Multimodal d’imagerie rétinienne volumétrique Oblique à balayage Laser ophtalmologique (oSLO) et la tomographie en cohérence optique (OCT)

Nous présentons ici un protocole pour obtenir un grand champ de vision (FOV) en trois dimensions (3D) fluorescence et l’image rétinienne OCT en utilisant une nouvelle plate-forme multimodale d’imagerie. Nous allons introduire la configuration du système, la méthode de l’alignement et les protocoles opérationnels. L’imagerie in vivo sera démontrée, et recevront les résultats représentatifs.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ophtalmologie et de l’imagerie rétinienne. Tels que l’imagerie et la quantification de la perturbation de la barrière hémato-rétinienne et des fonctions capillaires rétiniennes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir un large champ de vision, une imagerie rétinienne tridimensionnelle multi-contrastée en utilisant un laser à balayage oblique en un seul balayage matriciel.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de la rétinopathie diabétique et d’autres maladies pré-rétiniennes. Parce que oSLO peut obtenir des images à fort contraste de la microvascularisation rétinienne, jusqu’aux capillaires uniques en 3D. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’imagerie rétinienne, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes d’imagerie utilisant des lentilles d’objectif conventionnelles.

Comme l’imagerie in vivo du cortex de la souris. Une source laser super-continuum est utilisée comme source laser système pour l’ophtalmoscopie laser à balayage oblique, ou configuration oSLO. La gamme de la lumière visible est séparée de la gamme des longueurs d’onde supérieures par le premier miroir dichroïque.

Le spectre lumineux est élargi à l’aide d’une paire de prismes dispersifs, après que le faisceau ait traversé un séparateur de faisceau de polarisation. Une fente est utilisée pour sélectionner la gamme de longueurs d’onde d’excitation. Et un miroir réfléchissant réfléchit le faisceau filtré vers la paire de prismes pour coupler la lumière dans une fibre monomode.

Un spectromètre est utilisé pour confirmer la sélection de la longueur d’onde à la sortie de la fibre monomode. La fibre monomode est connectée à deux coupleurs de fibre optique en cascade. L’un des ports de sortie de fibre du deuxième coupleur de fibre fournit la lumière au système oSLO.

Pour collimater le laser dans le système oSLO, le laser est dévié par un miroir galvanométrique. Un système de télescope à un relaie le laser à un deuxième miroir de galvanomètre, et un système de télescope à trois à un relaie ensuite le laser à la pupille de l’œil. Un miroir dichroïque à l’intérieur du système de télescope à trois contre un réfléchit les signaux fluorescents.

Le système de télescope trois en un et le miroir dichroïque sont montés sur un curseur en queue d’aronde personnalisé pour décaler l’axe optique et créer l’éclairage à balayage oblique. L’éclairage oblique permet l’imagerie par fluorescence volumétrique sans avoir besoin d’avoir un sectionnement. En décalant le laser, un faisceau oblique est focalisé sur la rétine, puis la détection oblique peut capturer une image de fluorescence tomographique le long du trajet du faisceau oblique.

Pour créer le chemin optique d’imagerie de fluorescence, la fluorescence est réfléchie par le miroir dichroïque et relayée au troisième miroir galvanométrique. La lumière fluorescente est ensuite relayée à une lentille d’objectif d’imagerie par un autre système de télescope individuel. Deux étages de translation supplémentaires sont installés sous le troisième miroir galvanométrique pour assurer la redondance dans les degrés de liberté afin d’optimiser l’image.

Le système d’imagerie final est monté sur une platine dotée de trois degrés de liberté. Rotation, et deux axes de translation. Une caméra plane est utilisée pour capturer les images de fluorescence en coupe transversale.

Un autre miroir dichroïque sépare la gamme infrarouge arrière de la lumière restante. Un filtre passe-long est utilisé pour limiter davantage la bande passante à 800 à 900 nanomètres. Couplez le faisceau dans une fibre monomode.

La fibre monomode est connectée à l’autre port d’entrée des deux coupleurs de fibre optique en cascade pour se combiner avec l’excitation oSLO bleue. La lumière du deuxième port de sortie du deuxième coupleur de fibre est dirigée vers le bras de référence OCT. Qui a des plaques de compensation de dispersion, un filtre à densité neutre variable et un miroir réfléchissant.

Le retour de lumière du bras de référence et de l’œil se recombine au niveau du second coupleur de fibre optique, et est délivré au spectromètre OCT pour collecter le signal. Utilisez un logiciel de système d’acquisition de données écrit en Labview et modifié à partir du protocole de balayage OCTA. Pour chaque b-scan, une dent de scie à cycle de service de 80 % avec 500 pas est émise par une carte de sortie analogique pour contrôler le miroir de balayage rapide x-prime.

Déclenchez la caméra à balayage linéaire à chaque étape pour acquérir des données pour l’OCT, uniquement lorsque le miroir est dans le sens du balayage avant. Réglez le temps d’exposition de la caméra à balayage linéaire sur 17 microsecondes. Pour acquérir le signal OCTA, répétez la mesure cinq fois au même emplacement de balayage b.

Réglez le débit de sortie AO à 100 kilohertz et le débit OCT A-line à 50 kilohertz. Contrôlez le miroir à balayage lent y-prime, GM1, par une forme d’onde rampante. Synchronisez le miroir de débalayage, GM3, avec GM1 pour annuler le balayage lent.

Déclenchez la caméra planaire à l’aide d’une autre carte de sortie analogique pour capturer une image fluorescente à chaque emplacement y-prime. Recadrez la taille de l’image ou regroupez les pixels voisins pour augmenter la vitesse et la sensibilité comme vous le souhaitez. Commencez par confirmer un niveau approprié d’anesthésie chez le rat par l’absence de réflexe de retrait lors d’un pincement intradigital.

Après l’induction de l’anesthésie, placez le rat sur un support. Installez un cône nasal pour maintenir l’anesthésie pendant le reste de l’expérience. Appliquez une solution ophtalmique de chlorhydrate de tétracaïne 5 sur l’œil du rat pour une anesthésie locale.

Dilater ensuite la pupille avec une solution ophtalmique de tropicamide à 1 %. Après deux minutes de dilatation, utilisez une seringue d’un millilitre et une aiguille de calibre 29 pour injecter 10 % de fluorescéine ou 10 % de FITC diluée dans une solution saline par la veine de la queue. Allumez ensuite la source laser et placez un filtre à densité neutre pour atténuer l’excitation de la lumière bleue pendant l’alignement.

Mesurez la puissance de la lumière bleue, en vous assurant qu’elle est inférieure à 10 microwatts. Passez ensuite à la lumière de tomographie par cohérence optique, en veillant à ce qu’elle soit proche de 8 milliwatts. Allumez l’alimentation du miroir du galvanomètre, qui est utilisé pour contrôler la direction du laser.

Ajustez la hauteur du globe oculaire pour faire un point laser fixe sur la cornée. Ajustez la position de l’œil pour que le bord de la pupille soit à peu près perpendiculaire au laser. Et décalez le laser à environ 1,5 millimètre du centre apical de l’œil.

Ajustez davantage le support d’animal jusqu’à ce que les images de tomographie par cohérence optique atteignent une qualité optimale. Dans le sens de balayage rapide x-prime, assurez-vous que l’image b-scan en coupe transversale apparaît à plat. Lorsque vous passez à la direction de balayage lent y-prime, assurez-vous que l’image de balayage B en coupe transversale apparaît inclinée en raison du balayage oblique.

Retirez le filtre à densité neutre pour l’excitation de la lumière bleue. Et surveillez le flux en temps réel de la caméra. Une image fluorescente en coupe transversale devrait apparaître, montrant des vaisseaux sanguins à différentes profondeurs.

Ajustez la mise au point du système d’imagerie de fluorescence final pour atteindre la mise au point optimale. Et effectuez des ajustements précis de la position de l’œil dans le plan latéral pour obtenir une qualité d’image optimale d’ophtalmoscopie laser à balayage oblique. Après l’alignement, commencez à acquérir simultanément une angiographie par tomographie par cohérence optique et une angiographie volumétrique à la fluorescéine.

Cette image montre une image de tomographie par cohérence optique en coupe transversale de la rétine d’un rat. Il s’agit d’une angiographie par tomographie par cohérence optique, ou image OCTA, de la même région. Et une ophtalmoscopie laser à balayage oblique et une angiographie volumétrique à la fluorescéine image, une angiographie à la fluorescéine en coupe transversale, ou oSLO-VFA.

Analogue à la tomographie par cohérence optique b-scan. Par rapport à l’OCTA, l’ophtalmoscopie laser à balayage oblique et l’angiographie volumétrique à la fluorescéine identifient clairement les capillaires de la couche plexiforme externe. La couche superficielle de la rétine est représentée ici sur une image OCTA.

Des artefacts sous forme de bandes verticales sont visibles dans l’image. oSLO-VFA évite les artefacts de mouvement en utilisant le contraste d’émission de fluorescence. À l’intérieur de la couche intermédiaire rétinienne, les vaisseaux plongeant verticalement sont clairement indiqués sur l’image oSLO FA.

Mais cela n’apparaît pas dans l’OCTA. Lors de cette procédure, il est important d’éviter l’exposition continue au laser sur l’œil pendant plus de deux minutes. Évitez le dessèchement de la cornée et laissez l’œil se reposer au moins 30 secondes entre les coupes d’imagerie en bloquant la lumière.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie de souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de fluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires. Comme la façon dont des types spécifiques de cellules rétiniennes peuvent changer, et le fait de tirer des variables observées avec des maladies connues.