DÉCELLULARISATION et méthodologie de Recellularization pour les veines saphènes humaines

Cette méthode explique une procédure détaillée pour l’ingénierie tissulaire de la veine saphène. Nous démontrons également la préparation de configurations de décellularisation et de bioréacteurs pour la recellularisation à l’aide d’appareils simples. Le principal avantage de cette technique est qu’un simple échantillon de sang est nécessaire pour la recellularisation, éliminant ainsi le prélèvement douloureux de moelle osseuse et les procédures de culture cellulaire chronophages.

Pour la perfusion et le lavage du Triton-X 100, préparez la première configuration de décellularisation. Dans une chambre de deux litres, collez les trois morceaux du tube A.Collez un tube sur la paroi où le bord touche le fond de la chambre pour l’entrée du détergent. Collez les deux autres tubes à la paroi opposée avec une distance de cinq à 10 centimètres entre eux, selon la longueur de la veine.

Au moins cinq centimètres de ces tubes doivent également être collés au sol de la chambre. Connectez le tube d’entrée du détergent au tube B à l’aide des connecteurs de leurre mâle et femelle. Connectez ensuite le tube B au tube F, et le tube F au tube C. Connectez le tube C à l’entrée de la veine.

Maintenant, placez le tube F dans la cassette de la pompe péristaltique. Prenez un autre tube C et connectez une extrémité à la sortie de la veine. Placez l’autre extrémité dans un bocal en verre équipé d’une sortie de tuyau inférieur et positionné à 45 centimètres au-dessus de la chambre, et collez-le pour le fixer.

Celui-ci sert de sortie de détergent. Ensuite, poussez une extrémité du tube G dans la sortie du tuyau du bocal en verre et placez l’autre extrémité dans la chambre veineuse. Ensuite, préparez la configuration de décellularisation deux pour la perfusion de TnBP comme détaillé dans le protocole texte.

Préparez également la troisième configuration de décellularisation pour la perfusion de l’ADN, comme détaillé dans le texte, et placez-la à 37 degrés Celsius. Pour préparer le bioréacteur de recellularisation, insérez le tube H dans un orifice d’un capuchon à quatre orifices pour servir de sortie de la veine. Dans le deuxième orifice, insérez le tube I pour servir d’entrée de support.

Et dans le troisième orifice, insérez le tube J pour l’entrée de la veine. Ensuite, insérez l’autre extrémité du tube H dans le quatrième port pour servir de sortie multimédia. Connectez les connecteurs réducteurs aux extrémités intérieures des tubes H et J.Pliez l’autre extrémité du tube J en forme de U et attachez-la avec une suture.

Maintenant, placez un tube de 60 millilitres avec une base plate dans un verre de 250 millilitres. Ensuite, connectez une extrémité du tube K à l’entrée de la veine et connectez l’autre extrémité au tube E.Connectez le tube E à un deuxième tube K, puis à l’entrée du média. Placez ensuite le bouchon préparé dans le tube présent dans la bouteille.

Enfin, stérilisez le bioréacteur par autoclavage. Effectuez deux cycles de congélation-décongélation sur une veine saphène humaine comme détaillé dans le protocole textuel avant de couper une biopsie de deux millimètres de longueur avec des ciseaux. Fixez la biopsie dans du formaldéhyde pendant 24 à 48 heures à température ambiante.

Attachez chaque extrémité de la veine aux barbes d’un connecteur de leurre mâle et femelle avec une suture. Connectez la veine à la configuration de décellularisation un et remplissez la chambre avec un litre de solution deux. Maintenant, perfuser pendant 15 minutes à 35 millilitres par minute et vider le contenu de la configuration.

Ensuite, ajoutez un litre de solution quatre et perfuser pendant quatre heures à 35 millilitres par minute. Videz le contenu, ajoutez 500 millilitres de solution deux, perfuser pendant cinq minutes et videz à nouveau le contenu. Déconnectez la veine de la configuration de perfusion un et connectez-la à la configuration de perfusion deux.

Ensuite, ajoutez un litre de solution cinq, allumez l’agitateur et perfuser pendant quatre heures à 35 millilitres par minute. Déconnectez la veine de la configuration de perfusion deux et lavez l’extérieur de la veine deux fois avec 20 millilitres d’eau ultra-pure. Ensuite, à l’aide d’une seringue, lavez l’intérieur de la veine deux fois avec 20 millilitres d’eau ultrapure pendant cinq à 10 minutes.

Après avoir perfusé avec la configuration de perfusion trois comme décrit dans le protocole texte, connectez la veine à la configuration de perfusion 1. Remplissez un litre de solution deux et perfuser toute la nuit à 35 millilitres par minute. Répétez le processus de perfusion quatre fois pour l’élimination complète des matières nucléaires.

Après la perfusion, videz l’installation, remplissez un litre de solution deux et perfuser pendant 24 heures à 35 millilitres par minute. Après 24 heures, videz à nouveau l’installation et remplissez-la d’un litre d’eau ultra-pure. Perfuser pendant encore 24 heures à 35 millilitres par minute.

Enfin, répétez la perfusion dans les mêmes conditions, mais avec la solution sept. Après vérification de la décellularisation comme décrit dans le protocole de texte, stérilisez la veine en la plaçant dans un tube de 50 millilitres contenant 50 millilitres de solution huit. Agiter à 80 rotations par minute dans un agitateur pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Travaillant dans une armoire à flux laminaire pour maintenir la stérilité, utilisez maintenant des pinces stériles pour transférer la veine stérile dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 50 millilitres de solution stérile sept, contenant 500 microlitres d’anti anti. Agitez la veine comme précédemment pendant 12 heures, en changeant la solution sept au moins deux fois entre les deux. À l’aide d’une pince stérile, transférez la veine dans un nouveau tube de 50 millilitres, ajoutez 50 millilitres de milieu endothélial et agitez pendant 11 heures.

Maintenant, connectez la veine en l’attachant à l’entrée et à la sortie de la veine du bioréacteur avec une suture stérile et une pince, et serrez la configuration du bouchon sur la bouteille de 250 millilitres. Remplissez le bioréacteur avec le même milieu endothélial. Ajoutez de l’héparine à raison de 50 unités par millilitre et perfuser pendant une heure à raison de deux millilitres par minute dans l’incubateur.

Prélever 15 à 25 millilitres de sang frais du donneur dans des tubes vacutainer enrobés d’héparine et les diluer un à un avec une solution de stéen. Plus tard, ajoutez le facteur de croissance endothélial vasculaire dérivé de la glande endocrine, le facteur de croissance fibroblastique basique et un acide salicylique subtil. Après avoir vidé le milieu endothélial du bioréacteur, ajoutez-y le sang et perfuser pendant 48 heures à deux millilitres par minute dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone.

Environ 12 heures plus tard, travaillez dans l’armoire à flux laminaire pour retirer une goutte de sang du bioréacteur et mesurer le glucose à l’aide d’un appareil de surveillance de la glycémie. Si le niveau est inférieur à trois millimoles par litre, ajoutez du glucose pour le ramener dans la fourchette de sept à neuf millimoles par litre. Après 48 heures de retour dans l’incubateur, drainez le sang du bioréacteur dans l’armoire à flux laminaire.

Ajouter 30 millilitres de solution stérile sept, perfuser pendant cinq minutes et égoutter la solution. Répétez ce processus jusqu’à ce que la couleur rouge sang soit perdue. Enfin, ajoutez 30 à 45 millilitres de milieu endothélial et perfuser pendant 96 heures dans l’incubateur à raison de deux millilitres par minute.

Déconnectez la veine recellularisée du bioréacteur dans l’armoire à flux laminaire, coupez cinq millimètres des bords de la veine à l’aide de ciseaux et jetez-la. Faites une biopsie comme précédemment, placez-la dans du formaldéhyde et effectuez une vérification de la recellularisation comme décrit dans le protocole textuel. La morphologie grossière d’une veine normale est de couleur rouge vif.

La couleur rouge est perdue dans les cycles de décellularisation progressive et, après cinq cycles de traitement, semble pâle et blanche. La veine recellularisée par perfusion de sang périphérique et le milieu endothélial était à nouveau de couleur rouge vif. Voici une image représentative de la coloration à l’hémotoxyline et à l’éosine d’une veine normale montrant la présence de nombreux noyaux bleus.

Cependant, aucun noyau bleu n’a été observé dans la coloration à l’hémotoxyline et à l’éosine de la veine décellularisée. Dans la veine recellularisée perfusée de sang et de milieu endothélial, la coloration à l’hémotoxyline et à l’éosine a montré la présence d’une fixation cellulaire au niveau de la lumière. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la décellularisation de la veine saphène par des détergents et la recellularisation avec du sang périphérique et un milieu endothélial.

Cette technique de décellularisation par perfusion de Triton-X 100, de TnBP et d’ADN sous pression a été couronnée de succès et reproductible dans l’élimination des noyaux des veines saphènes humaines. Bien que cette technique prenne 20 jours, le stockage de la veine décellularisée en tant que produit après conservation réduira le temps de procédure à huit jours. La recellularisation des veines à l’aide du sang périphérique du receveur peut être considérée comme cliniquement pertinente.

La recellularisation de la veine avec un protocole similaire s’est avérée prometteuse dans la transplantation clinique en fournissant un apport sanguin fonctionnel après l’opération. Avec de légères modifications, ce protocole peut être utilisé pour tout type de veine, et comme greffe personnalisée en clinique pour toutes les chirurgies vasculaires.