Name: Purification efficace et LC-MS/MS-based test développement pour dix-onze Translocation-2 5-méthylcytosine Dioxygenase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Découvrez la purification de la dioxygénase TET2 humaine par chromatographie d'échange d'ions et son analyse par LC-MS/MS. Cette méthode permet d'étudier l'activité enzymatique et les mutations cliniques en épigénétique.

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Cette recherche a été financée par le département américain de la défense sous la forme d’un Idea Award (W81XWH-13-1-0174), l’anémie aplastique & la MDS subvention de la Fondation, et grant UMRB de M.M. Authors remercie Mohit Jaiswal et Subhradeep Bhar clonage initiale de TET2 dans le vecteur pDEST14.

1. le clonage et la Purification de TET2 humaine non balisés Dioxygenase
<ol><li>Clonage humain TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) dans le vecteur de destination de pDEST14 à l’aide de la technique de recombinaison site-spécifique comme décrit précédemment22. Remarque : Les études antérieures ont démontré que le domaine C-terminal TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) est les minimes domaine catalytiquement active21,23. Afin d’exprimer le domaine de dioxygénase TET2 non balisé à l’aide du vecteur pDONR221, séquences Shine Dalgarno et Kozak ont été incorporées dans l’amorce vers l’avant pendant l’ACP (tableau 1).</li>
	<li>Pour la transformation bactérienne, ajouter 1 µL de vecteur d’expression pDEST14 recombinant contenant non balisés humaine TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) à 100 µL de chimiquement compétent e. coli BL21 (DE3) de cellules dans un tube de 1,7 mL. Garder le mélange sur la glace pendant au moins 15 minutes suivi d’un choc thermique à 42 ° C pendant 30 s dans un bain d’eau.<ol>
<li>Immédiatement après un choc thermique, garder les cellules retour sur la glace pendant au moins 2 min. Suite à cela, ajouter 250 µL de bouillon super optimal avec la répression catabolique (S.O.C médias) aux cellules. Incuber les cellules bactériennes pendant 1 h à 37 ° C dans un agitateur.</li>
		<li>Après incubation, tournez en bas les cellules par centrifugation du tube à 9 000 x g pendant 1 min. jetez 70 % surnageant de pipetage et dissoudre le culot à gauche sur les médias.</li>
		<li>Étendre la suspension de cellules sur une gélose de bouillon (LB) de Luria contenant 100 ampicilline µg/mL. Incuber les plaques pendant 16 h à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Choisir une colonie isolée et il inoculer dans 10 mL de médias LB-ampicilline dans un tube de 50 mL. Incuber les tubes à 37 ° C dans un agitateur pour la nuit. Par la suite, utiliser 100 µL de la culture du tube de 50 mL pour ensemencer 100 mL de médias LB-ampicilline. Incuber le ballon à 37 ° C dans un agitateur à 180 tr/min et l’utiliser comme culture primaire. Lendemain, permet d’ensemencer 15 flacons, chaque média 600 mL LB-ampicilline contenant 6 mL de chaque culture primaire. Maintenant, Incuber 15 flacons à 37 ° C dans un agitateur à 180 tr/min. Remarque : Pour la vérification des clones transformées, effectuez digestion de séquençage ou de restriction de l’ADN avec l’ADN de plasmide isolé.</li>
	<li>La densité de culture bactérienne, mesurez son OD600 à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque la culture atteint une densité de 0,8 à OD600, induit l’expression de la protéine TET2 avec 300 µL de 1 M (concentration finale de 0,5 mM de 600 mL) IPTG dans chaque fiole et accroître davantage la culture pendant 16 h à 17 ° C.</li>
	<li>Après 16 h, transférer la culture bactérienne à la centrifugeuse bouteilles. Centrifuger la culture bactérienne exprimant l’enzyme TET2 à 5 250 g pendant 45 min. utilisation le culot bactérien pour la purification de TET2. Remarque : Effectuez toutes les étapes de purification des protéines restantes sur la glace ou à 4 ° C.</li>
	<li>Resuspendre le culot bactérien dans 100 mL de 50 mM MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acide) buffer, pH 6 et laisser agir pendant 5 x 30 s à la puissance 20 avec refroidissement intervalles de 60 s.</li>
	<li>Spin le lysat à 5 250 g pendant 45 min. récupérer le surnageant contenant l’enzyme TET2 soluble et traverse de 0,45 µm filtre avant du charger sur un système FPLC. Remarque : Dans ces expériences, l’enzyme TET2 était très stable, mais si nécessaire une protéase inhibiteur cocktail contenant 1 mM benzamidine-HCl, fluorure de sulfonyle de 1 mM (PMSF) et 0,5 mM 1,10 -o- phénanthroline peut être ajouté à la cellule lysate de prévenir la dégradation des enzymes TET2. Évitez d’utiliser des EDTA ou EGTA dans l’inhibiteur cocktail car ceux-ci peuvent interférer avec la chromatographie échangeuse de cations suivantes.</li>
	<li>Pack de 30 mL de résine échangeuse de cations forts dans une colonne FPLC. Equilibrer la colonne avec 10 volumes de lit du tampon de lavage (tampon MES 50 mM, pH 6) au débit constant de 0,3 mL/min à l’aide d’un système FPLC.</li>
	<li>Charger le clarifié lysat sur la colonne préalablement équilibré et lavage avec des volumes de lit ∼10 de tampon de lavage jusqu'à ce que le débit devient clair.</li>
	<li>Éluer les TET2 à l’aide d’un 0-100 % dégradé de la mémoire tampon de lavage dans la mémoire tampon d’élution (tampon MES 50 mM, pH 6, 1 M NaCl) en 15 volumes de lit suivie d’exploitation au tampon d’élution de 100 % pour les volumes de deux lits. NOTE : Prélever des échantillons (100 µL) de cellule lysat avant et après la colonne de chargement ainsi que toutes les fractions d’élution et analyser sur 10 % solution SDS-PAGE.</li>
	<li>Mettre en commun les fractions contenant des protéines TET2, geler sec, dissoudre la palette d’enzyme dans 10 mL d’eau et conserver à-80 ° C.</li>
</ol>2. 5mC oxydation par TET2 Dioxygenase
<ol><li>Effectuer toutes les réactions de déméthylation en triple avec 3 µg de substrat (ADN bicaténaire 25-mer, tableau 2).<ol>
<li>Ajouter 100 µg d’enzyme purifiée de TET2 dans 50 µL de tampon de réaction totale contenant 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG (2-oxoglutarate/α-cétoglutarate) et l’ascorbate de 2 mM et incuber à 37 ° C pendant 1 h21.</li>
		<li>Étancher TET2 catalysé les réactions d’oxydation 5 µl de 500 mM EDTA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après la trempe des réactions TET2, préparer les échantillons pour analyse LC-MS/MS en séparant l’ADN du mélange réactionnel de TET2 à l’aide de colonnes de purification oligo.<ol>
<li>Ajouter 100 µL de tampon de liaison oligo à 55 µL de réaction trempée.</li>
		<li>Suite à cela, ajouter 400 µL d’éthanol à 100 % au mélange. Passez ce mélange à travers une colonne de liaison oligo.</li>
		<li>Lavez l’ADN lié avec 750 µL de tampon de lavage et éluer dans 20 µL d’eau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digérer l’ADN isolé avec 2 unités de DNase I et 60 unités de nucléase S1 à 37 ° C pendant 12 h pour produire des nucléosides-monophosphates individuels.</li>
	<li>Après digestion, ajoutez 2 unités de la phosphatase alcaline intestinale de veau (CIAP) dans les échantillons et incuber pendant plus de 12 h à 37 ° C, à supprimer les groupes de phosphate terminal de nucléoside-monophosphates d’obtenir des nucléosides.</li>
	<li>Quantifier tous les nucléosides, surtout mis à jour le cytosines, en utilisant la méthode CL-SM/SM décrite ci-dessous.</li>
</ol>3. quantitative analyse LC-MS/MS-based Development
<ol><li>Préparer la solution mère de 100 µM de tous les nucléosides modifiés cytosine [5-méthyl-2′-désoxycytidine (5mdC), 5-hydroxyméthyl-2′-désoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2′-désoxycytidine (5fdC) et 5-carboxy-2′-désoxycytidine (5cadC)] et ADN normal des bases (adénine, thymine, cytosine et guanine) en eau de qualité CLHP pour l’élaboration de la méthode CL-SM/SM.</li>
	<li>Optimiser les paramètres de MS/MS de nucléoside dépendant en infusant des solutions mères, un à la fois, dans le spectromètre de masse à un débit de 10 µL/min en EMS mode de balayage. Optimiser les paramètres suivants : Declustering de potentiel (DP), entrée potentielle (EP), Collision cellule entrée potentielle (CEP), l’énergie de Collision (EC) et Collision cellule sortie potentielle (CXP) pour chaque nucléoside d’ADN en utilisant automatisé optimisation quantitative fonction du logiciel.</li>
	<li>Optimiser les paramètres MS/MS dépend de la source en injecter 10 µL de solution utilisant un gradient avec 25 % de solvant B à un débit de 0,3 mL/min où solvant A est l’acétate d’ammonium de 10 mM (pH 4,0) et solvant B est de 20 % d’acétonitrile avec de l’acétate d’ammonium 10 mM (pH 4,0). Optimiser les paramètres suivants : rideau de gaz (ACTU) : 10-50, température : 0-600 ° C, débit de gaz 1 (GS1) : 0-50, débit de gaz 2 (GS2) : 0-50, Dissociation activée par collision (CAD) : basse-moyenne-haute, Ion pulvérisateur tension (IS) : 4000-5500 pour chaque nucléoside d’ADN à l’aide de manuel fonction d’optimisation quantitative du logiciel en mode FIA (Flow Injection Analysis).</li>
	<li>Pour séparer tous les nucléosides d’ADN huit, effectuer la chromatographie en phase liquide en utilisant le gradient suivant : 0 % solvant B (0-2 min), 0-20 % de solvant B (2-5 min), 20-60 % de solvant B (5-9 min), solvant de 60-0 % B (9-10 min) et ensuite équilibrer avec solvant A pendant 5 min pour un débit de 0,3 mL/min sur une colonne C18 (granulométrie : 5 µm, taille des pores : 120 Å).</li>
	<li>En utilisant les paramètres de MS/MS optimales (étape 3.2 et 3.3) couplés avec le gradient susmentionné de chromatographie en phase liquide (étape 3.4), déterminer la linéarité de la réponse, limite de détection (LD) et le seuil de quantification (PPQM) en utilisant un double dilution en série d’un mélange standard de 100 µM, contenant tous les huit nucléosides. Dessiner des courbes standard pour tous les huit nucléosides de l’ADN.</li>
	<li>Détecter et quantifier tous les nucléosides, surtout mis à jour le cytosines, produites à l' étape 2.4 à l’aide de la méthode LC-MS/MS et les courbes d’étalonnage.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier à déclarer.

Des mutations du gène TET2 sont quelques-uns des changements génétiques plus souvent détectés chez les patients atteints de divers cancers hématopoïétiques. À ce jour des centaines de différentes mutations TET2, incluent un non-sens, cadre-Maj et mutations faux-sens, ont été identifiées dans les patients de12. Les patients présentant des mutations de TET2 montrent des niveaux faibles de génomique 5hmC dans la moelle osseuse, comparée à ceux qui wt-TET214. Mutant <e...

La position de C5 des bases cytosine dans dinucléotides est le site de méthylation prédominant (5mCpG) dans les génomes de mammifères,1. En outre, un certain nombre d’études récentes ont mis au jour une vaste méthylation de cytosine C5 (5mC) dans des sites non-CpG (5mCpH, où H = A, T, ou C)2,3. modification de 5MC sert un silencieux transcriptionnel rétrotransposons endogènes et gènes promoteurs3,4,5. Méthylation de l’ADN à 5mC joue également un rôle important dans l’inactivation du chromosome X, l’empreinte génétique, reprogrammation nucléaire et expression de gène de tissu-spécifique5,6,7. La méthylation de la cytosine postées sur la C5 est réalisée par ADN méthyltransférases, et mutations de ces enzymes causent des défauts importants de développement8. L’enlèvement des marques 5mC commencent par TET1-3 5mC oxydases9,10. Ces dioxygénases TET-famille convertissent 5mC 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) par oxydation séquentielle étapes11,12,13. Enfin, thymine-DNA glycosylase remplace 5FC ou 5caC de cytosine non modifiée à l’aide de la base excision repair voie11.
Le gène humain de la TET2 a été identifié comme un gène muté fréquemment dans diverses malignités hématopoïétiques dont myelodysplastic syndromes (MDS)14,15,16, MDS-syndromes myéloprolifératifs () néoplasmes MDS-MPN) et la leucémie myéloïde aiguë (AML) originaires du MDS et MDS-NPP16. Les niveaux de modification 5hmC dans la moelle osseuse ADN sont plus faibles chez les patients présentant des mutations de TET2 par rapport à ceux qui ont le type sauvage (wt)-TET214. Un certain nombre de groupes ont développé des modèles de souris de TET2-knockout pour élucider leur rôle dans l’hématopoïèse normale et transformation myéloïde17,18,19,20. Ces souris avec des mutations dans le gène de TET2 ont été initialement normale et viable, mais qui se manifeste de diverses malignités hématopoïétiques comme ils âgés causant leur mort prématurée. Ces études ont montré le rôle important joué par la wt-TET2 dans la différenciation hématopoïétique normale. Dans ces modèles de souris hétérozygotes de cellules souches hématopoïétiques (TET2+/- CSH) et l’homozygote TET2- / - CSH avait un avantage concurrentiel sur les homozygotes wt-TET2 CSH à repeupler les lignées hématopoïétiques comme les deux TET2+/- et TET2- / - CSH développé diverses malignités hématopoïétiques17,18. Ces études démontrent que Sim1 de TET2 dioxygénase altère le développement des CSH et se traduit par des malignités hématopoïétiques.
Semblables à des souris présentant des mutations dans le gène TET2, la plupart des patients de leucémie manifestent Sim1 TET2 dioxygénase dactivité. Ces mutations somatiques hétérozygotes pour la plupart comprennent mutations cadre-Maj et non-sens dispersées dans tout le corps de gène de TET2 tandis que des mutations faux-sens qui sont les plus groupés dans le domaine de dioxygénase12. A ce jour, peu caractérisation de wt - et mutant-TET2 est rapportée dans la littérature principalement en raison de difficultés liées à la production de TET2 dioxygénase et son dosage21. Nous rapportons ici une simple purification seule étape de native TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse d’ions. En outre, un test quantitatif de la LC-MS/MS a été optimisé et utilisé pour mesurer l’activité enzymatique de native TET2 dioxygénase.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Carbosynth</td><td>FH31182</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de fer(II) heptahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8633</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-Acide cétoglutarique (acide 2-oxoglutarique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1750</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo propre et concentrateur</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>S1 Nucléase</td><td>Thermo Scientific</td><td>ENO321</td><td></td></tr><tr><td>CIAP (phosphatase alcaline intestinale de veau)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>LB Media</td><td>Affymetrix</td><td>J75852</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Carbosynth</td><td>EI05931</td><td></td></tr><tr><td>MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td><td>Carbosynth</td><td>FM37015</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>SP Sepharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-002-934</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxy-5-methylcytidine</td><td>TCI</td><td>D3610</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td><td>TCI</td><td>D4220</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sel de sodium</td><td>Berry & ampère; Associés</td><td>PY 7593</td><td></td></tr><tr><td>5-Formyl-2'-désoxycytidine</td><td>Berry & Associés</td><td>PY 7589</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxycytidine</td><td>Berry & Associates</td><td>PY 7216</td><td></td></tr><tr><td>2'-Déoxyadénosine</td><td>Carbosynth</td><td>ND04011</td><td></td></tr><tr><td>2'-Déoxyguanosine</td><td>Carbosynth</td><td>ND06306</td><td></td></tr><tr><td>2'-Déoxythymidine</td><td>VWR Life Science</td><td>97061-764</td><td></td></tr><tr><td>Technologie Gateway</td><td>Thermo Fisher</td><td>11801016</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Allegra X-15R centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator 550</td><td>Fisher Scientific</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>&Auml ; Système KTA FPLC</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>18116468</td><td></td></tr><tr><td>Système de lyophilisation FreeZone 4.5</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de purification Zymo Oligo</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>BDS Hypersil C18 colonne</td><td>Keystone Scientific, INC</td><td>105-46-3</td><td></td></tr><tr><td>3200 Q-Trap spectromètre de masse</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp ;</td><td>HPLC de Shimadzu&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK16/20 Colonne FPLC</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>28988937</td><td></td></tr></tbody></table>

purification efficace et lc-ms/ms-based test développement pour dix-onze translocation-2 5-méthylcytosine dioxygenase

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

La régulation de la transcription épigénétique médiée par la 5-méthylcytosine (5mC) a joué un rôle essentiel dans le développement eucaryote. La déméthylation de ces marques épigénétiques s’effectue par oxydation séquentielle de dix-onze translocation dioxygénases (TET1-3), suivie par la thymine-DNA glycosylase dépendant base excision de réparation. L’inactivation du gène TET2 due à des mutations génétiques ou par d’autres mécanismes épigénétiques est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de divers cancers, surtout des malignités hématopoïétiques. Nous décrivons ici une purification efficace seule étape d’enzymatiquement actif non balisés humaine TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse de cations. Nous fournissons également une approche liquid chromatography-spectrométrie de masse (LC-MS/MS) qui peut séparer et quantifier les quatre bases normales de l’ADN (A, T, G et C), ainsi que les quatre bases de cytosine mis à jour le (méthyl-5, 5-hydroxyméthyle, formyl-5 et 5-carboxylique). Ce test peut être utilisé pour évaluer l’activité de type sauvage et mutant TET2 dioxygénases.

Modification dynamique de 5mC dans l’ADN par TET-famille dioxygénases joue un rôle important dans les règlements transcriptionnelles épigénétiques. TET2 dioxygénase est fréquemment muté dans diverses malignités hématopoïétiques12. Afin d’étudier le rôle de l’enzyme de TET2 dans le développement normal et la maladie, nous avons cloné son domaine catalytiquement actif minimal sans n’importe quelle balise d’affinité dans le vecteur de pDEST1422...

Nous présentons ici un protocole pour une purification efficace seule étape de l’humain sans balise active dix-onze translocation-2 (TET2) 5-méthylcytosine dioxygénase utilisant la chromatographie échangeuse d’ions et son dosage à l’aide d’une masse en tandem par chromatographie liquide spectrométrie (LC-MS/MS)-approche de base.

Purification efficace et LC-MS/MS-based test développement pour dix-onze Translocation-2 5-méthylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans l’épigénétique et TET2 2 2 2-Méthylcytosine champ de déméthylation une telle analyse de l’activité des mutations normales et cliniques TET2. Le principal avantage de cette technique est que le TET2 natif peut être purifié en une seule étape, et son activité peut être analysée en termes de formation des trois produits. Plusieurs étudiants diplômés démontreront la procédure.La purification des protéines sera effectuée par Chayan Bhattacharya, l’analyse TET2 d’Aninda Sundary Dey et l’analyse LC-MS/MS par Navid Ayon. Pour la transformation bactérienne, ajouter un microlitre de vecteur d’expression de destination pDEST 14 recombinant contenant de la dioxygénase humaine TET2 non étiquetée à 100 microlitres de cellules E.coli BL21 DE3 chimiquement compétentes dans un tube de 1,7 millilitre. Après incubation sur la glace pendant au moins 15 minutes, la chaleur choque le mélange à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes dans un bain d’eau.Immédiatement après le choc thermique, remettre les cellules sur la glace pendant au moins deux minutes. Par la suite, ajouter 250 microlitres de bouillon super optimal avec la répression catabolite

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Composés de capture sont trifonctionnel petites molécules afin de réduire la complexité du protéome par fonctionnels réversibles petite molécule de protéine d'interaction suivie par la photo-réticulation et de purification. Ici, nous utilisons un composé de capture avec...

Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

Le EpiMark 5-HMC et le kit d'analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d'un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l'ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.

Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

Atteindre un niveau compréhension des systèmes de processus cellulaires est un objectif de la biologie cellulaire moderne. Nous décrivons ici les stratégies pour les journalistes luciférase multiplexage de diverses fonctions cellulaires points d'extrémité pour interroger la fonction des gènes en utilisant l'échelle du génome bibliothèques ARNi.

Une plateforme de criblage à base de luciférase multiplexé pour interroger associée au cancer transduction du signal dans des cellules cultivées

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) peut enzymatiquement enlever l'oxygène diatomique libre d'un système aqueux utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA). Ce protocole décrit l'expression, la purification, et l'analyse d'activité de cette enzyme de récupération d'oxygène.

Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une méthode de séquençage basée sur la LC-MS qui peut être utilisée comme méthode directe pour séquencer l’ARN court (&lt;35 nt par exécution) sans intermédiaire d’ADNc, et comme méthode générale pour séquencer différentes modifications nucléotidiques dans une seule étude avec une précision de base unique.

2D-HELS MS Seq : une méthode générale basée sur LC-MS pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’ARN avec différentes modifications nucléotidiques

Les ADN méthyltransférases sont des cibles potentielles de médicaments anticancéreux. Ici, un protocole est présenté pour évaluer les petites molécules pour l’inhibition de l’ADN méthyltransférase. Ce test utilise une endonucléase pour coupler la méthylation de l’ADN à la génération de fluorescence et permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel.

Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

Un protocole pour la détection sensible et quantitative de l’activité de la topoisomérase 1 à l’aide du test de détection de l’activité enzymatique améliorée du cercle roulant est décrit. La méthode permet de détecter l’activité de la topoisomérase 1 à partir de composants purifiés ou d’extraits cellulaires/tissulaires. Ce protocole a de nombreuses applications dans tous les domaines impliquant la détection de l’activité enzymatique.

Détection simple et rapide de l’activité de la topoisomérase 1 basée sur l’amplification du cercle roulant dans des échantillons biologiques bruts

Ici, nous présentons une compilation de tests pour mesurer directement la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères indépendamment de leur capacité à consommer de l’oxygène moléculaire.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

Le présent protocole met en évidence une méthode modifiée pour détecter et quantifier les réticulations ADN-protéines (DPC) et leurs modifications post-traductionnelles (PTM), y compris l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation induites par les inhibiteurs de la topoisomérase et par le formaldéhyde, permettant ainsi l’étude de la formation et de la réparation des DPC et de leurs PTM.

Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

Un flux de travail analytique basé sur la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) pour une analyse ascendante hautement fiable et hautement reproductible des modifications et de l’identification des histones en fonction des principaux paramètres (temps de rétention [RT], section efficace de collision [CCS] et rapport masse/charge précis [m/z]).

Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol

Découvrez la purification de la dioxygénase TET2 humaine par chromatographie d'échange d'ions et son analyse par LC-MS/MS. Cette méthode permet d'étudier l'activité enzymatique et les mutations cliniques en épigénétique.

Purification efficace et LC-MS/MS-based test développement pour dix-onze Translocation-2 5-méthylcytosine Dioxygenase

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