Name: Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez l'isolement et l'expansion de cellules endothéliales CD34+CD31+ à partir de tissu adipeux humain omental et sous-cutané. Cette méthode permet de différencier ces cellules en adipocytes blancs et beiges pour étudier l'obésité.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs souhaitent reconnaître Becky Marquez, le coordonnateur clinique au centre de Bariatric Sentara, pour son aide avec le processus du patient dépistage et consentante. Cette recherche a été financée par R15HL114062 à Anca D. Dobrian.

Le Comité d’examen institutionnel à Eastern Virginia Medical School a approuvé la recherche et la collecte d’échantillons de tissus adipeux humains utilisés dans l’étude. Consentement éclairé par écrit ont été recueilli chez les patients.
1. préparation des tampons, des médias et Instruments
<ol><li>Préparer une Solution de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS) : 135 mM chlorure de sodium, chlorure de potassium de 5 mM, 1 mM sulfate de magnésium, 0,4 mM de phosphate de potassium dibasique, glucose 5,5 mM, 1 mM l’adénosine, 0,01 % de mélange antibiotique/Antimycosique (50 µg/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine, 30 µg/mL de gentamicine, 15 ng/mL d’amphotéricine) et 10 mM HEPES (pH = 7,4). Cette solution est préparée fraîche chaque fois pour le prélèvement tissulaire et la digestion.</li>
	<li>Préparer une solution de collagènase fraîches : 1 mg/mL de collagénase, tapez 1, dans KRBSS ; faire 3 mL/g de matière grasse. Réchauffez la solution de la collagénase à 37 ° C dans un bain d’eau avant la digestion du tissu.</li>
	<li>Préparer un tampon d’isolement cellulaire CD34 : 2 % sérum fœtal (SVF) et 1 mM EDTA stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Préparer l’adipogenèse Media : DMEM/F12, 5 % FBS, 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine, 1,25 µL/mL de l’insuline humaine (5 µg/mL ou 144 mU/mL) et 0,36 µL/mL de 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).</li>
	<li>Préparer une solution de réserve d’huile rouge O (ORO) 0,3 % (poids/volume) en dissolvant 0,3 g de ORO dans 100 mL d’isopropanol.</li>
</ol>2. tissu adipeux Fraction vasculaire stromales isolement
Remarque : L’étude a inclus une cohorte transversale d’obésité morbide type 2 diabétiques (T2D) et des sujets non diabétiques, âgés de 18 à 65 ans, qui subissent une chirurgie bariatrique au Sentara métaboliques et centre de chirurgie de perte de poids (Sentara Medical Group, Norfolk, Virginie). Critères d’exclusion incluent une maladie auto-immune, y compris le diabète de type 1, conditions nécessitant une thérapie immunosuppressive chronique, anti-inflammatoires, thiazolinendiones, tabagisme actif, les infections chroniques ou aiguës ou une histoire de malignité traitées dans les 12 derniers mois. T2D était définie comme une glycémie plasmatique à jeun de 126 mg/dL ou plus, une glycémie de 200 mg/dL ou plus après une tolérance au glucose 2 h test ou l’utilisation de médicaments antidiabétiques.
<ol><li>Collecte humaine épiploïques (OM) et du tissu adipeux sous-cutané (SC) (AT) des sujets humains qui subissent une chirurgie bariatrique.</li>
	<li>Garder l’OM et SC AT dans des flacons séparés contenant mis en mémoire tampon salin de Hank avec 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine à température ambiante immédiatement après l’extraction des tissus.</li>
	<li>Soigneusement nettoyer et supprimer les articles fibreux et cautérisation du tissu à l’aide de pinces et ciseaux écouvillonnée de l’éthanol 70 % lorsque l’échantillon arrive au laboratoire après l’extraction des tissus.</li>
	<li>Peser le tissu adipeux et partitionner les aliquotes de TI en 5 g (ou moins) pour la digestion de collagénase.</li>
	<li>Finement hacher 5 g de l’AT dans 5 mL d’une solution de collagènase dans un flacon à scintillation à température ambiante, à l’aide de deux paires de ciseaux.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de solution de collagènase supplémentaire au tissu haché pour total 15 mL.</li>
	<li>Digérer les échantillons pendant 1 h, à 37 ° C, dans un bain d’eau sous agitation continue.</li>
	<li>Couper l’extrémité loin une seringue de 20 mL pour faire une extrémité arrondie.</li>
	<li>Découper un carré de 9 x 9 cm d’un maillage de 250 µm et poussez-le à mi-chemin dans un tube conique de 50 mL à l’aide de la seringue à extrémité arrondie.</li>
	<li>Versez les échantillons dans la seringue de 20 mL extrémité arrondie et le filtre à travers les mailles de nylon 250 µm dans le tube conique de 50 mL pour séparer les adipocytes et les cellules du stroma vasculaires des tissus non digérés. Remarque : N’utilisez pas plus de 5 g d’AT / tube conique de 50 mL, comme le maillage va se boucher à cause de l’excès de matériau fibreux non digérés.</li>
	<li>Nettoyez le flacon à scintillation avec 10 mL de KRBBS et versez-la dans le filtre pour recueillir des cellules résiduelles.</li>
	<li>Incuber les échantillons filtrés pendant 5 min à température ambiante. Remarque : Cette étape est importante pour permettre les adipocytes de flotter dans le haut du tube et certaines cellules stromales vasculaires à se déposent au fond du tube.</li>
	<li>Utiliser une seringue de 20 mL et un 20 x 6 en pipettant aiguille pour enlever la couche stromale fraction vasculaire et l’introduire dans un tube conique propre 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de KRBBS et laisser les échantillons de s’asseoir sur le banc pendant 5 min, à température ambiante.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.12 – 2.14 deux fois. Remarque : Ces étapes assurera qu’il n’y a aucune contamination des cellules stromales vasculaires avec les adipocytes flottants.</li>
	<li>Garder les fractions stroma vasculaires de deux dépôts sur la glace pour un traitement supplémentaire, tel que décrit dans les étapes ci-dessous. Remarque : Ne laissez pas les cellules sur la glace pendant plus de 1 h, comme cela peut avoir une incidence sur la viabilité des cellules. Les adipocytes peuvent être congelés dans l’azote liquide pour le stockage à long terme flash ou utilisée fraîches pour des expériences.</li>
</ol>3. isolement des cellules endothéliales du tissu adipeux
<ol><li>Faites tourner les fractions stroma vasculaires (SVF) à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.</li>
	<li>Enlever les échantillons de la centrifugeuse et soigneusement décanter le liquide surnageant ; Gardez le culot contenant les cellules SVF.</li>
	<li>Resuspendre doucement les boulettes de cellule dans 5 mL de PBS. NOTE : Si plus de 5 g d’un dépot de AT a été transformé en plusieurs parties aliquotes (voir étape 2,4), regrouper les granules cellulaires.</li>
	<li>Faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.</li>
	<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS compter les cellules non vides. NOTE : Ici, un compteur de cellule automatique a été utilisé pour le comptage des cellules. La viabilité cellulaire a été obtenue par mélange de 12 µL de suspension cellulaire avec 12 µL d’une solution de l’acridine orange/propidium iodure (AO/PI) (voir la Table des matières). Le nombre moyen de cellules par gramme d’AT pour chaque dépôt est : (a) Depot OM : 1,69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC Depot : 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. La viabilité des cellules de deux dépôts était > 90 %.</li>
	<li>Pellet les échantillons à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C. Remarque : Un protocole de sélection d’immunomagnetic CD34 (voir Table des matières) a été adapté pour étapes 3.7 – 3,15.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 100 µL de tampon d’isolement CD34. Remarque : Le nombre total de cellules nécessite les volumes suivants de la remise en suspension : (a) < 2 x 107 cellules : Resuspendre le culot dans 100 µL ; (b) 2 x 108– 5 x 108 cellules : Resuspendre le culot dans 1 mL. En étapes 3,9 – 3.16, les volumes des réactifs utilisés ont été revus à la baisse pour < 2 x 107 cellules.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de cocktail CD34 et incuber l’échantillon pendant 15 minutes, à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 5 µL de billes magnétiques et incuber l’échantillon pendant 10 min, à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 2,5 mL de tampon d’isolement CD34 dans chaque échantillon et placer les échantillons dans l’aimant, pendant 5 min, à température ambiante.</li>
	<li>Inverser l’aimant pour 5 s pour décanter le tampon de l’isolement.</li>
	<li>Enlever les échantillons de l’aimant et répétez les étapes 4 de x 3.10 et 3.11.</li>
	<li>Retirer le tube de l’aimant et ajouter 2 mL de tampon d’isolement CD34.</li>
	<li>Pellet les cellules à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.</li>
	<li>Remettre en suspension les granules cellulaires dans 1 mL de tampon d’isolement CD34 et compter les cellules non vides. NOTE : Ici, le nombre moyen de cellules par gramme d’AT est : (a) Depot OM : 4.75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC Depot : 1,06 x 104 ± 9.53 x 103. Un protocole de plastique immunobead CD31 a été adapté pour obtenir la procédure 3.16 – 3.34 (voir Table des matières).</li>
	<li>Cellules à 500 x g pendant 5 min de granule et Resuspendre le culot dans 250 µL de tampon B et 250 µL de tampon de lavage.</li>
	<li>Bien remettre en suspension les perles CD31 au vortex le tube.</li>
	<li>Ajouter 20 µL de perles CD31. Remarque : En raison de la cellule total compte > 1 x 106, le volume a été réduit après l’entrée du constructeur.</li>
	<li>Incuber l’échantillon avec bascule pendant 30 minutes, à température ambiante.</li>
	<li>Fixer un filtre dans un tube conique stérile de 50 mL. Remarque : L’ouverture plus grande de la crépine doit être sur le dessus.</li>
	<li>Avant la séparation de la cellule, ajouter 1 mL de tampon de lavage s’équilibrer la crépine. Appliquer le mélange généré sous étape 3.16 à la crépine.</li>
	<li>Lavez le filtre avec 5 mL de tampon de lavage dans un mouvement circulaire pour un volume total de 20 mL. Branchez le connecteur sur un tube conique stérile de 50 mL et fermer le raccord luer-lock.</li>
	<li>Posez la passoire sur le connecteur. Ajouter 1 mL de tampon de lavage le long du mur de la crépine. Ajouter 1 mL de tampon activée D le long du mur de la crépine. Agiter l’échantillon doucement et il incuber pendant 10 min, à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage. Séparer les cellules les perles en pipettant également monter et descendre de 10 x. Remarque : Ne pas produire des bulles d’air.</li>
	<li>Ouvrir le raccord luer-lock et laisser les cellules individuelles s’écouler dans le tube conique de 50 mL. Lavez le tamis 10 x 1 ml de tampon de lavage chaque fois.</li>
	<li>Jeter le connecteur et la crépine et centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min, à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 2 mL d’EGM-2 médias de la culture. Remarque : Le nombre moyen de cellules par gramme d’AT, à ce stade est : (a) Depot OM : 5,92 x 103 ± 4,27 x 103; (b) SC Depot : 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. La viabilité des cellules de deux dépôts était supérieur à 90 %.</li>
</ol>4. l’induction de l’adipogenèse dans les cellules endothéliales isolées
<ol><li>Cultiver les cellules dans 6 plats traitée pour la culture de tissu avec les médias complet EGM-2 a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur. Remplacer les médias tous les jours 3 et 4 jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence de 80 à 90 %. Remarque : Le doublement de la population est entre 2 à 3 jours.</li>
	<li>Développez les cellules en les ensemençant sur boîtes de Petri de 100 mm et fractionner les cellules une fois 1:3. À ce stade, les cellules sont sur passage 2.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’une cellule automatique contrer (voir Table des matières).</li>
	<li>Cellules de graines environ 100 – 200 000 en plaques 6 puits assurant les puits dédoublés pour chaque dépôt et de la culture complète en EGM-2 supports pour 2 jours.</li>
	<li>Aspirer hors des milieux de culture et remplacez-le par 2 mL de DMEM/F12 avec 5 % FBS et 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine pour le contrôle des cellules et remplacez-le par 2 mL de l’adipogenèse médias (Voir l’étape 1.4) pour le traitement de cellules.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 incubateur pendant 13 jours, remplaçant les médias respectifs tous les 3 à 4 jours. Remarque : Les cellules commence à accumuler les lipides après 4 jours de traitement.</li>
	<li>Conduite d’ORO et du Nil rouge de coloration selon les méthodes publiées15–17.</li>
	<li>Pour isoler des cellules pour une extraction de l’ARN, retirez le support des plaques induction 6 puits et lavez-le avec 1 mL de PBS stérile.</li>
	<li>Ajouter 350 µL d’une solution de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidium (voir Table des matières) pour chaque bien et il incuber à température ambiante pendant 5 à 10 min.</li>
	<li>Gratter les cellules de la plaque à l’aide d’un grattoir de cellules et de transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Remarque : Les échantillons peuvent être conservés dans le congélateur-80 ° C pour l’extraction de l’ARN et la transformation ultérieure à une date ultérieure.</li>
	<li>Extraire les ARNm des échantillons à l’aide d’une extraction adaptée de l’ARN du protocole (voir Table des matières).</li>
	<li>Effectuer une réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) afin d’évaluer l’expression des gènes en utilisant les sondes suivantes : adiponectine, UCP-1 et CIDEA (voir Table des matières). NOTE : Ici, les procédures de RT-PCR ont été effectuées en utilisant le protocole standard suivant : dénaturation (95 ° C ; 15 s), recuit et extension (60 ° C, 1 min) pendant 40 cycles. Les échantillons qui expriment des gènes avec des valeurs de CT > 35 étaient considérés comme indétectable.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322 (5901), 583-586 (2008).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+%27brite%2Fbeige%27+adipocytes+develop+from+capillary+networks%2C+and+their+implantation+improves+metabolic+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice.</a> Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).</li>
<li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li>
<li>Tran, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+of+the+adipose+tissue+gives+rise+to+both+white+and+brown+fat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li>
<li>Villaret, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+endothelial+cells+from+obese+human+subjects%3A+differences+among+depots+in+angiogenic%2C+metabolic%2C+and+inflammatory+gene+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence.</a> Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).</li>
<li>Miranville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+postnatal+neovascularization+by+human+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells.</a> Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).</li>
<li>Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadipocytes+in+the+human+subcutaneous+adipose+tissue+display+distinct+features+from+the+adult+mesenchymal+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).</li>
<li>Moller, D. E., Flier, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1881419">Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications.</a> The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+relationships+in+cultured+3T3-L1+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).</li>
<li>Satish, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+human+adipose-derived+stem+cells+during+in+vitro+differentiation+to+an+adipocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage.</a> BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).</li>
<li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).</li>
<li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).</li>
<li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial%2Fmesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvessel+endothelial+cells%3A+isolation%2C+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization.</a> In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+microvessel+endothelial+cells%3A+isolation%2C+culture%2C+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization.</a> Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+microvessel+endothelial+cells+from+human+mammary+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue.</a> In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).</li>
<li>Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+expansion+of+tumor-specific+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53072(2015).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+residing+progenitors+%28adipocyte+lineage+progenitors+and+adipose+derived+stem+cells+%28ADSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC).</a> Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+endothelial+progenitor+cells+from+adipose+tissue+as+potential+angiogenic+cell+sources+for+bladder+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis.</a> PLoS One. 10 (2), e0117644(2015).</li>
<li>Curat, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood+monocytes+to+adipose+tissue-resident+macrophages%3A+induction+of+diapedesis+by+human+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes.</a> Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).</li>
<li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li>
<li>Traktuev, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+multipotent+CD34-positive+adipose+stromal+cells+share+pericyte+and+mesenchymal+surface+markers%2C+reside+in+a+periendothelial+location%2C+and+stabilize+endothelial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks.</a> Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).</li>
<li>Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+of+adipose+tissues%3A+a+niche+of+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).</li>
<li>Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cells+in+inflamed+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue.</a> Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+cell-surface+markers+of+adipose-derived+stem+cells+from+subcutaneous+and+visceral+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., Sugii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+fatty+potentials+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+two+human+preadipocyte+subtypes+with+distinct+capacities+for+replication%2C+adipogenesis%2C+and+apoptosis+varies+among+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinoloy+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots.</a> American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).</li>
<li>van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinedione-induced+lipid+droplet+formation+during+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’objectif de cet article est de fournir une méthodologie pour l’isolement, l’agrandissement et l’induction adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales de dépôts viscérales et sous-cutanée du tissu adipeux humain.
Méthodologies ont été rapportés pour l’isolement des cellules endothéliales de différents lits vasculaires des rongeurs ou des humains qui impliquent principalement les techniques utilisant des anticorps CD31 fluorescent étiquetés ou couplée à des billes magnétiques<sup ...

Des données récentes montrent que, chez les souris et chez l’homme, un sous-ensemble de cellules résidant dans la vascularisation du tissu adipeux peut être différencié en soit les adipocytes blancs ou beige/marron1,2,3. Le phénotype de ces cellules est un sujet de controverse, avec preuves à l’appui des cellules endothéliales, musculaires lisses/pericyte ou un spectre de phénotypes intermédiaires4,5,6,7. Le champ d’application de cette méthodologie de développement était de tester le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales isolées de différents dépôts gras contre les hommes obèses. D’autres études dans la littérature mettent l’accent sur le potentiel de la fraction totale de vasculaire stromale ou des progéniteurs adipocytaires connu2,8,9adipocytaire. Étant donné que les technologies existantes peuvent cibler spécifiquement les cellules endothéliales tissu adipeux pour drogue livraison10, compréhension du potentiel de ces cellules à subir adipocytaire induction vers les adipocytes blancs ou beiges est importante pour futures thérapies ciblées.
Différents groupes ont signalé la combinaison de marqueurs CD31 et CD34 comme substituts pour isoler les cellules endothéliales du tissu adipeux humain11,12,13. En règle générale, l’isolement est effectuée à l’aide de deux étapes séquentielles et une sélection positive à l’aide de billes magnétiques. Dans ce rapport, immunoseparation à l’aide de CD34 + billes magnétiques combinés avec des perles en plastique CD31 a été utilisée. Nous avons constaté que cette technique est supérieure à l’immunoseparation magnétique séquentielle en ce qui concerne la conservation de la morphologie endothéliale pavées typiques. Aussi, nous étions en mesure de produire suffisamment de cellules nécessaires à l’expansion et adipocytaire induction à partir d’aussi peu que 1 à 2 g de matières grasses. Une biopsie du petit échantillon de graisse sous-cutanée est suffisant pour produire la quantité requise de cellules pour les applications en aval. Cet aspect est potentiellement important, surtout si cette méthode sera utilisée pour le dépistage d’une réactivité à induction adipocytaire chez des sujets humains.
Contrairement aux autres systèmes rapportés dans la littérature, cette méthode utilise seulement deux ingrédients pour l’induction adipocytaire des cellules CD34 + CD31 + : un agoniste PPARγ — rosiglitazone — et l’insuline humaine. Ce qui est important, la quantité d’insuline utilisée correspond à la fourchette de normale/haute de circulation insuline post-absorptif chez les humains,14. Le degré de sensibilité à l’insuline du cellules in vitro, mesurée par la phosphorylation de l’Akt, n’est pas corrélée avec leur capacité de répondre à l’induction cocktail. Fait intéressant, un mélange de blancs et beige/marron de cellules en utilisant des conditions expérimentales et cocktail cette induction, ont été obtenues tel que déterminé par la taille et le nombre de gouttelettes de lipides intracellulaires et l’expression des marqueurs moléculaires. Ce protocole d’induction simple et rentable ainsi que l’évaluation quantitative du phénotype des cellules répondeur (blanc ou beige) permet un dépistage d’agents qui peuvent potentiellement modifier l’équilibre du beige différenciée : blanc d’adipocytes.
Cette méthode fournit également une approche translationnelle pour comprendre les mécanismes sous-jacents de l’adipogenèse des progéniteurs endothéliales vasculaires dans le tissu adipeux humain. Utilisant cette technique d’isolation/différenciation spécifique, les enquêteurs peuvent interroger diverses voies chargées de l’adipogenèse dans un sous-ensemble de cellules endothéliales vasculaires de différents dépôts de graisse chez l’homme maigre et obèses.

<table><tbody><tr><td> Large Equipment </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Enceinte de biosécurité </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur de culture cellulaire </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> Bain-de-bain </td><td> Forma Scientific </td><td> 2568 </td><td> Agitateur réciproque </td></tr><tr><td> RT-PCR </td><td> BIO-RAD </td><td> CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte d’électrophorèse </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini PROTEAN 3 cellules </td><td></td></tr><tr><td> Boîte Transblot </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini Trans-Blot Cell </td><td></td></tr><tr><td> Bloc d’électrophorèse </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> ELISA Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Reader </td><td> LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> Proche infrarouge </td></tr><tr><td> Centrifugeuse réfrigérée </td><td> Eppendorf </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> centrifugeuse de table </td><td> Eppendorf </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> Microscope fluorescent </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé </td><td> Nikon </td><td> TMS </td> <<td></td></tr><tr><td>strong>KRBSS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES < </td><td> p>Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de calcium dihydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfate de magnésium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate monobasique monohydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> Potassium chlorure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333 </td> <td></td></tr><tr><td>Glucose </td><td> Acros Organics </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> adénosine </td><td> Acros Organics </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine sérique bovine </td><td> GE Bio-sciences de la santé </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> pénicilline/streptomycine </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Digestion tissulaire</fort> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL Seringue </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Nylon Mesh, 250 & micro ; m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguilles de pipetage </td><td> Popper </td><td> 7934 </td><td></td></tr><tr><td> ciseaux fins </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Pince à tissus </td><td> George Tiemann & Co </td><td> 160-20 </td><td></td></tr><tr><td> collagénase de type I </td><td> Worthington Biochimique </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> Boîtes de Pétri, 100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 </td><td> TC Traitées </td></tr><tr><td> Tubes Eppendorf, 1,5 mL </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td><td></td></tr><tr><td> tubes coniques, 15 mL </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> tubes coniques, 50 mL </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> Flacons à scintillation </td><td> Kimble </td><td> 74505-20 </td><td> Tissus en dés </td></tr><tr><td> Isolation cellulaire </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellomètre </td><td> Nexcelom </td><td> Auto 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de cellomètre </td><td> Nexcelom </td><td> CHT4-SD100-002 </td><td></td></tr><tr><td> Coloration de viabilité au cellomètre </td><td> Nexcelom </td><td> CS2-0106-5mL </td><td> Orange acridine/Propidie Iode de dium </td></tr><tr><td> Anti-CD34 Perles magnétiques </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18056 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD31 Plastic Pearls </td><td> pluriSelect USA </td><td> 19-03100-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 10x Wash Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00080-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Connecteur Ring </td><td> pluriSelect USA </td><td> 41-50000-03 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Detachment Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00046-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Incubation Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00060-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect S Cell Strainer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 43-50030-03 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Culture </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-well Plates </td><td> USA Scientific </td><td> CC7682-7506 </td><td> TC Traité </td></tr><tr><td> 4- lames bien chambrées </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 354559 </td><td> Fibronectine revêtue </td></tr><tr><td> 4 lames bien chambrées </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 154526PK </td><td> Verre non revêtu </td></tr><tr><td> Cellules endothéliales microvasculaires adipeuses humaines (HAMVEC) </td><td> Sciencell Research Laboratories </td><td> 7200 </td><td> Primary cell line </td></tr><tr><td> Endothelial Cell Media (ECM) </td><td> ScienCell Research Laboratories </td><td> 1001 </td><td> Complete Kit </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Basal Media </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 11320082 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> Rocky Mountain Biologicals </td><td> FBS-BBT </td><td></td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Lilly </td><td> U-100 </td><td> Humalog </td></tr><tr><td> Rosiglitazone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2408 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Analysis </td> <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O Dye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td> Préparé à l’isopropanol </td></tr><tr><td> 96 plaques de puits </td><td> USA Scientific </td><td> 1837-9600 </td><td></td></tr><tr><td> 96 plaques PCR puits </td><td> Genesee Scientific </td><td> 24-300 </td> <td></td></tr><tr><td>Extraction d’ARN </td><td> Zymo Research </td><td> R2072 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> Synthèse de l’ADNc </td><td> BIO-RAD </td><td> 1708841 </td><td> Supermix </td></tr><tr><td> JumpStart PCR Polymérase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307-250UN<td> > Démarrage à chaud, avec tampon PCR N </td></tr><tr><td> solution de chlorure de magnésium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8787-5ML </td><td> 3 mM final en réaction PCR </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan AdipoQ </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00605917_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan CIDEA </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00154455_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan RPL27 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs03044961_g1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan UCP1 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00222453_m1 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay < </td><td> p>Sigma-Aldrich </td><td> QPBCA-1KT </td><td> Kit </td></tr><tr><td> Bis-acrylamide </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610146 </td><td> solution mère à 40 % </td></tr><tr><td> Sulfate d’ammonium<td> > BIO-RAD </td><td> 1610700 </td><td></td></tr><tr><td> TEMED < </td><td> p>BIO-RAD < </td><td> p>1610800 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610718 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Dodecal Sulfate < </td><td> p>Sigma-Aldrich </td><td> L3771 < </td><td></td></tr><tr><td> p>EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-100 </td><td></td></tr><tr><td> Bleu de bromophénol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Membrane </td><td> EMD Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-SK4 </td><td></td></tr><tr><td> Odyssey Blocking Buffer, Tris </td><td> LI-COR </td><td> 927-50000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-AKT </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 2920S </td><td> Souris monoclonale </td></tr><tr><td> Anticorps anti-pAKT </td><td> Technologie de signalisation cellulaire </td><td> 9271S </td><td> Rabbit polyclonal </td></tr><tr><td> anticorps anti-UCP1 </td><td> Abcam</p<> </td><td> p>ab10983 </td><td> Rabbit polyclonal </td></tr><tr><td> anticorps anti-IgG de souris </td><td> LI-COR </td><td> 926-68070 </td><td> Goat Polyclonal, IRDye 680RD </td></tr><tr><td> Anticorps IgG anti-lapin </td><td> LI-COR </td><td> 926-32211 </td><td> <>p Polyclonal de chèvre, IRDye 800CW </td></tr><tr><td> Anticorps IgG anti-lapin </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 111-025-003 </td><td> Goat Polyclonal, TRITC </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 10010049 <</td><td></td>p</tr><tr><td>>37 % Solution de formaldéhyde </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15686 </td><td> 4 % solution pour la fixation cellulaire </td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td> 10 % solution bloquante </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td> 0.0.Solution de perméabilisation à 1 % </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 65-0853-39 </td><td> Visualisation fluorescente cellulaire </td></tr><tr><td> Matrigel Membrane Matrix < </td><td> p>Corning Life Sciences </td><td> 356231 </td><td> Facteur de croissance réduit </td></tr><tr><td> DiI marqué acétylé LDL </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> L3484 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolement, expansion et adipocytaire induction de cd34 + cd31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

L’obésité s’accompagne d’un vaste remodelage du tissu adipeux principalement par l’intermédiaire de l’hypertrophie adipocytaire. Adipocyte extrême croissance résulte en une mauvaise réponse à l’insuline, l’hypoxie locale et l’inflammation. En stimulant la différenciation des adipocytes blancs fonctionnels de progéniteurs, hypertrophie radicale de la population d’adipocytes peut être évitée et, par conséquent, la santé métabolique du tissu adipeux peut être améliorée ainsi qu’une réduction de inflammation. En outre, en stimulant une différenciation des adipocytes beige/brun, la dépense d’énergie totale du corps peut être augmentée, entraînant une perte de poids. Cette approche pourrait prévenir le développement de co-morbidité de l’obésité comme les maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2.
Cet article décrit l’isolement, l’expansion et la différenciation des adipocytes blancs et beiges d’un sous-ensemble de cellules endothéliales de tissu adipeux humain qui expriment conjointement les marqueurs CD31 et CD34. La méthode est relativement bon marchée et n’est pas beaucoup de travail. Il requiert l’accès aux tissus adipeux humains et le dépôt sous-cutané est adapté pour l’échantillonnage. Pour ce protocole, les tissus adipeux frais échantillons provenant de sujets souffrant d’obésité morbide [indice de masse corporelle (IMC) > 35] sont collectées pendant les procédures de chirurgie bariatrique. À l’aide d’une immunoseparation séquentielle de la fraction stroma vasculaire, suffisamment de cellules est produites à aussi peu que 2 à 3 g de matières grasses. Ces cellules peuvent être développés en culture sur une période de 10 à 14 jours, peuvent être cryoconservés et conservent leurs propriétés adipocytaire avec passage jusqu'à passage 5-6. Les cellules sont traitées pendant 14 jours avec un cocktail à l’aide d’une combinaison de l’insuline humaine et l’agoniste-rosiglitazone PPARγ adipocytaire.
Cette méthode peut être utilisée pour l’obtention de preuve d’expériences de notion sur les mécanismes moléculaires qui animent les réponses adipocytaire dans les cellules endothéliales adipeuses, ou pour le dépistage des nouveaux médicaments qui peuvent augmenter l’adipocytaire réponse dirigée soit vers le blanc ou différenciation adipocytaire beige/marron. À l’aide de petites biopsies sous-cutanée, cette méthodologie permet d’écarter les sujets non-répondeur pour des essais cliniques visant à stimuler les adipocytes beige/marron et blancs pour le traitement de l’obésité et les comorbidités.

Notre protocole vise à fournir une approche in vitro afin de déterminer le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules vasculaires de différents dépôts de tissus adipeux humains. Un diagramme de l’organigramme simplifié est montré dans la Figure 1 a. La première étape à l’aide d’une sélection positive de CD34 exprimant des cellules entraîne &gt; 95 % cellules CD34 + dans la population des cellules fraîchement isolées (Fi...

La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’obésité, telles que l’identification des facteurs et des mécanismes clés qui empêchent une réponse adipogénique robuste lors du remodelage du tissu adipeux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler les cellules endothéliales CD34+CD31+ du tissu adipeux humain à partir de petites quantités de tissu. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu identifier les cellules du système vasculaire adipeux humain qui répondent à la stimulation adipogénique.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d’isolement cellulaire sont difficiles à pratiquer en raison de l’accès souvent limité au tissu adipeux humain frais. Prélever du tissu adipeux omental et sous-cutané humain sur des sujets humains subissant une chirurgie bariatrique. Immédiatement après l’extraction du tissu, conservez le tissu adipeux omental humain et sous-cutané dans des flacons séparés contenant la solution saline tamponnée de Hank avec 50 microgrammes par millilitre de pénicilline streptomycine à température ambiante.Une fois que l’échantillon arrive au laboratoire

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules souches dérivées du tissu adipeux de l’arc périaortique murin marquées par fluorescence à partir de tissus adipeux murins de l’arc périaortique. Après l’isolement, les NCADCs sont détectés, triés à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence, puis cultivés sur une plaque, favorisant ainsi la prolifération cellulaire.

Isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux périortique murin

L’hétérogénéité transcriptionnelle au sein des cellules stromales dérivées du tissu adipeux humain peut être définie au niveau de la cellule unique à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de gènes ostéogéniques.  Nous décrivons un protocole utilisant la cytométrie en flux pour l’isolement de sous-populations cellulaires ayant un potentiel ostéogénique accru, qui peut être utilisé pour améliorer la reconstruction du squelette craniofacial.

Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Nous rapportons ici une méthode pour l'isolement des populations de cellules progénitrices d'adipocytes (APC) à partir du tissu adipeux périvasculaire (PVAT) en utilisant le triage cellulaire activé par magnétisation (MCS). Cette méthode permet une augmentation de l'isolement de l'APC par gramme de tissu adipeux par rapport au tri de cellules activées par fluorescence (FACS).

Expansion et adipogénèse Induction de progéniteurs d&#39;adipocytes à partir de tissus adipeux périvasculaires isolés par tri magnétique de cellules activées

Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.

Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Ce protocole détaille une méthode pour la dissection des dépôts adipeux de souris et l’isolement et la digestion des artères respectives pour libérer puis identifier la population de cellules endothéliales. Les cellules fraîchement isolées utilisées dans des applications en aval feront progresser la compréhension de la biologie cellulaire vasculaire et des mécanismes du dysfonctionnement vasculaire.

Isolement et identification de cellules endothéliales vasculaires à partir de dépôts adipeux distincts pour des applications en aval

Ce protocole décrit une méthodologie pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSM) de rats Sprague Dawley.

Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rats Sprague Dawley

Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

Ici, nous décrivons l’isolement, la culture et l’induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris, permettant l’étude de la fonction du tissu adipeux périvasculaire et de sa relation avec les cellules vasculaires.

Isolement, culture et induction adipogénique de préadipocytes dérivés de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux périaortique de souris

Le tissu adipeux est une excellente source de cellules souches mésenchymateuses. Ici, nous apportons étape par étape l’extraction, la culture et la caractérisation de cellules souches dérivées du tissu adipeux adipeux (ADSC) à partir de tissu adipeux épididymaire de souris suisses.

Isolement, expansion in vitro et caractérisation de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux épididymaire de souris

La taille et la fragilité des adipocytes matures ont limité les techniques et les outils disponibles pour leur étude et leur isolement. Ici, un protocole est décrit pour l’isolement des adipocytes murins matures, qui peuvent être facilement adaptés à différents dépôts adipeux et régimes alimentaires de souris.

Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Découvrez l'isolement et l'expansion de cellules endothéliales CD34+CD31+ à partir de tissu adipeux humain omental et sous-cutané. Cette méthode permet de différencier ces cellules en adipocytes blancs et beiges pour étudier l'obésité.

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Explorer plus de vidéos