instructions pour l'adaptation humaine souches pluripotentes induites (iPS) à la desserte de culture sans l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum moyennes (KSR-FF). Une fois adaptée, des instructions pour l'entretien continu sont également fournis.

Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

Xenopus laevis fournit un système modèle idéal pour étudier la spécification du destin cellulaire et la fonction physiologique des différentes cellules rétiniennes en culture cellulaire primaire. Ici, nous présentons une technique de dissection des tissus rétiniens et générer des cultures de cellules primaires qui sont imagées pour l'activité de calcium et analysés par hybridation in situ.

Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

Les cellules d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules souches peuvent être utilisées pour de multiples applications, notamment des thérapies cellulaires pour la dégénérescence rétinienne, la modélisation de maladies et des études de médicaments. Nous présentons ici un protocole simple pour dériver de manière reproductible l’EPR à partir de cellules souches.

Dérivation efficace des cellules d&#39;épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

La dérivation robuste des cellules de la tige pluripotente induite par l'homme (hiPS) a été réalisée en utilisant une reprogrammation médiée par vecteur de virus Sendai non-intégrant (SeV) des fibroblastes dermiques. La maintenance cellulaire de hiPS et l'expansion clonale ont été réalisées en utilisant des conditions de culture sans xénon et chimiquement définies avec une matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) et un milieu E8 (E8) essentiel.

Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme à l&#39;aide de Laminin 521 Matrix

Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

L’objectif du protocole est de comparer différentes conditions de revêtement de la matrice extracellulaire (ECM) afin d’évaluer comment le revêtement différentiel affecte le taux de croissance des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). En particulier, nous visons à mettre en place les conditions pour obtenir une croissance optimale des cultures iPSC.

Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.

Nous décrivons ici un système d’induction organoïde rétinienne optimisé, qui convient à diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées.

Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole décrit une méthode efficace pour différencier les CSPhi en groupes de champs oculaires et générer des organoïdes neuro-rétiniens en utilisant des conditions de culture simplifiées impliquant à la fois des systèmes de culture adhérents et en suspension. D’autres types de cellules oculaires, telles que l’EPR et l’épithélium cornéen, peuvent également être isolés à partir de champs oculaires matures dans des cultures rétiniennes.

Génération d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes saines et spécifiques à une maladie rétinienne

Ce protocole décrit comment générer des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de cellules T périphériques humaines dans des conditions sans nourrisseur en utilisant une combinaison de vecteurs viraux matrigel et Sendai contenant des facteurs de reprogrammation.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules T périphériques humains à l&#39;aide de virus Sendai dans des conditions libres Feeder-

Ce travail décrit un protocole de différenciation in vitro pour produire pigmentées, mélanocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines par une crête neurale et mélanoblaste étape intermédiaire en utilisant un protocole de 25 jours sans alimentation.

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

Découvrez la génération d'organoides rétiniens et d'épithélium pigmentaire à partir de cellules iPS humaines. Cette méthode simplifie la différenciation directe et facilite les recherches en thérapies cellulaires pour les maladies rétiniennes.

Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC (Vidéo) | JoVE Journal

Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC

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