Name: Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Apprenez à purifier et reconstituer TRPV1 pour l'analyse spectroscopique par résonance paramagnétique électronique. Ces protocoles permettent d'obtenir des quantités milligrammes de canal ionique fonctionnel pour étudier les changements conformationnels.

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Nous sommes très reconnaissants à m. H. Mchaourab pour accéder à des spectromètres EPR et cerfs et Dr T. Rosenbaum pour fournir le plasmide de TRPV1 cystéine-moins long.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Expression et purification des protéines membranaires chez les mammifères, les technologies actuelles ont permis d’obtenir des quantités suffisantes de protéines pour des études spectroscopiques14,15,16,,42. Ici, nous avons adapté ces technologies pour exprimer, purifier, reconstituer et effectuez des analyses spectroscopiques en TRPV1.
Parmi les étapes cruciales dan...

Avec les progrès récents dans la particule cryo microscopie électronique (cryo-EM), structures de canal ionique mammifères ont été obtenus à un rythme extraordinaire. En particulier, des études structurales des canaux ioniques de polymodal, tels que le récepteur transitoire potentiels VANILLOÏDE 1 (TRPV1), ont fourni davantage comprendre son activation des mécanismes1,2,3, 4 , 5. Toutefois, des informations dynamiques sur les canaux ioniques intégrée dans un environnement membranaire sont nécessaires pour comprendre leurs mécanismes de blocage et drogue-liaison polymodal.
Résonance paramagnétique électronique (RPE) et la spectroscopie de résonance (cerf) double électron-électron ont fourni certains des modèles mécanistes plus définitifs pour ion canaux6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. ces approches ont été principalement limitées à l’examen des procaryotes et des canaux d’archeal ion qui produisent une grande quantité de protéines purifiées détergent lorsque surexprimée dans les bactéries. Avec le développement de la production de protéines eucaryotes membrane dans l’insecte et des cellules de mammifères pour la caractérisation structurale et fonctionnelle de15,14,16, il est maintenant possible d’obtenir biochimiques quantités de protéines purifiées détergent pour études spectroscopiques.
Les signaux RPE et DEER découlent d’une étiquette de paramagneticspin (SL) (p. ex., méthanethiosulfonate) fixée à un résidu cystéine-unique dans la protéine. Les marqueurs de spin rapport trois types d’informations structurelles : motion, accessibilités et distances. Ces informations permettent de déterminer si les résidus sont enterrés dans la protéine ou sont exposés à la membrane ou le milieu aqueux dans l’apo et le ligand lié aux États13,17,18,19. Dans le cadre d’une structure à haute résolution (si disponible), les données de l’EPR et le cerf fournissent une collection des contraintes qui fixeront les modèles dynamiques dans leur environnement natif tout en surveillant réversible gating transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). En outre, régions flexibles qui peuvent être difficiles de déterminer par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM pourraient être obtenues en utilisant ces ensembles de données environnementales pour attribuer les structures secondaires ainsi que l’emplacement au sein de la protéine20. Structures de Cryo-EM obtenues en lipides nanodiscs a fourni des informations précieuses sur le déclenchement de l’ion canaux3,21,22,23,24, 25; Cependant, méthodes spectroscopiques pourraient fournir des informations dynamiques des États conformationnels (p. ex., changements thermiques) qui peut être difficile de déterminer à l’aide de cryo-EM.
Nombreuses difficultés doivent être surmontées pour implémenter l’EPR et les cerfs, notamment le manque de fonction de protéine en enlevant tous les résidus de cystéine (particulièrement abondants dans les canaux de mammifères), rendement faible en protéines, l’instabilité de la protéine durant la purification et après marquage de spin et l’agrégation de la protéine de détergent ou de liposomes. Ici, nous avons conçu des protocoles à surmonter ces obstacles essentiels et ont obtenu des renseignements de spectres DEER et EPR pour un récepteur sensoriel chez les mammifères. Le but ici est de décrire les méthodologies pour la construisent de l’expression, purification, étiquetage et reconstitution d’un rat fonctionnelle de la cystéine-moins minime TRPV1 (eTRPV1) pour les analyses spectroscopiques. Cette méthode est appropriée pour les protéines de la membrane qui gardent leur fonction malgré l’élimination des résidus de cystéine ou qui contiennent des cystéine formant des ponts disulfures. Cette collection de protocoles pourrait être adaptée pour l’analyse spectroscopique d’autres canaux d’ion chez les mammifères.

<table><tbody><tr><td>Kit de mutagénèse dirigée par la foudre QuikChange</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (isopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin à l’albumine (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Résine d’amylose</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolectine du soja</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Système d’expression de baculovirus Bac-à-Bac</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbants&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en verre borosilicaté (3.5'') (inyection des ovocytes)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en verre borosilicaté (enregistrements d’ovocytes)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline (disodique)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Cellfectin</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltose Monohydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Milieu à haute teneur en glucose (Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage jetables-10</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep</td><td>Kit Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage PCR GenCatch</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre (25 &micro ; l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside)</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon, Miller</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Hémisulfate de leupeptine</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine-3-yl) Méthyl Méthanétiosulfonate</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Acide pluronique F-127 (20 %)</td><td>PromoKine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Solution de poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire scellé</td><td>VitroCom</td><td>commande</td><td></td>spéciale</tr><tr><td>SF-900 II SFM (milieu cellulaire d’insecte)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Cellules (adaptées SFM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de lipides polaires de soja</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>Scientific S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétracycline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Ovocytes de xénope</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cells</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Levure Extrait</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de chromatographie Econo-Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels préfabriqués sans coloration</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Vecteur d’expression</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Cellules compétentes</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Scellant pour tubes capillaires Critiseal</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Modèle 3130XL Analyseurs génétiques</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

purification et reconstitution de trpv1 pour analyse spectroscopique

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Canaux ioniques polymodal transduce multiples stimuli de différentes natures allostérique de l’évolution ; ces conformations dynamiques sont difficiles à déterminer et demeurent largement inconnus. Avec les progrès récents en lumière délestage de la particule cryo-electron microscopy (cryo-EM) sur les caractéristiques structurales des sites de fixation agoniste et le mécanisme d’activation de plusieurs canaux ioniques, le décor est planté pour une analyse approfondie et dynamique de leurs processus de blocage mécanismes utilisant des méthodes spectroscopiques. Techniques spectroscopiques comme la résonance paramagnétique électronique (RPE) et électron-électron double résonance (cerf) ont été principalement limités à l’étude des canaux ioniques procaryotes qui peut être purifié en grandes quantités. L’obligation pour les grandes quantités de protéines membranaires fonctionnelle et stable a entravé l’étude des canaux d’ion mammifères à l’aide de ces approches. EPR et DEER offre de nombreux avantages, y compris la détermination de la structure et des changements dynamiques des régions de la protéine mobile, mais à basse résolution, ce qui pourrait être difficile d’obtenir par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM, et suivi d’une ouverture de porte réversible transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). Ici, nous fournissons des protocoles pour l’obtention de milligrammes de récepteur transitoire fonctionnel solubilisée détergent potentiels cation V membre du subfamily canal 1 (TRPV1) qui peut être marqué pour la spectroscopie RPE et le cerf.

Caractérisation fonctionnelle des minimes sans cystéine TRPV1 construire (eTRPV1) et Single-cystéine Mutants
La première étape vers des études spectroscopiques est d’ingénieur et de caractériser des constructions de cystéine-moins de protéine (Figure 2 a) qui sont fonctionnels et qui produisent des quantités biochimiques des protéines. eTRPV1 est fonctionnel, tel que déterminé par Ca2 + imag...

Cet article décrit des méthodes spécifiques pour obtenir des quantités biochimiques de TRPV1 solubilisée détergent pour analyse spectroscopique. Les protocoles combinés offrent des outils biochimiques et biophysiques qui peuvent être adaptées afin de faciliter les études structurales et fonctionnelles des canaux ioniques mammifères dans un environnement contrôlé en membrane.

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Ici, dans le laboratoire, nous pensons que l’utilisation d’une approche spectroscopique peut aider à répondre à des questions clés dans la famille des canaux ioniques du potentiel des récepteurs transitoires. Par exemple, déterminer les changements informationnels dynamiques associés à l’activation polymodale. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet l’utilisation d’un milligramme de canal ionique restant pur et fonctionnel pour la résonance paramagnétique électronique électronique et l’épitroscopie par résonance électronique double.Cette méthode peut donner un aperçu des changements de conformation compatibles avec le déclenchement thermique et indépendant de la lumière de 3B1. Il peut également être appliqué à d’autres canaux de déclenchement, comme 3B2, par exemple. Commencez cette procédure avec des amorces de mutagénèse de conception avec des outils en ligne.Préparez la réaction PCR comme décrit dans le protocole textuel et faites tourner le mélange. Placez les tubes dans le thermocycleur et effectuez la mutagénèse par PCR à l’aide des paramètres de PCR indiqués dans le protocole texte. Ajoutez ensuite deux microlitres d’enzyme DPN1 à la réaction et mélangez.Incu

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Nous décrivons un protocole simple pour identifier les protéines du cerveau qui se lient à l'extrémité C-terminale pleine longueur de l'ATP-dépendants P2X2 récepteurs. L'extension et l'application systématique de cette approche à tous les récepteurs P2X devrait conduire à une meilleure compréhension de la signalisation des récepteurs P2X.

Protéomique pour identifier les protéines interagissant avec P2X2 canaux cationiques ligand-dépendants

Isotachophorèse (PTI) est une séparation solide électrocinétique et de la technique de préconcentration avec des applications allant de la détection de la toxine à la préparation des échantillons. Nous passons en revue les principes physiques de l'ITP et la méthodologie de l'application de cette technique à deux exemples d'applications spécifiques: la séparation et la détection de petites molécules et de purification des acides nucléiques à partir de lysat de culture cellulaire.

Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l'affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Pour compléter les méthodes couramment utilisées pour étudier TRPV4 de, deux méthodes sont décrites: Son mécanosensibilité peut être étudiée par le Ca 2 + luminométrie-aequorine dans la levure transgénique lors de l'épreuve de l'hypo-osmotique. Il peut également être consultée en TRPV4-ARN injecté des ovocytes de Xenopus par cellule entière à deux électrodes de verrouillage de tension ou de patch clamp dans la cellule ou le mode excisé.

Levure et luminométrique Xenopus ovocytes électrophysiologiques examens de la mécanosensibilité moléculaire de TRPV4

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Suivi des particules sensibles à la masse pour caractériser la dynamique des macromolécules associées à la membrane

Apprenez à purifier et reconstituer TRPV1 pour l'analyse spectroscopique par résonance paramagnétique électronique. Ces protocoles permettent d'obtenir des quantités milligrammes de canal ionique fonctionnel pour étudier les changements conformationnels.

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

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