Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’obésité, telles que l’identification des facteurs et des mécanismes clés qui empêchent une réponse adipogénique robuste lors du remodelage du tissu adipeux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler les cellules endothéliales CD34+CD31+ du tissu adipeux humain à partir de petites quantités de tissu. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu identifier les cellules du système vasculaire adipeux humain qui répondent à la stimulation adipogénique.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d’isolement cellulaire sont difficiles à pratiquer en raison de l’accès souvent limité au tissu adipeux humain frais. Prélever du tissu adipeux omental et sous-cutané humain sur des sujets humains subissant une chirurgie bariatrique. Immédiatement après l’extraction du tissu, conservez le tissu adipeux omental humain et sous-cutané dans des flacons séparés contenant la solution saline tamponnée de Hank avec 50 microgrammes par millilitre de pénicilline streptomycine à température ambiante.

Une fois que l’échantillon arrive au laboratoire après l’extraction du tissu, nettoyez et enlevez soigneusement les sections fibrotiques et cautérisées du tissu à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler à 70 % d’éthanol. Pesez le tissu adipeux et répartissez-le en aliquotes de cinq grammes pour la digestion de la collagénase. À l’aide de deux paires de ciseaux, émincez finement cinq grammes de tissu adipeux dans cinq millilitres d’une solution de collagénase dans un flacon à scintillation à température ambiante.

Ajoutez 10 millilitres supplémentaires de solution de collagénase au tissu haché pour un total de 15 millilitres. Digérer les échantillons pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un bain-marie avec agitation continue. Après la digestion, versez les échantillons dans la seringue à bout émoussé de 20 millilitres.

Filtrez l’échantillon à travers un treillis en nylon de 250 microns dans le tube conique de 50 millilitres pour séparer les adipocytes et les cellules vasculaires stromales des tissus non digérés. Lavez le flacon à scintillation avec 10 millilitres de KRBBS et versez le lavage à travers le filtre pour recueillir les cellules résiduelles avant d’incuber les échantillons filtrés pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, utilisez une seringue de 20 millilitres et une aiguille de pipetage de calibre 20 par six pouces pour retirer la couche de fraction vasculaire stromale et la transférer dans un tube conique propre de 50 millilitres.

Ajoutez 10 millilitres de KRBBS et laissez les échantillons reposer sur la paillasse pendant cinq minutes à température ambiante. Conservez les fractions vasculaires stromales des deux dépôts sur de la glace pour un traitement ultérieur. Faites tourner les fractions vasculaires stromales à 500 fois G pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius.

Retirez les échantillons de la centrifugeuse et versez soigneusement le surnageant, en gardant la pastille contenant les cellules de la fraction vasculaire stromale. Remettez doucement les granules de cellules en suspension dans cinq millilitres de PBS. Après avoir fait tourner à nouveau les échantillons, retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS et comptez les cellules.

Granulez les échantillons une troisième fois et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de tampon d’isolement CD34. Ajoutez 10 microlitres de cocktail CD34 et incubez l’échantillon pendant 15 minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite cinq microlitres de billes magnétiques et incubez l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de tampon d’isolement CD34 à chaque échantillon et placez les échantillons dans l’aimant pendant cinq minutes à température ambiante. Retournez l’aimant pendant cinq secondes pour vider le tampon d’isolement. Après avoir répété ce processus quatre fois, retirez le tube de l’aimant et ajoutez deux millilitres de tampon d’isolement CD34.

Après une autre centrifugation, remettre en suspension les pastilles de cellules CD34+ dans un millilitre de tampon d’isolement CD34 et compter les cellules. Granulez à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension dans 250 microlitres de tampon B et 250 microlitres de tampon de lavage. Ensuite, remettez soigneusement en suspension les billes de CD31 en vortex dans le tube, puis ajoutez 20 microlitres de billes de CD31 à la pastille cellulaire remise en suspension et incubez l’échantillon à bascule pendant 30 minutes à température ambiante.

Avant la séparation des cellules, ajoutez un millilitre de tampon de lavage pour équilibrer la passoire. Ensuite, appliquez le mélange préparé de cellules remises en suspension en billes CD31 sur la passoire. Lavez la passoire avec cinq millilitres de tampon de lavage dans un mouvement circulaire pour un volume total de 20 millilitres.

Fixez le connecteur à un tube conique stérile de 50 millilitres et fermez le verrou de leur appareil. Après avoir fixé la crépine au connecteur, ajoutez un millilitre de tampon de lavage le long de la paroi de la crépine, puis ajoutez un millilitre de tampon D activé le long de la paroi de la crépine. Faites tourner doucement l’échantillon et incubez-le pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de lavage et séparez les cellules des billes en pipetant 10 fois de haut en bas. Ouvrez le verrou et laissez les cellules détachées s’écouler dans le tube conique de 50 millilitres. Lavez la passoire 10 fois avec un millilitre de tampon de lavage à chaque fois.

Jetez le connecteur et la crépine et centrifugez les échantillons à 300 fois G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Enfin, mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de milieu EGM2 complet pour la culture. Cultivez les cellules dans des plaques traitées à six puits de culture tissulaire avec un milieu EGM2 complet dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone.

Remplacez le milieu tous les trois à quatre jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 à 90 % de confluence. Ensuite, ensemencez environ 100 à 200 000 cellules dans des plaques à six puits, en assurant des puits en double pour chaque dépôt, et cultivez-les dans un milieu EGM2 complet pendant deux jours. Après deux jours, aspirez tout milieu de culture.

Remplacez le milieu par deux millilitres de DMEM/F-12 avec 5 % FBS et 50 microgrammes par millilitre de pénicilline streptomycine pour les cellules témoins. Pour les cellules de traitement, remplacer le milieu par deux millilitres de milieu d’adipogenèse. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone pendant 13 jours, en remplaçant les milieux respectifs tous les trois à quatre jours.

Des résultats représentatifs montrant la morphologie typique des cellules CD34+CD31+ en forme de pavé endothélial, après deux passages en culture, sont présentés. La capacité des cellules à former des tubules lorsqu’elles sont cultivées dans Matrigel comme prévu a également été démontrée. L’absorption uniforme de LDL acétylées marquées par fluorescence montre la présence d’une population cellulaire homogène avec une identité endothéliale.

La photo est la coloration Oil Red O de gouttelettes lipidiques neutres dans les cellules CD34+CD31+ après 13 jours d’induction adipogénique. Les réponses représentatives des cellules des dépôts omentaux et sous-cutanés de trois sujets humains différents sont montrées pour illustrer la grande variabilité de la réponse à l’induction adipogénique entre les dépôts de graisse d’un même donneur et entre donneurs. Cette image montre une coloration lipidique intracellulaire fluorescente dans les cellules CD34+C31+ après induction adipogénique pendant 13 jours.

L’image montre des cellules avec des lipides uniloculaires, des lipides multiloculaires et aucune accumulation de lipides. La PCR en temps réel montre l’expression du marqueur panadipocytaire adiponectine et des marqueurs beige brun CIDEA et UCP-1. Ces résultats confirment que les cellules suivant l’induction adipogénique expriment des marqueurs moléculaires compatibles avec un phénotype adipocytaire mixte blanc beige.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser du tissu adipeux humain frais qui a été collecté et n’a pas été stocké plus de deux heures. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la cytométrie en flux, l’immunohistochimie et la RT-PCR peuvent être effectuées pour identifier des sous-ensembles spécifiques de cellules répondantes et l’expression de marqueurs adipocytaires matures qui peuvent être utilisés pour identifier un phénotype adipocytaire brun beige.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’obésité pour explorer les rôles du tissu adipeux, des cellules vasculaires et de l’adipogenèse chez l’homme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler, de cultiver et d’étendre les cellules CD34+31+. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que les réglementations en matière de biosécurité, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des comorbidités associées à l’obésité, telles que la résistance à l’insuline, car elle identifie la réponse adipogénique des cellules à une intervention thérapeutique potentielle.