Name: Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Découvrez une méthode de criblage 2-hybride de levure en lot permettant de comparer les profils d'interactions de plusieurs protéines appâts grâce au séquençage profond. Cette approche révèle les interactomes différentiels pour étudier les processus moléculaires et cellulaires.

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Nous remercions le personnel au sein de l’Institut de génétique humaine de séquençage et de préparation de bibliothèque NGS. Nous remercions Einat Snir pour son expertise dans la préparation des fragments de banque génomique pour la bibliothèque de plasmide Y2H faite ici. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health : NIH R21 EB021870-01 a 1 et de subvention de projet de recherche FNS : 1517110.

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
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<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
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<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li>
<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
<li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li>
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<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22485921">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
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<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li>
<li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Ici, nous fournissons un guide pour savoir comment effectuer les dosages Y2H en lot à l’aide de méthodes optimisées. Il y a quelques étapes cruciales dans la procédure pour s’assurer que la population de levures qui seraient placés sous la sélection est représentatif de la bibliothèque de départ et que suffisamment de la population de levures départ sert à subir une sélection afin de limiter la variabilité . Ce qui est important, ces repères sont relativement faciles à réaliser aux côtés d’adapter les méthodes et les mat...

Une compréhension complète des processus biologiques de cellule s’appuie sur la recherche des réseaux d’interactions protéiques qui sous-tendent leurs mécanismes moléculaires. Une approche pour identifier les interactions entre protéines est la levure 2-hybride (Y2H), qui fonctionne en assemblant un facteur de transcription chimérique fonctionnement une fois que les deux domaines de la protéine d’intérêt lient à un autre1. Un écran Y2H typique est effectué en créant une population de levures qui abrite les deux une bibliothèque des plasmides codant des protéines qui interagissent, fusionnés à un activateur de la transcription (e.g., « la proie » protéine de fusion) et un plasmide de donnée « appât » composé de la protéine d’intérêt fusionné à un domaine de liaison de l’ADN (par exemple, le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 qui se lie à la séquence activatrice Gal4-amont). L’un des principaux avantages de l’approche Y2H est qu’il est relativement facile et peu coûteux à réaliser dans un laboratoire typique équipé pour les travaux courants de biologique moléculaire2. Toutefois, lorsque traditionnellement effectué, un utilisateur échantillonne des colonies individuelles qui surviennent après la sélection d’une interaction positive de Y2H. Cela limite fortement le nombre de clones de « proies » de bibliothèque qui peuvent être interrogés. Ce problème est aggravé lorsque l’abondance d’une proie interaction particulière est très élevé par rapport aux autres, ce qui diminue les chances d’apercevoir l’interaction de plasmides de proies de faible abondance.
Une solution pour utiliser le principe Y2H dans une couverture complète du protéome est l’utilisation d’une matrice au format dans lequel un tableau contenant des plasmides de proies individuels connus peut être interrogé numériquement. Toutefois, une telle approche exige une infrastructure qui n’est pas facilement accessible et le plus rentable pour les chercheurs qui s’intéressent à la définition de l’interactome d’un petit nombre de protéines ou domaines3. En outre, bibliothèques de proies très complexe qui peuvent coder plusieurs fragments de protéines qui interagissent augmenterait la taille de tels tableaux matrice aux tailles impraticables. Une alternative consiste à effectuer des essais avec des bibliothèques complexes en lots et d’évaluer la présence de clones interagissants avec le séquençage haut débit parallèle massive4. Ceci peut être appliqué pour doser la présence de plasmides de proies qui se posent dans plusieurs colonies au moyen d’un typique Y2H formaté approche dans laquelle la levure cellules abritant une paire d’interaction des protéines de fusion sont autorisés à cultiver sur un plaque5,6. Cette idée générale peut être accentuée pour augmenter la requête de deux appâts multiples et la proie de composants dans le même temps7,8.
Pourtant, nombreuses enquêtes exigent qu'une plus facile encore plus concentré efforts sur quelques protéines « appâts » et puissent bénéficier davantage par une requête exhaustive et semi-quantitative d’une bibliothèque de proies complexe unique. Nous avons développé et validé une approche pour effectuer des études d’interaction de protéine à grande échelle en utilisant un principe Y2H lot format4. Celui-ci utilise le taux d’expansion d’un plasmide de proie particulière en tant que proxy pour la force relative de Y2H interaction9. Séquençage en profondeur de tous les plasmides au sein d’une population soumise à une croissance normale ou des conditions de croissance sélective produit une carte complète de clones qui donnent des interactions Y2H fortes et faibles. Le répertoire d’interacteurs pouvant être obtenu et directement comparé à travers plusieurs plasmides d’appât. Le flux de travail qui en résulte, appelé DEEPN (dynamique d’enrichissement pour les réseaux d’évaluation des protéines) permet ainsi d’identifier les interactomes différentiels des bibliothèques proies même d’identifier des protéines, permettant la comparaison entre une protéine contre un autre.
Ici, nous démontrons DEEPN et introduire des améliorations dans les méthodes de laboratoire qui facilitent son utilisation, qui sont décrites dans la Figure 1. Des améliorations notables incluent :
Génération de populations de levures proies. Une des exigences clés de DEEPN génère des populations de levure avec des appâts différents plasmides qui ont la même distribution des bibliothèques de proies du plasmide. Les populations de base équivalent de la bibliothèque de plasmide de proies sont essentielles pour faire des comparaisons précises entre les interactomes des appâts différents. C’est plus facilement atteintes qu’un plasmide de bibliothèque occupe déjà une population de levure haploïde et pénétrant un plasmide d’appât donné de cette population est obtenue par croisement pour produire une plante diploïde. Ici, nous fournissons un guide clair dans Comment faire de ces populations en utilisant les librairies commerciales logés chez la levure haploïde. Bien que nous avons trouvé des méthodes qui génèrent un grand nombre d’espèces diploïdes, l’efficacité globale d’accouplement de ces souches de levures commerciales bibliothèque contenant était faible. Par conséquent, nous avons construit une nouvelle souche qui peut accueillir des bibliothèques de la proie qui donne beaucoup plus de diploïdes par réaction d’accouplement.
New jeu de plasmides d’appât. Plusieurs actuelles plasmides exprimant des protéines de fusion « appât » composés de la protéine d’intérêt et un domaine de liaison à l’ADN sont axés sur les 2µ, leur permettant d’amplifier leur nombre de copies. Ce nombre de copies peut être assez variable dans la population et mener à la variabilité de la réponse transcriptionnelle Y2H. Cela pourrait à son tour incliner la capacité de mesurer la force de l’interaction protéine donnée basée sur la réaction de la croissance des cellules sous sélection. Cela peut être en partie adresse à l’aide d’un plasmide de faibles copies, dont certains ont été décrits précédemment tels que le pDEST32 disponible dans le commerce10. Nous avons construit un nouveau plasmide d’appât (pTEF-GBD) qui produit des protéines de fusion Gal4-DNA-binding domain dans un plasmide d’axée sur les centromères faible copie TRP1 porteuses du gène de résistance Kanr qui permet aussi de clonage de fragments d’appâts les deux en amont et en aval du domaine de liaison à l’ADN de Gal4.
Bibliothèque de fragment nouveau High-Density Y2H. Nous avons construit un nouveau plasmide aux bibliothèques de proies Y2H maison et utilisé pour construire une bibliothèque Y2H hautement complexe, faite de fragments cisaillés au hasard de l’ADN génomique de Saccharomyces cerevisiae. Le séquençage a révélé que cette bibliothèque plus 1 million de différents éléments, beaucoup plus complexes que la levure décrite précédemment Y2H génomique plasmidique de bibliothèques11. Avec cette nouvelle bibliothèque, nous avons pu montrer que le flux de travail DEEPN est assez robuste pour accueillir des bibliothèques complexes avec plusieurs plasmides différents de manière fiable et reproductible.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Plateforme de séquençage profond Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonaux anti-HA</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>Anticorps primaire pour détecter l’expression de HA dans les constructions pGal4AD</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonaux anti-myc</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Anticorps primaire pour détecter l’expression de MYC dans les constructions pTEF-GBD</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène Glycol 3350, poudre</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc vendu par Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>ADN porteur pour la transformation de la levure section 3.2.1.</td></tr><tr><td>Monosulfate de kanamycine</td><td>Research Products International</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>utilisé pour la fabrication de gels d’agarose d’ADN</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Research Products International</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Research Products International</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de lithium dihydraté</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sel de sodium</td><td>Research Products International</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure en poudre Produits</td><td>de recherche International</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Base d’azote de levure (sulfate d’ammonium) sans acides aminés</td><td>Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>utilisé pour la fabrication de plaques de média dans la section 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiologique</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Phénol :Chloroforme :IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>bleu de bromophénol</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Méthode d’assemblage rapide pour le clonage des plasmides dans la section 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Utilisé pour l’amplification des produits pour l’assemblage Gibson dans la section 2.3 ainsi que pour la préparation des échantillons pour le séquençage profond DEEPN dans la section 6.2.1</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Utilisé pour la purification des produits PCR dans la section 6.2.3</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel d’ADN Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Utilisé pour la purification du pTEF-GBD digéré dans la section 2.1</td></tr><tr><td>KAPA Hyper Prep Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>Kit de préparation pour le séquençage profond Optimisation des</td></tr><tr><td>codons</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimisation des codons</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks Technologies</td><td>de l’ADN intégrées Fragments d’ADN</td><td></td><td>utilisés pour le clonage dans la section 2.2</td></tr><tr><td>Chaînes Fragments</td> d’ADN <td>Thermofisher</td><td></td><td>utilisés pour le clonage dans la section 2.2</td></tr><tr><td>Trousse de mini-préparation de l’ADN plasmidique GenCatch</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>Utilisé pour préparer des quantités d’ADN dans la section 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Ultra-sonicateur haute performance</td><td>Covaris</td><td></td> en section 7</tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>Technologies d’ADN intégrées ou Thermofisher</td><td></td><td>utilisées pour l’amplification et le séquençage de l’insert 5' pTEF-GBD pendant la construction du plasmide</td></tr><tr><td>oligonucléotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies ou Thermofisher</td><td></td><td>utilisé pour l’amplification et le séquençage de la pcr 5' insert pTEF-GBD pendant la construction du plasmide</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies ou Thermofisher</td><td></td><td>utilisé pour l’amplification et le séquençage de l’insert 3' pTEF-GBD pendant la construction du plasmide</td></tr><tr><td>oligonucléotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>Technologies d’ADN intégrées ou Thermofisher</td><td></td><td>utilisées pour l’amplification et le séquençage de l’insert 3' pTEF-GBD pendant la construction du plasmide</td></tr><tr><td>oligonucléotide 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies ou Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer utilisé pour l’amplification d’insertion de l’oligonucelotide pGAL4AD</td></tr><tr><td>5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'</td><td>Technologies d’ADN intégrées ou Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer utilisé pour l’amplification d’insert de l’oligonucelotide pGAL4AD</td></tr><tr><td>5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies ou Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer utilisé pour l’amplification d’insertion de l’oligonucelotide pGADT7</td></tr><tr><td>5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>Integrated DNA Technologies ou Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer utilisé pour l’amplification d’insertion de la souche de levure pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA : Banques génomiques et une souche hôte conçue pour une sélection bi-hybride très efficace chez la levure. GÉNÉTIQUE 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2 ::GAL1-HIS3 met2 ::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmide</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Plasmide d’expression du domaine d’activation Gal4</td></tr><tr><td>100 mm boîtes de Pétri</td><td>Kord-Vallmark vendues par VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>Fiole Erlenmeyer en PYREX 125 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Fiole Erlenmeyer en PYREX</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1 000 mL Fiole Erlenmeyer en PYREX</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2 000 mL Fiole Erlenmeyer en PYREX</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>Tube de culture jetable 20 X 150 mm</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Aide à la pipette</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette sérologique</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipette sérologique</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipette sérologique</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1 000 mL PYREX Bécher Griffin</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1 000 mL PYREX Bouteille de stockage</td> Fisher <td>Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué de 1 000 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Dispositifs</td><td></td> moléculaires <td>utilisés pour mesurer la densité optique des cellules</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Spectrophotomètre Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>utilisé pour quantifier la quantité d’ADN</td></tr><tr><td>UV électronique transilluminateur</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>utilisé pour visualiser l’ADN dans un gel d’agarose au bromure d’éthidium</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G P200</td><td></td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 et micro ; L Pointes de pipette à faible rétention</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; LLow Pointes de pipette de rétention</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro ; L XL Pointes de pipette à faible rétention</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube conique</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>Racleur de cellules</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Microtubes à centrifuger</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs en bois</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse Eppendorf 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>Microcentrifugeuse</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>centrifugeuse de paillasse</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP linked whole Ab (from donkey)</td><td>GE Soins de santé</td><td>NA934-1ML</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Amersham ECL IgG de souris, AB entier lié à la HRP (provenant de moutons)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrat chimiluminescent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>Solution de détection ECL</td></tr><tr><td>Incubateur Isotemp Incubateur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Incubateur à secousses</td></tr><tr><td>Isotemp Bain-marie à commande numérique Modèle 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Bain d’eau</td></tr><tr><td>Y2H Bibliothèque d’ADNc de souris dans Y187 (tissu de casserole)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>Bibliothèque d’ADNc de</td></tr><tr><td>souris Y2H disponible dans le commerce Y187 (cerveau de souris)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>Bibliothèque d’ADNc disponible dans le commerce</td></tr><tr><td>pGADT7 AD Vector</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>vecteur AD disponible dans le commerce hébergeant de nombreuses banques d’ADNc</td></tr><tr><td>Vecteur pGBKT7 DNA-BD</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>disponible dans le commerce Vecteur DNA-BD</td></tr><tr><td>Biolase ADN polymérase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>ADN polymérase utilisée pour la section 2.4</td></tr><tr><td>Thermocycleur GeneMate GCL-60</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>machine PCR TempAssure</td></tr><tr><td>0,5 mL Tubes PCR</td><td>États-Unis Scientifique</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les interactions protéine

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Dépistage des interactions protéine-protéine à l’aide de l’essai 2-hybride de levure a longtemps été un outil efficace, mais son utilisation a été largement limitée à la découverte des Interactiens de haute affinité qui sont hautement enrichi dans la bibliothèque des candidats qui interagissent. Dans un format traditionnel, le dosage de 2-hybride de levure peut produire trop de colonies à analyser lorsque menée à la raideur bas où se trouvent les Interactiens faible affinité. Par ailleurs, sans un interrogatoire exhaustif et complet de la bibliothèque même contre des plasmides différents appâts, une analyse comparative ne peut être atteint. Bien que certains de ces problèmes peuvent être traités à l’aide de bibliothèques en proie, le coût et l’infrastructure nécessaire pour faire fonctionner ces écrans peuvent être prohibitifs. Comme alternative, nous avons adapté le test 2-hybride de levure pour découvrir en même temps des dizaines de transitoire et interactions de protéine statique au sein d’un seul écran utilisant une stratégie appelée DEEPN (enrichissement dynamique pour réseaux d’évaluation des protéines), qui incorpore le séquençage à haut débit et calcul de suivre l’évolution d’une population de plasmides codant les partenaires qui interagissent. Nous décrivons ici personnalisées réactifs et protocoles qui permettent un écran DEEPN à exécuter facilement et à moindre coût.

Le dosage Y2H a été largement utilisé pour trouver des interactions de protéine : protéine et plusieurs adaptations et systèmes ont été développés. Pour l’essentiel, les mêmes considérations qui aident à assurer le succès de ces approches précédentes sont importantes pour DEEPN. Parmi les critères importants : assurer l’expression du domaine de liaison à l’ADN des protéines de fusion, un faible bruit de fond des rayonnements non essentiels à assurer son + croissance dans les diploïdes con...

Traitement par lots des écrans 2-hybride de levure permet une comparaison directe des profils interaction de plusieurs protéines d’appât avec un ensemble très complexe de protéines de fusion de proies. Nous décrivons ici des méthodes raffinées, nouveaux réactifs et comment mettre en œuvre leur utilisation pour ces écrans.

Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Cette méthode utilise le principe du système 2-hybride de levure dans les deux populations pour identifier les interactions protéine-protéine qui répondent à des questions clés sur une variété de processus moléculaires et cellulaires. Cette technique exploite le séquençage profond pour voir les interactions d’une protéine par rapport à une autre. Comme cette approche est conçue pour effectuer des comparaisons parallèles, elle peut identifier des ensembles de protéines qui interagissent avec une protéine par rapport à une autre ou différentes confirmations de la même protéine ou lors du typage d’une version mutante causant une maladie, pour révéler des interactomes différentiels.Un nouveau plasmide d’appât à 2 hybrides de levure, pTEF-GBD, a été construit pour cette procédure, comme décrit dans le protocole textuel. Ce plasmide produit des protéines de fusion du domaine de liaison à l’ADN Gal4 au sein d’un plasmide à faible copie basé sur le centromère TRP1 portant le gène de résistance à la kanamycine qui permet également le clonage de fragments d’appât en amont et en aval du domaine de liaison à l’ADN Gal4. Ce plasmide d’appât a été utilisé pour transformer la levure MATa, et l’expression des protéines de fusion de l’appât Gal4 a été vérifiée par immunotransfert avec des anticorps anti-CMI.De plus, une nouvelle banque de levures 2-hybrides dans le vecteur plasmidique de proie PGAL4 AD rationalisé a été créée. L’ADN génomique a été fragmenté par cisaillement, la taille sélectionnée, modifiée à l’aide d’adaptateurs et insérée dans PGAL4-AD pour créer la banque de levures 2-hybrides saxairtab. Pour commencer la procédure de création de populations de levures avec des banques d’appâts et de proies, inoculez des cultures de trois millilitres de chacun des transformants de levure MATa portant les différents trips, un contenant des plasmides d’appât et un CSM moins le milieu de voyage.Inclure deux cultures distinctes, contenant uniquement le plasmide vecteur, pour servir de contrôles procéduraux. Incuber les cultures à 30 degrés Celsius et 200 tr/min pendant six heures. Ensuite, diluez chaque culture dans une culture de 25 millilitres dans un erlenmeyer stérile et incubez pendant la nuit.Décongelez à température ambiante une infâme congelée de cellules alpha MAT contenant la banque de proies porteuses de lu2. Utilisez l’ensemble des cellules décongelées pour inoculer 125 millilitres de CSM minus lu minus met medium dans un erlenmeyer stérile. Cultivez la culture à 30 degrés Celsius et 200 tr/min pendant la nuit.Le lendemain, après avoir confirmé que la DO 600 de la couverture de nuit a cultures transformantes varie entre 1,0 et 1,5, transférez les cultures dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez 21 équivalents OD 600 de chaque culture à 4 696 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Remettez en suspension chaque pastille de cellules de tapis a dans 10 millilitres d’eau stérile, transférez la suspension dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et centrifugez à 4 696 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, retirez délicatement le surnageant, sans perturber les cellules granulées, et remettez la pastille en suspension dans quatre millilitres de milieu YPDA tamponné à un pH de 3,7.Pour chaque tranche de 10 réactions d’accouplement souhaitées, granulez 39 équivalents OD 600 de la souche alpha mat portant les plasmides de la bibliothèque dans un tube conique de 50 millilitres. Remettez en suspension les cellules alpha du tapis dans 10 millilitres d’eau stérile et regranulez dans un nouveau tube conique de 50 millilitres à 4 696 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, retirez délicatement le surnageant, sans perturber les cellules granulées, et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu YPDA tamponné à pH 3,7.Pour configurer chaque réaction d’accouplement, ajoutez ce qui suit dans un nouveau tube conique de 50 millilitres : Un millilitre de cellules transformées en MAT-A, un millilitre de cellules de la bibliothèque MAT-alpha contenant des cellules et un millilitre d’YPDA tamponné à pH 3,7. Incuber à 30 degrés Celsius avec une légère agitation orbitale pendant 90 minutes. Après 90 minutes, centrifugez les cellules à 4 696 fois g à température ambiante pendant cinq minutes.Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de YPDA-YPD tamponné un à un. Placez les deux millilitres de cellules sur une plaque YPD de 100 millilitres et incubez à 30 degrés Celsius pendant environ 20 heures. Pour récolter les cellules, pipetez deux à trois millilitres de CSM minus lu minus milieu de voyage sur chaque plaque YPD et utilisez un grattoir cellulaire pour déloger les cellules.Pipetez les cellules délogées dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez la plaque quatre à cinq fois avec deux à trois millilitres de CSM moins lu moins milieu de déclenchement en utilisant une pipette de 1 000 microlitres pour pipeter le milieu et en l’éjectant doucement sur la surface de la plaque YPD. Centrifugez les cellules à 4 696 fois g à température ambiante pendant cinq minutes.Jetez le surnageant de chaque tube conique et mettez les cellules en suspension dans 40 millilitres de CSM moins lu moins milieu de voyage en pipetant de haut en bas. Pour estimer le nombre de cellules diploïdes formées, diluez quatre microlitres du mélange diploïde en 200 microlitres et 2 000 microlitres de CSM moins lu moins milieu de voyage, respectivement. Déposer une plaque de 200 microlitres de chaque dilution sur une plaque de déclenchement CSM moins lu moins déclenchement pour représenter une dilution complète de un à 10 000 et de une à 100 000 du stock de diploïdes récoltés.Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 36 à 40 heures. Utilisez immédiatement le reste de chaque 40 millilitres de resuspension cellulaire pour inoculer 500 millilitres de CSM moins lu moins milieu de voyage dans un erlenmeyer d’un litre. Mesurez la DO 600 de chaque culture.Incuber ces flacons à 30 degrés Celsius, en les secouant à 180 tr/min, jusqu’à ce qu’ils atteignent la saturation, ce qui prend généralement 36 à 40 heures. Surveillez la croissance cellulaire à 24 heures et 36 heures en mesurant l’OD 600. Avant de poursuivre la procédure, confirmez l’efficacité de l’accouplement des deux souches de levure.Un nombre minimum de 200 colonies sur la plaque de dilution d’une à 10 000 est requis. Une fois que les cultures ont atteint la saturation, à l’aide d’une pipette, prélever une alloquade de 20 millilitres de chaque culture et inoculer des fioles Erlenmeyer de deux litres. Une fiole contenant 750 millilitres de CSM moins lu moins milieu de voyage et une seconde fiole contenant 750 millilitres de CSM moins lu moins de milieu de voyage.Avec le niveau le plus bas de trois amino 124 triasol qui élimine le bruit de fond, déterminé précédemment comme décrit dans le protocole texte. Mélangez bien les nouvelles cultures en tourbillonnant. Après avoir mesuré la DO initiale de 600, incubez les cultures à 30 degrés Celsius, tout en agitant à 180 tr/min, jusqu’à saturation, qui se produit généralement dans les 24 heures pour la culture CSM moins lu moins trip non sélectionnée, mais peut prendre plus de 70 heures pour les cultures en cours de sélection pour les interactions levure 2-hybride.Une fois que les cultures ont atteint la saturation, prélever 11 millilitres de chaque culture à l’aide d’une pipette et sédimenter les cellules avec une rotation de cinq minutes à 4 696 fois g à température ambiante. Jetez le surnageant et procédez à l’extraction de l’ADN comme indiqué dans la section suivante. Pour commencer la procédure d’extraction de l’ADN, utilisez une pipette pour remettre en suspension chaque pastille cellulaire préparée précédemment dans 500 microlitres de tampon TE puissant.Transférez dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et ajoutez 10 microlitres de bouillon de zimolay dans chaque tube. Dans une hotte, ajoutez trois microlitres de bêta-marketol éthanol dans chaque tube et mélangez bien. Incuber dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 à 36 heures.Ensuite, extrayez les échantillons deux fois avec 500 microlitres d’alcool isolaymal de fenol chloroform comme décrit dans le protocole de texte. Ajouter sept microlitres de chlorure de sodium à quatre molaires et 900 microlitres de chlorure glacé, 100 % éthanol et mélanger par inversion. Sédimentez l’ADN en le faisant tourner dans une micro-centrifugeuse à 21, 130 fois g pendant 10 minutes à température ambiante.Jetez le surnageant par pipetage et lavez chaque granule trois fois avec 900 microlitres d’éthanol à 70 %. Sédimenter l’ADN en le centrifugant à 21, 130 fois g pendant deux minutes. Après avoir retiré l’éthanol résiduel, séchez les granulés à 42 degrés Celsius pendant sept minutes.Remettez en suspension chaque granulé dans 120 microlitres de TE 0,1x fort dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Pipetez 60 microlitres de l’ADN extrait dans un micro-tube à centrifuger stérile de 1,5 millilitre. Ajoutez 120 microlitres de TE fort et 3,5 microlitres de stock RN ace A, mélangez et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure.Ajoutez sept microlitres d’acitate d’ammonium à cinq molaires et 900 microlitres d’éthanol glacé à 100 % dans chaque tube. Mélanger par inversion et sédimenter l’ADN, comme démontré précédemment. Remettez en suspension l’ADN traité au RNace-A dans 55 microlitres de TE 0,1x fort dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes.Quantifier l’ADN par absorbance à 260 nanomètres. L’étape suivante consiste à effectuer une PCR sur les inserts CDNA. Effectuez deux réactions PCR de 50 microlitres par échantillon d’ADN.À chaque réaction, ajoutez de l’eau, cinq microgrammes d’échantillon d’ADN, 25 picamoles de chaque amorce avant et arrière correspondant au plasmide de la banque de proies et 25 microlitres de mélange maître haute fidélité 2x PCR. Amplifiez les réactions avec ce programme. Une dénaturation de 30 secondes à 98 degrés Celsius, 25 cycles de D-natrine à 98 degrés Celsius pendant 10 secondes, un anéalisation à 55 degrés Celsius pendant 30 secondes et des temps d’extension de trois minutes à 72 degrés Celsius, suivis d’une incubation de cinq minutes à 72 degrés Celsius.Analysez chaque réaction PCR par électrophorèse à 1 % d’ADN avec un gel contenant de l’athidiumbromine et visualisez le gel par transillumination UV. Les échantillons sans sélection montrent un frottis généralisé d’ADN, mais lors de la sélection, des bandes individuelles peuvent être discernées. Combinez des échantillons PCR en double et purifiez-les à l’aide d’un kit en suivant les instructions du fabricant.Quantifier l’ADN par absorbance à 260 nanomètres sur un spectrophotomètre. Par la suite, effectuez un séquençage profond, suivi d’un traitement et d’une vérification bioinformatiques comme décrit dans le protocole textuel. La nouvelle banque aléatoire fragmentée de levures 2-hybrides a été utilisée dans la procédure démontrée et les inserts plasmidiques amplifiés par PCR ont été analysés par séquençage DEEP et traitement bio-informatique à l’aide du logiciel DEEPN et comparés à une bibliothèque précédemment publiée.Ce graphique montre l’ordre de classement des roseaux pour chaque gène dans les banques divisées par les roseaux par gène trouvé par séquençage du génome de la levure. Cet histogramme montre le nombre de plasmides uniques par gène qui code pour un fragment qui se trouve à la fois dans la région codant pour la protéine et dans le cadre de lecture translationnel approprié. Une comparaison du nombre de plasmides différents dans chaque banque qui codent pour les gènes de levure et de la proportion qui sont et ne sont pas dans le cadre de lecture translationnel correct ou qui sont insérés à l’envers est montrée.Dans l’ensemble, la nouvelle bibliothèque contient beaucoup plus de plasmides différents. Ces méthodes garantissent que la banque peut être transférée de manière reproductible à des cellules contenant différentes protéines d’appât et que la procédure de sélection peut produire des ensembles reproductibles de gènes enrichis, les distinguant comme des protéines spécifiques interagissant avec des candidats. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une semaine si elle est correctement exécutée.La plupart de ce travail consiste à incuber des cultures de cellules et le temps de manipulation n’est que de quelques heures. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de créer des populations d’un grand nombre de cellules diploïdes individuelles afin que la bibliothèque puisse être transférée de manière reproductible aux cellules contenant les différentes protéines d’appât. Il est également important de porter une attention particulière aux conditions de dilution et au taux de croissance des cellules pour les populations subissant une sélection pour des conditions positives de levure 2-hybride.À la suite de cette procédure, les méthodes de calcul expliquées dans le travail accompagné identifieront les protéines candidates en interaction et fourniront une voie pour valider ces interactions à l’aide d’un test traditionnel de levure à 2 hybrides ou d’autres méthodes biochimiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne idée de la façon de créer de manière reproductible des populations de levures diploïdes qui contiennent la bibliothèque de plasmides de proie et de les cultiver en lot pour sélectionner des interactions positives entre levures 2-hybrides. N’oubliez pas que travailler avec des solvants organiques, pendant le protocole de purification de l’ADN, peut être dangereux et doit être effectué sous la hotte avec des gants et une blouse de laboratoire.

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