Name: טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: למדו שיטות לטיהור TRPV1 לניתוח ספקטרוסקופי באמצעות EPR ו-DEER. פרוטוקולים אלו מאפשרים חקר שינויים קונפורמציונליים בערוצי יונים ממליאריים ומספקים מסגרת למחקר מבני בביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מאוד ד ר Mchaourab ה על מתן גישה ספקטרומטרים EPR וצבאים, ד ר רוזנבאום ט עבור מספקים את פלסמיד TRPV1 ציסטאין-פחות באורך מלא.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

טכנולוגיות הנוכחי עבור ביטוי וטיהור של חלבוני ממברנה יונקים הפכו אותה ניתן לקבל כמויות מספיקות של חלבון עבור מחקרים ספקטרוסקופיות14,15,16,42. כאן, אנחנו הסתגלו טכנולוגיות אלה כדי לבטא, לטהר, לשקם, לבצע ניתוח spectroscopic ב TRPV1.
בין הצעדים הקריטיים בפרוטוקול, להלן אלה אנו יש troubleshot על TRPV1, זה עשוי להיות מותאם חלבונים אחרים. לשנות את רצף ה-DNA כדי ליצור תבנית...

עם ההתקדמות יחיד-חלקיקים הקפאה-מיקרוסקופ (הקפאה-EM), יון בתרבית של ערוץ מבנים הושגו בקצב יוצא דופן. במיוחד, מחקרים מבנית של תעלות יונים polymodal, כגון vanilloid פוטנציאלי קולטן ארעי 1 (TRPV1), סיפקו יותר הבנה של הפעלת מנגנונים1,2,3, 4 , 5. עם זאת, נדרש מידע דינמי על יון ערוצי מוטבע בסביבת ממברנה כדי להבין את מנגנוני חסימה ואיגוד התרופות שלהם polymodal.
אלקטרון פאראמגנטיים תהודה (EPR) ואת אלקטרון כפול-אלקטרון תהודה (צבי) spectroscopies סיפקו כמה דגמים מכניסטית סופית ביותר עבור יון ערוצי6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. גישות אלה היה מוגבל בעיקר הבחינה של prokaryotic ו archeal יון ערוצי זה להניב כמות גדולה של חלבונים מטוהרים דטרגנט כאשר overexpressed בחיידקים. עם התפתחות ממברנות האיקריוטים ייצור חלבונים חרק, בתרבית של תאים עבור אפיון פונקציונלי ומבניים14,15,16, עכשיו זה אפשרי להשיג הביוכימי כמויות של חלבונים מטוהרים דטרגנט ללימודי ספקטרוסקופיות.
האותות EPR וצבאים נובעים תווית paramagneticspin (SL) (קרי, methanethiosulfonate) קשורה משקע יחיד-ציסטאין בחלבון. הספין-התוויות דווח על שלושה סוגים של נתוני מבנה: תנועה, accessibilities, מרחקים. מידע זה מאפשר לקבוע אם שאריות קבורים בתוך החלבון או חשופים ממברנה או סביבה מימית אפו ואת הברית ליגנד מכורך13,17,18,19. בהקשר של מבנה ברזולוציה גבוהה (אם זמין), הנתונים EPR וצבאים לספק אוסף של אילוצים שיניעו מודלים דינאמיים בסביבה הטבעית שלהם תוך מעקב אחר המעבר חסימה הפיכה (קרי, סגור, פתוח, רגיש, רגישות). יתר על כן, האזורים גמישה שעשויה להיות קשה לקבוע על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-EM יכולה להיות מושגת באמצעות ערכות נתונים סביבתיים אלה כדי להקצות מבנים משניים, כמו גם מיקום בתוך חלבון20. הקפאה-EM מבנים בשנת השומנים nanodiscs סיפק מידע חיוני על דרך השער של יון ערוצי3,21,22,23,24, 25; עם זאת, גישות ספקטרוסקופיות יכול לספק מידע דינאמי ממדינות הסתגלותי (למשל, שינויים תרמיים) זה יכול להיות קשה לקבוע באמצעות הקפאה-EM.
קשיים רבים להכריעו ליישם EPR וצבאים, כולל חוסר וחלבון לתפקד בעת הסרת כל שאריות ציסטאין (במיוחד בשפע ערוצי יונקים), התשואה חלבון נמוך, חלבון יציבות במהלך טיהור ואחרי ספין תיוג , ואת החלבון צבירת חומרי ניקוי או ליפוזומים. . הנה, עיצבנו פרוטוקולים כדי להתגבר על מחסומים אלה קריטיות והשגת צבי ומידע ספקטרה EPR עבור יונקים קולטן חישה. המטרה כאן היא לתאר את מתודולוגיות כי הביטוי טיהור, תיוג, שיחזור של חולדה ציסטאין-פחות מינימלי ופונקציונלי TRPV1 (eTRPV1) לבנות עבור ניתוחים spectroscopic. מתודולוגיה זו מתאימה עבור אלה חלבונים קרום זה לשמור על תפקידם למרות הסרת שאריות ציסטאין או שמכילות ציסטאין ויוצרים דיסולפידי-חוב. זה אוסף של פרוטוקולים יכול להתאים לניתוח spectroscopic של תעלות יונים יונקים אחרים.

<table><tbody><tr><td>ערכת מוטגנזה מכוונת אתר QuikChange Lightning</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול (איזופרופנול)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בקר סרום (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>שרף עמילוז</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>אפרוטינין</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>אסולקטין מפולי סויה</td><td>סיגמא</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbents&nbsp;</td><td>פיפטות זכוכית ביו-ראד</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט (3.5 אינץ') (פיפטות ביציות)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית בורוסיליקט (הקלטות ביציות)</td><td>מכשיר סאטר</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>קרבניצילין (דיסודיום)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin Reagent</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-מלטוז מונוהידראט</td><td>פישר מדעי</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גלוקוז גבוה (Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>עמודי התפלה חד פעמיים PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch PCR ניקוי ערכת Epoch</td><td>Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית (25 ומיקרו; l)</td> <td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק זכוכית 2800 מ"ל</td><td>פיירקס ארה"ב</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (איזופרופיל-תיו-B-גלקטוזיד)GoldBio.com</td><td></td> <td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>פישר כימיקל</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק, מילר</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין המיסולפט</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MOPS Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) מתיל Methanethiosulfonate</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פלורונית F-127 (20%)</td><td>PromoKine&nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy מיני קיט</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>נימי אטום</td><td>VitroCom</td><td>הזמנה</td><td></td>מיוחדת</tr><tr><td>SF-900 II SFM (מדיום תאי חרקים)</td> <td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 תאים (SFM מותאם)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>תמצית ליפידים קוטביים מפולי סויה</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 עלייה 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין הידרוכלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>דיפקו</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>ביציות קסנופוס</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - תאים מוכשרים כחולים</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>שמרים תמצית</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>עמודת כרומטוגרפיה Econo-Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים ללא כתמים</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 וקטור ביטוי</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac תאים מוכשרים</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>איטום צינור נימי Critiseal</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI דגם 3130XL אנלייזרים גנטיים</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפט</td><td>פישברנד</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>דראמונד סיינטיפיק</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור, בנייתו מחדש של trpv1 לניתוח spectroscopic

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

תעלות יונים Polymodal מגלי גירויים מרובים מפלאי שונים לתוך השינויים allosteric; אלה הייצורים החיים דינמיים הם מאתגרים לקבוע ולהישאר אינו מודע לקיומם. עם ההתקדמות האחרונה יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM) שפיכת האור על המאפיינים המבניים של אתרי קישור אגוניסט, מנגנון הפעלה של מספר תעלות יונים, הבמה מוכנה לניתוח מעמיק דינמי של gating שלהם מנגנונים שימוש בגישות ספקטרוסקופיות. שיטות ספקטרוסקופיות אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה (EPR) ו אלקטרון כפול-אלקטרון תהודה (צבי) היה מוגבל בעיקר במחקר של תעלות יונים prokaryotic זה יכול להיטהר בכמויות גדולות. הדרישה עבור כמויות גדולות של חלבונים פונקציונליים ויציב ממברנה יש הקשו המחקר של תעלות יונים יונקים באמצעות הגישות האלה. EPR וצבאים מציעים יתרונות רבים, לרבות קביעת המבנה ושינויים דינמי של חלבון ניידים אזורים, אמנם ברזולוציה נמוכה, שעשויה להיות קשה להשיג על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-EM, וניטור gating הפיך מעבר (קרי, סגור, פתוח, רגיש, רגישות). כאן, אנו מספקים פרוטוקולים להשגת מיליגרם של קולטן ארעי solubilized דטרגנט פונקציונלי פוטנציאליים הקטיון ערוץ תת V חבר 1 (TRPV1) יכול להיקרא על ספקטרוסקופיה EPR וצבאים.

אפיון פונקציונלי של מינימלי ציסטאין-פחות TRPV1 לבנות (eTRPV1), יחיד-ציסטאין מוטציות
הצעד הראשון לקראת לימודי ספקטרוסקופיות הוא מהנדס ולאפיין מבנים ציסטאין-פחות חלבון (איור 2 א) מתפקדים, תשואות כמויות ביוכימיה של חלבונים. eTRPV1 מתפקד כפי שנקבע על ידי Ca2 + הדמיה ו- TEVC (איור 2B-C). יתר על כן, eTRPV1 מספק כמויות מספיקות של חלבון מטוהרים דטרגנט ב...

מאמר זה מתאר שיטות ספציפיות כדי לקבל כמויות הביוכימי של solubilized-חומרי ניקוי TRPV1 לניתוח spectroscopic. הפרוטוקולים המשולב לספק כלים הביוכימי biophysical זה ניתן להתאים להקל פונקציונלי מבניים ללימודי תעלות היונים בתרבית של סביבה מבוקרת ממברנה.

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

כאן במעבדה, אנו חושבים ששימוש בגישה ספקטרוסקופית יכול לעזור לענות על שאלות מפתח במשפחת תעלות היונים הפוטנציאליות של קולטנים חולפים. כגון קביעת השינויים האינפורמטיביים הדינמיים הקשורים להפעלה פולימודאלית. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שמאפשר מיליגרם של תעלת יונים שנותרה טהורה ופונקציונלית לתהודה פרמגנטית של אלקטרונים ואפיטרוסקופיה של תהודה אלקטרונית כפולה.שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי השינויים הקונפורמטיביים התואמים לשער תרמי ובלתי תלוי באור של 3B1. ניתן להחיל אותו גם על ערוצי נסיעה אחרים, כמו 3B2, למשל. התחל הליך זה עם עיצוב פריימרים למוטגנזה עם כלים מקוונים.הכן את תגובת ה-PCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט וסובב את התערובת. הנח את הצינורות בתרמו-ציקלר ובצע מוטגנזה של PCR באמצעות פרמטרי ה-PCR המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של אנזים DPN1 לתגובה ומערבבים.דגרו על התגובות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצע את הטרנספורמציה על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של תאים מוכשרים של E.Coli מופשרים ו-10 מיקרוליטר של תערובת PCR שטופלה ב-DPN1 לצינור סטרילי מקורר מראש של 14 מיליליטר. לאחר ערבוב עדין, דגרו את התגובה על קרח למשך 30 דקות.שמרו על הצינור בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ולאחר מכן הניחו אותו מיד על קרח למשך שתי דקות. צלחת את התערובת על צלחת אגר LB המכילה קרבניצילין, ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר קציר מושבות בודדות והכנת לילה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, סובב תרביות לילה ב 8000 פעמים G למשך 10 דקות.לאחר מכן, חלץ את ה-DNA בהתאם להוראות של ערכות הכנה מיני זמינות מסחריות. כדי ליצור את הבקמיד הרקומביננטי, הפוך 100 מיקרוליטר של תאים מוכשרים DH10bac E.Coli עם 7.5 ננוגרם של וקטור התורם הרקומביננטי. וקטורים מכילים את החולדה המינימלית הפונקציונלית ללא ציסטאין TRPV1, בקיצור eTRPV1 ו/או מוטציות ציסטאין בודדות.לאחר זריעה ודגירה של תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בחר מושבות לבנות בקוטר של שני מילימטרים מכיוון שמושבות כחולות חסרות את התוספת המעניינת. השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שמושבות לבנות אינן מכילות כתמים כחולים. קצרו לפחות שלוש מושבות בודדות והעבירו אותן לצינור סטרילי של 14 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר בתוספת מדיה LB.דגרו על התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-250 סל"ד. קח 1.5 מיליליטר מתרביות הלילה ובודד DNA בקמיד רקומביננטי. כדי ליצור את נגיף הבקולו-רקומביננטי, יש להכיל מיליון תאי SF9 בשני מילימטרים של מדיה של תאי חרקים.אפשר לתאים להיצמד למשך 45 דקות לפחות. לאחר שטיפה פעם אחת עם מיליליטר אחד של מדיום טרי, הסר את מדיום הכביסה והוסף תערובת ריאגנטים להעברת DNA לתאים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות ללא תסיסה.לאחר הדגירה, הסר את תערובת הטרנספקציה והחלף בשני מיליליטר של תאי חרקים המכילים סרום בקר עוברי 0.5%. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. העבירו את אמצעי תרבית התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.בודד את המעבר הראשון של מלאי הנגיף על ידי סיבוב הצינור ב-8000 פעמים G למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה נקי של 15 מיליליטר ואחסנו אותו מיד בארבע מעלות צלזיוס. מהדור השני של מלאי הנגיפי, פיפטה תרבית תרחיף של 25 מיליליטר של מדיה של תאי חרקים במיליון תאי SF9 למיליליטר המכילה 2% FBS לבקבוק של 125 מיליליטר.הוסף 25 מיקרוליטר של נגיף P1 לתרבית של 25 מיליליטר. לאחר מכן, דגרו את התרבית בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. כדי לקצור את המלאי הנגיפי P2 העבירו את התרבית לצינור חדש של 50 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 8000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 50 מיליליטר ואחסנו אותו מיד בארבע מעלות צלזיוס. הוסף מיליליטר אחד של מלאי נגיף P2 לתרבית ליטר אחד ודגר אותו ב-27 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. קצרו את תרבית תרחיף תאי החרקים של ליטר אחד על ידי סיבוב ב-4500 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.שקלו את גלולת התא. זה צפוי להיות בסביבות שישה עד תשעה גרם. השעו מחדש את כדור התא ב-25 מיליליטר של מאגר קר קרח A בנוכחות מעכבי פרוטאז.לפרק גושי תאים כדי לקבל תרחיף הומוגני ולסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שוברים את התאים באמצעות מדריך או הומוגנייזר בלחץ גבוה. לאחר הסרת פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב-8000 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, אסוף שוב את הסופרנטנט והצנטריפוגה ב-100,000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו את כדור הממברנה בנפח כולל של 20 מיליליטר של בופר קר קרח B בתוספת מעכבי פרוטאז. Aliquot 20 מיליליטר מתלה קרום לצינורות 50 מיליליטר. כדי לבצע את טיהור החלבון הוסף שלושה מיליליטר DDM לכל צינור.סובב את הצינורות במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה של הדגימה ב-100,000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, אספו את הסופרנטנט והוסיפו מיליליטר אחד של שרף עמילוז נקי ורטוב. סובבו את התערובת במשך שעתיים בחום של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן טען את תערובת החלבון עמילוז בעמודות כרומטוגרפיה של זרימת הכבידה. שטפו את שרף העמילוז הקשור לחלבון עם פי 10 מנפח המיטה של מאגר קר קרח C, ואחריו 10 נפחי מיטה של מאגר קר קרח D.Elute eTRPV1 עם שברים של 0.5 מיליליטר עד חמישה מיליליטר של מאגר קר קרח D בתוספת 20 מילי-מולארי מלטוז. בצע את השטיפות והשטיפה בארבע מעלות צלזיוס.באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי חתך של 100 קילו-דלטון, רכז את ה-eTRPV1 המכיל שברים בין שניים ל-2.5 מיליגרם למיליליטר לצורך תיוג. לאחר מכן, הוסף עודף מולרי פי עשרה של תווית ספין MTSSL מתמיסת מלאי של 100 מילי-מולרית ב-DMSO לחלבון המרוכז. חזור על פעולה זו פעמיים כל 30 דקות.שמור את התגובה בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה ו -30 דקות, ולאחר מכן דגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, טען את תווית הספין ל-eTRPV1 על עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל המאוזנת במאגר E, הנשלטת על ידי מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבונית מהירה. אסוף את השברים המכילים eTRPV1 טטרמר.יבש 10 מיליגרם סולקטין באמצעות מאייד סיבובי בוואקום למשך שעה בחום של 40 מעלות צלזיוס. להכנת ליפוזומי אזולקטין, הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר F והפכו את התערובת לסוניקציה למשך 15 דקות או עד שהדגימה הומוגנית. ערער את יציבות הליפוזומים על ידי הוספת DDM לריכוז סופי של שני מילימולר ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר התאמת התערובת לריכוז המיסל הקריטי של DDM, כמפורט בפרוטוקול הטקסט, הכפל את נפח תערובת ליפוזום החלבון עם מאגר F.הסר את חומר הניקוי על ידי הוספה רציפה של שלוש חרוזי פוליסטירן סופגים לא קוטביים במרווחים של שעה עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. טען את התערובת על מסנן עמודים כדי להסיר את החרוזים ולהעביר את תערובת הפרוטאוליפוזום לצינור אולטרה-צנטריפוגה. צנטריפוגה את הדגימות ב-100,000 פעמים G למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-30 מיקרוליטר של מאגר F, ולאחר מכן בצעו מדידות וניתוח ספקטרוסקופיים. המחסום הראשון הוא ניתוח פונקציונלי של מוטציות חד-ציסטאין לפני ביצוע פרוטוקולי ביטוי וטיהור. כאן, תאי hek293 המבטאים TRPV1, eTRPV1 ומוטציות מסוג בר נותחו עבור תגובות קפסאיצין שעוררו באמצעות הדמיית סידן תפרחת.המחסום השני הוא האפיון הביוכימי של מוטציות חד-ציסטאין המסומנות בספין באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל לפני שממשיכים בבנייה מחדש וניתוח ספקטרוסקופי. נקודת הביקורת השלישית היא האפיון הפונקציונלי של מוטציות ספין משוחזרות המסומנות במוטציות ציסטאין בודדות לפני ביצוע ניתוח ספקטרוסקופי. יחסי מתח זרם שנקבעו על ידי שני מהדקי מתח אלקטרודות מביציות Xenopus שהוזרקו במיקרו עם פרוטאוליפוסומים המכילים ספין שכותרתו A702C אותגרו עם pH5 ונחסמו על ידי קפספזפין.לבסוף, ניתן להשיג את הניידות של מוטציות eTRPV1 המסומנות בספין שנקבעו על ידי גל רציף EPR. ספקטרום הנגזרת הראשון מוצג עבור מוטציות ציסטאין המסומנות בספין בתמיסת DDM, ומשוחזרות בליפוזומי אזולקטין. המרחקים והניידות של מוטציות eTRPV1 בספין נקבעו גם הם על ידי DEER.הד DEER והתפלגות המרחק של ספין המסומן מוטציה E651C מוצגת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא, לייפות ולהרכיב מחדש תעלת יונים של יונקים לניתוח ספקטרוסקופי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל היעדר תפקוד חלבון בעת הסרת שאריות ציסטאין, תפוקת חלבון נמוכה וחוסר יציבות חלבון בטיהור ולאחר תיוג ספין, וצבירת חלבון בחומר ניקוי או ליפוזומים.לאחר פיתוחו, פרוטוקולים אלה יאפשרו השגת מרחק ושינויים דינמיים כדי לחקור מודלים מכניסטיים עבור שער פולימודאלי TRPV1.

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזהות חלבונים במוח אשר נקלטות על ידי התחנה הסופית C מלא אורכו של ה-ATP-מגודרת P2X2 קולטנים. הרחבה ויישום שיטתי של גישה זו כל הקולטנים P2X צפוי להוביל להבנה טובה יותר של איתות לקולטן P2X.

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

Isotachophoresis (ITP) היא הפרדה electrokinetic חזקים בטכניקה preconcentration עם יישומים החל איתור הרעלן הכנת המדגם. אנו בודקים את עקרונות פיסיקליים של ITP ו המתודולוגיה של יישום טכניקה זו שני יישומים דוגמה ספציפית: הפרדה וזיהוי של מולקולות קטנות וטיהור של חומצות גרעין מ lysate תרבית תאים.

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי 2 luminometry +-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד תיקון בתאים או במצב נכרת.

Luminometric ושמרים Xenopus ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

שלבי מפתח בתפקוד החלבון, בפרט שינויים בקונפורמציה של עמוד השדרה ותגובות העברת פרוטונים, מתרחשים לעתים קרובות בסולם הזמן של מיקרו-שנייה עד אלפית השנייה. ניתן לחקור תהליכים דינמיים אלה על ידי ספקטרוסקופיה אינפרא אדום של טרנספורמציה פורייה, במיוחד עבור חלבונים שתפקודם מופעל על ידי אור.

העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

כתב יד זה מתאר כיצד לבצע (מולקולה בודדת) Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - מבחנים מבוססי Förster למדידת דינמיקת הקישור בין קולטן אנטיגן של תאי T (TCR) ומולקולות MHC עמוסות פפטידים אנטיגניות כפי שהן מתרחשות בתוך הסינפסה האימונולוגית של תא T במגע עם שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת מישורית פונקציונלית.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס החלבון INAD, בפרוטוקול זה פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה משופרת בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila .

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

פרוטוקול זה מתאר עיבוד תמונה מבוסס iSCAT וגישת מעקב אחר חלקיקים בודדים, המאפשרת חקירה סימולטנית של המסה המולקולרית וההתנהגות המפוזרת של מקרומולקולות המקיימות אינטראקציה עם ממברנות שומנים. הוראות שלב אחר שלב להכנת דגימה, המרה המונית לניגודיות, רכישת סרטים ועיבוד לאחר עיבוד מסופקות לצד הוראות למניעת מלכודות פוטנציאליות.

מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה לאפיון דינמיקת מקרומולקולות הקשורות לממברנה

למדו שיטות לטיהור TRPV1 לניתוח ספקטרוסקופי באמצעות EPR ו-DEER. פרוטוקולים אלו מאפשרים חקר שינויים קונפורמציונליים בערוצי יונים ממליאריים ומספקים מסגרת למחקר מבני בביולוגיה.

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

גלה סרטונים נוספים