Une approche de mutagenèse roman Saturation : Seule étape caractérisation des protéines régulatrices accepteurs en ARN utilisant Phosphorothioates

L’objectif global de cette approche phosphorothioate dans l’ARN est d’effectuer une mutagenèse de saturation en une seule étape. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire, telles que la régulation des gènes. Le principal avantage de cette technique est qu’en une seule étape, on peut accomplir la mutagénèse de saturation d’un site de liaison protéique dans l’ARN.

Une étape clé de ce protocole de mutagénèse de saturation en une seule étape consiste à doper la matrice d’ADN avec des nucléotides de type non sauvage au sein du site de liaison aux protéines. Synthétisez d’abord une amorce T7 par synthèse chimique sur un synthétiseur d’ADN. Ensuite, synthétisez un oligonucléotide dopé correspondant au site de liaison de la protéine.

Dans cet exemple, la séquence soulignée contient le complément inverse du site de liaison de la protéine sexuellement létale de la drosophile, chaque site de dopage étant représenté par un X. Utilisez un rapport de 90 % de nucléotide de type sauvage contre 10 % de nucléotide de type non sauvage pour chaque site de dopage. La séquence en vert est complémentaire à la séquence d’amorce T7 et est le promoteur T7 de la transcription in vitro. L’étape suivante de ce protocole est la synthèse d’ARN séparés avec chaque nucléotide phosphorothioate, suivie d’un radiomarquage à 5 extrémités premières de l’ARN.

Synthétisez des ARN pour chaque phosphorothioate dans une réaction de transcription de 20 microlitres. À chaque tube de microcentrifugation, ajoutez les éléments suivants : un tampon de transcription T7, un oligonucléotide micromolaire T7, un oligonucléotide dopé micromolaire, 10 millimolaires de DTT, deux millimolaires de GTP, un millimolaire d’ATP, un CTP et un UTP, et deux unités par microlitre d’ARN polymérase T7. Ajoutez 0,167 millimolaire d’ATP alpha-thio dans un tube et 0,05 millimolaire d’UTP alpha-thio dans l’autre tube.

Incuber les mélanges réactionnels de synthèse d’ARN à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, ajoutez 2,5 microlitres d’alpha phosphatase thermolabile et 2,5 microlitres de tampon de phosphatase 10X à chaque échantillon d’ARN. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 à 30 minutes pour éliminer les phosphates 5-prime.

Inactivez l’enzyme phosphatase alcaline en chauffant à 80 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes. Les autres étapes impliquent l’utilisation de la radioactivité et doivent être effectuées à l’aide de précautions appropriées et d’un écran en plexiglas pour protéger contre la radioactivité. Pour radiomarquer l’extrémité 5 prime de l’ARN déphosphorylé, utilisez un microlitre de polynucléotide kinase T4 et un microlitre d’ATP gamma P32 dans un volume de réaction de 10 microlitres.

Incuber les mélanges réactionnels à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Inactiver l’enzyme polynucléotide kinase T4 en chauffant à 65 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Exécutez les réactions dans un gel de polyacrylamide dénaturant à 10 %.

Localiser l’ARN sur le gel par autoradiographie et exciser la tranche de gel contenant l’ARN radiomarqué. Écrasez la tranche de gel dans un tube de microcentrifugation en la pressant contre le côté avec une pointe de pipette, puis ajoutez le tampon de protéinase K. Faites pivoter les tubes à température ambiante de deux heures à toute la nuit.

Ensuite, centrifugez la suspension de gel, récupérez la solution tampon et jetez le gel. Extrayez chaque solution deux fois avec un volume égal de phénol chloroforme. Après cela, extrayez la solution une fois avec du chloroforme.

Prélevez la phase aqueuse et ajoutez-y 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires, pH 5,2, d’ARNt porteur ou de glycogène, et 2,5 volumes d’éthanol. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pendant une heure. Centrifugez les échantillons dans une microcentrifugeuse à grande vitesse à 16 873 fois g pendant cinq à 10 minutes.

Retirez la solution tampon d’éthanol avec précaution sans déranger la pastille d’ARN. Lavez les granulés avec de l’éthanol à 70 % et centrifugez-les pendant deux à cinq minutes. Retirez l’éthanol avec précaution et faites sécher les granulés à l’air.

Remettre en suspension chaque granulé dans 20 à 50 microlitres d’eau traitée au DEPC. Conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Le concept de partitionnement par interférence est illustré ici.

Au cours du processus de liaison aux protéines, les molécules d’ARN se répartissent entre la fraction liée aux protéines et la fraction non liée. Si un nucléotide spécifique à une position donnée interfère avec la liaison aux protéines, il sera préférentiellement exclu de la fraction liée aux protéines. Par la suite, l’iode est utilisé pour cliver les ARN aux sites d’incorporation du phosphorothioate.

Pour commencer cette procédure, mettez en place les réactions de liaison protéine-ARN avec chaque réaction contenant 10 millimolaires de Tris-HCl, un millimolaire de DTT, 50 millimolaires de chlorure de potassium, 0,5 unité par microlitre d’inhibiteur de RNase, 0,09 microgramme par microlitre d’albumine sérique bovine acétylée, un EDTA millimolaire, 0,15 microgramme par microlitre d’ARNt, 5 microlitres d’ARN radiomarqué et six microlitres d’une concentration appropriée de la protéine. Incuber les réactions de liaison aux protéines à 25 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Séparez la fraction d’ARN liée aux protéines de la fraction non liée par une liaison par filtre nitrocellulosique.

Appliquez la réaction de liaison sur un filtre à nitrocellulose relié à un collecteur sous vide à température ambiante. Seul le complexe protéique de l’ARN sera conservé sur le filtre tandis que l’ARN non lié circule à travers le filtre. Coupez la partie du filtre à nitrocellulose contenant l’ARN radioactif retenu en petits morceaux pour l’adapter à un tube de microcentrifugation et ajoutez suffisamment de tampon de protéinase K pour immerger les morceaux de filtre.

Éluer l’ARN des morceaux filtrants pendant deux à trois heures ou toute la nuit. Ensuite, transférez la solution de chaque tube dans un nouveau tube et extrayez avec du phénol chloroforme et du chloroforme, comme démontré précédemment. Récupérez la phase aqueuse et ajoutez-y 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires, pH 5,2 et 2,5 volumes d’éthanol et incubez au congélateur.

Après la centrifugation, le lavage et le séchage de l’ARN, comme indiqué précédemment, remettre l’ARN en suspension dans de l’eau traitée au DEPC. Toutes les étapes impliquant de l’iode doivent être effectuées dans une hotte aspirante. Pour cliver les ARN aux sites d’incorporation du phosphorothioate, ajoutez à chaque échantillon d’ARN un millimolaire d’iode dans 20 microlitres d’eau traitée au DEPC contenant jusqu’à 10 microgrammes d’ARNt porteur.

Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Précipitez l’ARN clivé en ajoutant de l’acétate de sodium et de l’éthanol comme indiqué précédemment. Mettre en suspension l’ARN clivé dans un colorant de charge pour dénaturer les gels.

Après chauffage, chargez les échantillons dans un gel de polyacrylamide dénaturant à 15-20 % et séparez les fragments d’ARN par électrophorèse. Exposez le gel de polyacrylamide à un film radiographique et détectez les bandes dans la fraction liée par rapport au pool total à l’aide de l’autoradiographie. Ce schéma illustre le concept de partitionnement par interférence.

Dans le couloir T, la fraction totale de l’ARN, l’intensité de la bande est à peu près égale pour toutes les positions dopées. Dans la fraction d’ARN liée aux protéines, aux positions 1, 4 et 7, le nucléotide n’a aucun effet sur la liaison. Cependant, aux positions 3 et 6, il interfère avec la liaison et est exclu de la fraction liée.

En position 5, les interférences sont partielles. Les comparaisons de voies appariées pour chaque nucléotide permettent d’analyser les quatre nucléotides. Cette autoradiographie montre deux paires de voies d’un gel dénaturant.

La voie T est l’ARN total et la voie B est l’ARN lié aux protéines. La ligne verticale marque le site de liaison sexuellement létale. Pour la paire alpha-thio-aline, les bandes 1, 2, 3 et 5 sont présentes dans la fraction d’ARN totale, mais absentes ou significativement réduites dans la fraction d’ARN liée.

Pour la paire alpha-thio uline, les bandes 7 et 8 sont relativement moins intenses dans la fraction liée. Les résidus qui sont préférentiellement exclus de la fraction liée sont importants pour la liaison aux protéines. Une fois que l’ARN est synthétisé et que les 5 premiers extrémités sont marqués, cette technique peut être réalisée en 12 heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le niveau approprié d’incorporation de phosphorothioate et la détermination de la concentration protéique appropriée pour la liaison sont des considérations importantes. Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que des tests fonctionnels appropriés ou des tests in vivo, peuvent être effectuées pour valider le résultat de l’approche de mutagénèse et comprendre la pertinence biologique. Cette technique offre une alternative à d’autres méthodes plus coûteuses ou plus laborieuses, ou les deux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir et de synthétiser une bibliothèque de mutants, d’effectuer des réactions de liaison, d’identifier les nucléotides mutants dans chaque pool et d’analyser quantitativement l’effet des nucléotides de type non sauvage à chaque position testée. N’oubliez pas que travailler avec du polyacrylamide et de la radioactivité peut être dangereux et que des précautions, telles que l’utilisation de gants, d’un échappement approprié et de boucliers radioactifs, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.