Name: Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Apprenez à purifier et reconstituer TRPV1 pour l'analyse spectroscopique par résonance paramagnétique électronique. Ces protocoles permettent d'obtenir des quantités milligrammes de canal ionique fonctionnel pour étudier les changements conformationnels.

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Nous sommes très reconnaissants à m. H. Mchaourab pour accéder à des spectromètres EPR et cerfs et Dr T. Rosenbaum pour fournir le plasmide de TRPV1 cystéine-moins long.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Expression et purification des protéines membranaires chez les mammifères, les technologies actuelles ont permis d’obtenir des quantités suffisantes de protéines pour des études spectroscopiques14,15,16,,42. Ici, nous avons adapté ces technologies pour exprimer, purifier, reconstituer et effectuez des analyses spectroscopiques en TRPV1.
Parmi les étapes cruciales dan...

Avec les progrès récents dans la particule cryo microscopie électronique (cryo-EM), structures de canal ionique mammifères ont été obtenus à un rythme extraordinaire. En particulier, des études structurales des canaux ioniques de polymodal, tels que le récepteur transitoire potentiels VANILLOÏDE 1 (TRPV1), ont fourni davantage comprendre son activation des mécanismes1,2,3, 4 , 5. Toutefois, des informations dynamiques sur les canaux ioniques intégrée dans un environnement membranaire sont nécessaires pour comprendre leurs mécanismes de blocage et drogue-liaison polymodal.
Résonance paramagnétique électronique (RPE) et la spectroscopie de résonance (cerf) double électron-électron ont fourni certains des modèles mécanistes plus définitifs pour ion canaux6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. ces approches ont été principalement limitées à l’examen des procaryotes et des canaux d’archeal ion qui produisent une grande quantité de protéines purifiées détergent lorsque surexprimée dans les bactéries. Avec le développement de la production de protéines eucaryotes membrane dans l’insecte et des cellules de mammifères pour la caractérisation structurale et fonctionnelle de15,14,16, il est maintenant possible d’obtenir biochimiques quantités de protéines purifiées détergent pour études spectroscopiques.
Les signaux RPE et DEER découlent d’une étiquette de paramagneticspin (SL) (p. ex., méthanethiosulfonate) fixée à un résidu cystéine-unique dans la protéine. Les marqueurs de spin rapport trois types d’informations structurelles : motion, accessibilités et distances. Ces informations permettent de déterminer si les résidus sont enterrés dans la protéine ou sont exposés à la membrane ou le milieu aqueux dans l’apo et le ligand lié aux États13,17,18,19. Dans le cadre d’une structure à haute résolution (si disponible), les données de l’EPR et le cerf fournissent une collection des contraintes qui fixeront les modèles dynamiques dans leur environnement natif tout en surveillant réversible gating transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). En outre, régions flexibles qui peuvent être difficiles de déterminer par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM pourraient être obtenues en utilisant ces ensembles de données environnementales pour attribuer les structures secondaires ainsi que l’emplacement au sein de la protéine20. Structures de Cryo-EM obtenues en lipides nanodiscs a fourni des informations précieuses sur le déclenchement de l’ion canaux3,21,22,23,24, 25; Cependant, méthodes spectroscopiques pourraient fournir des informations dynamiques des États conformationnels (p. ex., changements thermiques) qui peut être difficile de déterminer à l’aide de cryo-EM.
Nombreuses difficultés doivent être surmontées pour implémenter l’EPR et les cerfs, notamment le manque de fonction de protéine en enlevant tous les résidus de cystéine (particulièrement abondants dans les canaux de mammifères), rendement faible en protéines, l’instabilité de la protéine durant la purification et après marquage de spin et l’agrégation de la protéine de détergent ou de liposomes. Ici, nous avons conçu des protocoles à surmonter ces obstacles essentiels et ont obtenu des renseignements de spectres DEER et EPR pour un récepteur sensoriel chez les mammifères. Le but ici est de décrire les méthodologies pour la construisent de l’expression, purification, étiquetage et reconstitution d’un rat fonctionnelle de la cystéine-moins minime TRPV1 (eTRPV1) pour les analyses spectroscopiques. Cette méthode est appropriée pour les protéines de la membrane qui gardent leur fonction malgré l’élimination des résidus de cystéine ou qui contiennent des cystéine formant des ponts disulfures. Cette collection de protocoles pourrait être adaptée pour l’analyse spectroscopique d’autres canaux d’ion chez les mammifères.

<table><tbody><tr><td>Kit de mutagénèse dirigée par la foudre QuikChange</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (isopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin à l’albumine (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Résine d’amylose</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolectine du soja</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Système d’expression de baculovirus Bac-à-Bac</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbants&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en verre borosilicaté (3.5'') (inyection des ovocytes)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en verre borosilicaté (enregistrements d’ovocytes)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline (disodique)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Cellfectin</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltose Monohydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Milieu à haute teneur en glucose (Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage jetables-10</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep</td><td>Kit Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage PCR GenCatch</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre (25 &micro ; l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside)</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon, Miller</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Hémisulfate de leupeptine</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine-3-yl) Méthyl Méthanétiosulfonate</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Acide pluronique F-127 (20 %)</td><td>PromoKine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Solution de poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire scellé</td><td>VitroCom</td><td>commande</td><td></td>spéciale</tr><tr><td>SF-900 II SFM (milieu cellulaire d’insecte)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Cellules (adaptées SFM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de lipides polaires de soja</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>Scientific S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétracycline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Ovocytes de xénope</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cells</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Levure Extrait</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de chromatographie Econo-Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels préfabriqués sans coloration</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Vecteur d’expression</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Cellules compétentes</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Scellant pour tubes capillaires Critiseal</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Modèle 3130XL Analyseurs génétiques</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

purification et reconstitution de trpv1 pour analyse spectroscopique

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Canaux ioniques polymodal transduce multiples stimuli de différentes natures allostérique de l’évolution ; ces conformations dynamiques sont difficiles à déterminer et demeurent largement inconnus. Avec les progrès récents en lumière délestage de la particule cryo-electron microscopy (cryo-EM) sur les caractéristiques structurales des sites de fixation agoniste et le mécanisme d’activation de plusieurs canaux ioniques, le décor est planté pour une analyse approfondie et dynamique de leurs processus de blocage mécanismes utilisant des méthodes spectroscopiques. Techniques spectroscopiques comme la résonance paramagnétique électronique (RPE) et électron-électron double résonance (cerf) ont été principalement limités à l’étude des canaux ioniques procaryotes qui peut être purifié en grandes quantités. L’obligation pour les grandes quantités de protéines membranaires fonctionnelle et stable a entravé l’étude des canaux d’ion mammifères à l’aide de ces approches. EPR et DEER offre de nombreux avantages, y compris la détermination de la structure et des changements dynamiques des régions de la protéine mobile, mais à basse résolution, ce qui pourrait être difficile d’obtenir par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM, et suivi d’une ouverture de porte réversible transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). Ici, nous fournissons des protocoles pour l’obtention de milligrammes de récepteur transitoire fonctionnel solubilisée détergent potentiels cation V membre du subfamily canal 1 (TRPV1) qui peut être marqué pour la spectroscopie RPE et le cerf.

Caractérisation fonctionnelle des minimes sans cystéine TRPV1 construire (eTRPV1) et Single-cystéine Mutants
La première étape vers des études spectroscopiques est d’ingénieur et de caractériser des constructions de cystéine-moins de protéine (Figure 2 a) qui sont fonctionnels et qui produisent des quantités biochimiques des protéines. eTRPV1 est fonctionnel, tel que déterminé par Ca2 + imag...

Cet article décrit des méthodes spécifiques pour obtenir des quantités biochimiques de TRPV1 solubilisée détergent pour analyse spectroscopique. Les protocoles combinés offrent des outils biochimiques et biophysiques qui peuvent être adaptées afin de faciliter les études structurales et fonctionnelles des canaux ioniques mammifères dans un environnement contrôlé en membrane.

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Ici, dans le laboratoire, nous pensons que l’utilisation d’une approche spectroscopique peut aider à répondre à des questions clés dans la famille des canaux ioniques du potentiel des récepteurs transitoires. Par exemple, déterminer les changements informationnels dynamiques associés à l’activation polymodale. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet l’utilisation d’un milligramme de canal ionique restant pur et fonctionnel pour la résonance paramagnétique électronique électronique et l’épitroscopie par résonance électronique double.Cette méthode peut donner un aperçu des changements de conformation compatibles avec le déclenchement thermique et indépendant de la lumière de 3B1. Il peut également être appliqué à d’autres canaux de déclenchement, comme 3B2, par exemple. Commencez cette procédure avec des amorces de mutagénèse de conception avec des outils en ligne.Préparez la réaction PCR comme décrit dans le protocole textuel et faites tourner le mélange. Placez les tubes dans le thermocycleur et effectuez la mutagénèse par PCR à l’aide des paramètres de PCR indiqués dans le protocole texte. Ajoutez ensuite deux microlitres d’enzyme DPN1 à la réaction et mélangez.Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, effectuez la transformation en ajoutant 75 microlitres de cellules compétentes E.Coli décongelées et 10 microlitres de mélange PCR traité DPN1 dans un tube stérile pré-refroidi de 14 millilitres. Après avoir mélangé doucement, incuber la réaction sur de la glace pendant 30 minutes.Maintenez le tube à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes, puis placez-le immédiatement sur de la glace pendant deux minutes. Déposer le mélange sur une plaque de gélose LB contenant de la carbénicilline et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Après avoir récolté des colonies individuelles et préparé des nuits comme décrit dans le protocole textuel, faites tourner les cultures de nuit à 8000 fois G pendant 10 minutes.Ensuite, extrayez l’ADN en suivant les instructions des mini-kits de préparation disponibles dans le commerce. Pour générer le bactid recombinant, transformez 100 microlitres de cellules compétentes DH10bac E.Coli avec 7,5 nanogrammes du vecteur donneur recombinant. Les vecteurs contiennent le rat fonctionnel sans cystéine minimale TRPV1, abrégé eTRPV1 et/ou des mutants de cystéine uniques.Après l’ensemencement et l’incubation des cellules comme décrit dans le protocole textuel, sélectionnez des colonies blanches de deux millimètres de diamètre, car les colonies bleues n’ont pas l’insert d’intérêt. À l’aide d’un stéréomicroscope, vérifiez que les colonies blanches ne contiennent pas de taches bleues. Récoltez au moins trois colonies simples et transférez-les dans un tube stérile de 14 millilitres contenant quatre millilitres de milieu LB supplémenté.Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius en 250 tr/min. Prélever 1,5 millilitre des cultures de nuit et isoler l’ADN bacmid recombinant. Pour générer le baculovirus recombinant, plaquez un million de cellules SF9 dans deux millimètres de milieu cellulaire d’insecte.Laissez les cellules se fixer pendant au moins 45 minutes. Après avoir lavé une fois avec un millilitre de milieu frais, retirez le milieu de lavage et ajoutez le mélange de réactifs de transfection d’ADN aux cellules. Incuber les cellules à 27 degrés Celsius pendant cinq heures sans agitation.Après l’incubation, retirer le mélange de transfection et le remplacer par deux millilitres de milieu cellulaire d’insecte contenant 0,5 % de sérum fœtal bovin. Ensuite, incubez les cellules à 27 degrés Celsius pendant cinq jours. Transférez le milieu de culture cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.Isolez le premier passage de stock viral en faisant tourner le tube à 8000 fois G pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un tube à centrifuger propre de 15 millilitres et stockez-le immédiatement à quatre degrés Celsius. De la deuxième génération de stock viral, pipeter une culture en suspension de 25 millilitres de milieu cellulaire d’insecte à un million de cellules SF9 par millilitre contenant 2 % de FBS dans une fiole de 125 millilitres.Ajoutez 25 microlitres du virus P1 à la culture de 25 millilitres. Ensuite, incubez la culture à 27 degrés Celsius pendant 72 heures. Pour récolter le stock viral P2, transférez la culture dans un nouveau tube de 50 millilitres et centrifugez-la à 8000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et stockez-le immédiatement à quatre degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de stock de virus P2 à la culture d’un litre et incubez-la à 27 degrés Celsius pendant 72 heures. Récoltez la culture en suspension de cellules d’insectes d’un litre en tournant à 4500 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Pesez la pastille de cellule. On s’attend à ce qu’il pèse environ six à neuf grammes. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 25 millilitres de tampon A glacé en présence d’inhibiteurs de protéase.Désagréger les amas cellulaires pour obtenir une suspension homogène et tourner à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Casser les cellules à l’aide d’un homogénéisateur manuel ou à haute pression. Après avoir éliminé les débris cellulaires par centrifugation à 8000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, récupérez le surnageant et centrifugez-le à nouveau à 100 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, jeter le surnageant et suspendre la pastille de membrane dans un volume total de 20 millilitres de tampon B glacé complété par des inhibiteurs de protéase. Aliquote 20 millilitres de suspension à membrane dans des tubes de 50 millilitres. Pour effectuer la purification des protéines, ajoutez trois millilitres de DDM par tube.Faites pivoter les tubes pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après avoir centrifugé l’échantillon à 100 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, prélevez le surnageant et ajoutez un millilitre de résine d’amylose propre et humide. Faites pivoter le mélange pendant deux heures à quatre degrés Celsius.Chargez ensuite le mélange de protéines amylose dans des colonnes de chromatographie par gravité. Lavez la résine amylose liée aux protéines avec 10 fois le volume de lit du tampon froid C et 10 volumes de lit de tampon D. Elute eTRPV1 protein avec 0,5 millilitre de fractions jusqu’à cinq millilitres de tampon D dégazé à froid complété par 20 millimoses de maltose. Effectuez les lavages et l’élution à quatre degrés Celsius.À l’aide d’une unité de filtration centrifuge de 100 kilodaltons, concentrez les fractions contenant l’eTRPV1 entre deux et 2,5 milligrammes par millilitre pour l’étiquetage. Ensuite, ajoutez un excès molaire dix fois plus important de MTSSL à partir d’une solution mère de 100 millimolaires dans du DMSO à la protéine concentrée. Répétez cette opération deux fois toutes les 30 minutes.Conservez la réaction dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure et 30 minutes, suivie d’une incubation pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, chargez l’étiquette de spin sur eTRPV1 sur une colonne de chromatographie d’exclusion stérique équilibrée dans le tampon E, contrôlée par un système de chromatographie liquide à protéines rapides. Recueillir les fractions contenant le tétramère eTRPV1.Séchez 10 milligrammes d’asolectine à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide pendant une heure à 40 degrés Celsius. Pour fabriquer des liposomes d’asolectine, ajoutez un millilitre de tampon F et sonicez le mélange pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que l’échantillon soit homogène. Déstabiliser les liposomes en ajoutant du DDM à une concentration finale de deux millimolaires et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.Après avoir ajusté le mélange à la concentration critique de mycél DDM, comme détaillé dans le protocole de texte, doublez le volume du mélange de liposomes protéiques avec le tampon F. Retirez le détergent en ajoutant séquentiellement trois aliquotes de billes absorbantes de polystyrène non polaire à des intervalles d’une heure avec une légère agitation à température ambiante. Chargez le mélange sur un filtre à colonne pour retirer les billes et transférez le mélange de protéoliposomes dans un tube d’ultra-centrifugeuse. Centrifugez les échantillons à 100 000 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 30 microlitres de tampon F, puis effectuez des mesures et des analyses spectroscopiques. Le premier point de contrôle est l’analyse fonctionnelle des mutants monocystéine avant d’entreprendre des protocoles d’expression et de purification. Ici, les cellules hek293 exprimant le type sauvage TRPV1, l’eTRPV1 et les mutants ont été analysées pour les réponses évoquées par la capsaïcine à l’aide de l’imagerie calcique par fluorescence.Le deuxième point de contrôle est la caractérisation biochimique des mutants monocystéine marqués au spin par chromatographie d’exclusion stérique avant de procéder à la reconstitution et à l’analyse spectroscopique. Le troisième point de contrôle est la caractérisation fonctionnelle des mutants monocystéine marqués en spin reconstitué avant d’entreprendre une analyse spectroscopique. Les relations de tension de courant déterminées par une pince de tension à deux électrodes d’ovocytes de xénope micro-injectées avec des protéoliposomes contenant un spin marqué A702C ont été testées par pH5 et bloquées par la capsazepine.Enfin, il est possible d’obtenir les mobilités des mutants eTRPV1 marqués en spin déterminées par EPR à ondes continues. Les premiers spectres de dérivée sont montrés pour les mutants de cystéine marqués en spin dans une solution DDM et reconstitués dans des liposomes d’asolectine. Les distances et les mobilités des mutants eTRPV1 marqués au spin dans les détergents ont également été déterminées par DEER.L’écho DEER et la distribution de distance du mutant E651C marqué en spin sont montrés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer, d’embellir et de reconstituer un canal ionique de mammifère pour l’analyse spectroscopique. En général, les personnes novices dans cette méthode auront des difficultés en raison du manque de fonction protéique lors de l’élimination des résidus de cystéine, du faible rendement en protéines et de l’instabilité des protéines lors de la purification et après le marquage de spin, et de l’agrégation des protéines dans les détergents ou les liposomes.Après son développement, ces protocoles permettront d’obtenir des changements de distance et de dynamique pour explorer des modèles mécanistes pour le gate polymodal TRPV1.

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