La méthode Set de la réplique : Une approche de haut-débit pour mesurer quantitativement Caenorhabditis elegans durée de vie

Des centaines de gènes ont été identifiés dont la fonction affecte le vieillissement d’un organisme. Mais beaucoup de leurs relations sont mal comprises. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine du vieillissement.

À savoir, quelles sont les interrelations génétiques entre les gènes gerA ? Le principal avantage de cette technique est une augmentation du débit, le nombre de prédébats génétiques qui peuvent être mesurés quantitativement simultanément est augmenté d’au moins un ordre de grandeur. Les données de durée de vie, collectées avec cette procédure, peuvent être tracées et analysées à l’aide du logiciel que nous fournissons avec cette publication.

En plus de donner un aperçu de la durée de vie, cette méthode peut également être appliquée à d’autres phénotypes liés à l’âge, tels que la résistance au stress et les changements de régime de santé. Pour cette procédure, créez un nouveau tampon de la sous-bibliothèque ARNi. Tout d’abord, aliquote chaque puits d’une plaque de 96 puits, avec 200 microlitres de LB avec ampicilline, à l’aide d’une pipette à 12 canaux.

Stérilisez un réplicateur à plaques à 96 broches en immergeant séquentiellement les broches dans de l’eau de Javel à 50 %, suivie d’une eau ultra pure. Trempez ensuite les pointes dans de l’éthanol et allumez soigneusement les pointes à la flamme. Ensuite, retirez soigneusement le couvercle en feuille adhésive d’une plaque de bibliothèque de glycérol congelée à 96 puits et broyez doucement mais fermement les pointes du réplicateur de plaque stérilisé dans les puits des stocks de glycérol encore congelés.

Ensuite, inoculez les cultures et scellez la plaque inoculée avec la membrane perméable. Laissez les cultures pousser toute la nuit sur le paillasse. Le lendemain, stérilisez le réplicateur de plaques, retirez soigneusement le sceau de la culture de nuit, puis immergez-y les pointes des broches du réplicateur.

Ensuite, inoculez une plaque rectangulaire de gélose à l’ampicilline LB et à la tétracycline avec les broches. Appliquez une pression uniforme et utilisez un petit mouvement circulaire pour transférer les bactéries sans laisser les taches devenir trop encombrées. Ensuite, incubez les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, pour chaque tranche de 10 répliques de plaques nécessaires, chargez chaque puits d’une plaque profonde de 96 puits avec 1,5 millilitre de LB avec de l’ampicilline. Ensuite, inoculez les puits avec les bactéries cultivées. Ensuite, scellez la plaque avec une membrane respirante, cultivez-la pendant 20 heures en l’agitant.

Les puits de contrôle doivent être dispersés dans les 96 puits, de sorte que lorsque la plaque de sous-bibliothèque de 96 puits est divisée en groupes de 24, chaque division de 24 puits comporte un de chacun des contrôles. Le lendemain, chargez 120 aliquotes de 120 microlitres de la culture, dans les plaques de 24 puits, à l’aide d’une pipette multicanaux à six puits, avec espacement des pointes réglable. Ensuite, les plaques sèches sont découvertes dans une hotte à flux laminaire jusqu’à ce que tout le liquide ait été absorbé.

Ne les laissez pas trop sécher. Assurez-vous de rester concentré lorsque vous aliquotez des cultures liquides, pour vous assurer que la bonne culture bactérienne est placée dans le puits approprié dans la plaque à 24 puits. Les expériences de répliques commencent avec l’ensemble de plaques répliquées indépendantes à 24 puits, chacune ensemencée avec les mêmes clones de bactéries ARNi.

Pour les expériences sur la durée de vie, 15 à 20 animaux L1 sont ajoutés à chaque puits de plaque et laissés croître jusqu’au stade L4. À L4, le FUdR est ajouté à tous les puits à travers les réplicés. Plus tard dans la même journée, une plaque réplique peut être prise de l’ensemble et marquée comme premier point de temps.

Pour marquer la durée de vie, du liquide est ajouté aux puits de la plaque pour induire le mouvement de l’animal. Les animaux qui ne commencent pas à bouger sont poussés doucement avec un pic à vers. Le nombre total d’animaux et le nombre d’animaux morts sont ensuite enregistrés.

La plaque de la première observation est ensuite jetée. Au point d’observation suivant, une autre plaque répétée est prélevée sur l’ensemble et notée de la même manière. Cette opération est répétée à l’intervalle de pointage déterminé.

À chaque fois avec une nouvelle plaque du set de réplication. Continuez à marquer un ensemble de plaques jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’animaux en vie. Tout d’abord, synchronisez une population d’animaux avec la même méthode de préparation à base d’eau de Javel que celle utilisée pour le test traditionnel de durée de vie.

Ensuite, à l’aide d’une pipette à espacement réglable à six puits et d’un réservoir de réactifs, ensemencez 15 à 20 animaux L1 dans chaque puits des plaques à 24 puits préparées. Pendant l’ensemencement des plaques, mélangez périodiquement les animaux L1 dans la solution pour maintenir une distribution uniforme. Maintenant, laissons les animaux se développer jusqu’à L4. Le calendrier de développement de la L4 doit être connu pour ce protocole.

Surveillez périodiquement le développement des vers. Lorsque les animaux atteignent L4, ajoutez 24 microlitres de 50x FUdR dans chaque puits et remettez les plaques dans l’incubateur. L’utilisation d’animaux L4 est essentielle.

Si les hermaphrodites atteignent la maturité reproductive avant d’ajouter FUdR, leur progéniture survivra et mangera la nourriture. À l’inverse, l’ajout de FUdR trop tôt entraîne la rupture des animaux. Aux moments souhaités, utilisez une plaque répétée pour évaluer la viabilité.

Pour ce faire, inondez le puits avec la solution M9. Avant d’évaluer la viabilité chaque jour, sondez tous les puits qui n’ont pas de nourriture, qui semblent contaminés ou qui ont des animaux présentant des défauts morphologiques ou de développement. Pour chaque puits, notez le nombre total d’animaux par puits et vérifiez l’état des vers immobiles, en touchant doucement chacun d’eux sur la tête avec un pic à vers.

Après avoir compté tous les morts immobiles dans une assiette, jetez l’assiette. Pour cette procédure, grow transformed e. Coli pendant la nuit en LB avec ampicilline.

Le lendemain, concentrez les bactéries par centrifugation à 3 000 G pendant 15 à 20 minutes. Remettre les bactéries en suspension dans 1/10 du volume de départ. Ensuite, aliquote 200 microlitres des 10x bactéries sur des plaques de six centimètres.

Préparez trois ou quatre plaques par condition d’essai, et incluez deux plaques supplémentaires en cas de contamination. Séchez les plaques dans un lot à flux laminaire, jusqu’à ce que tout le liquide ait été absorbé ou évaporé. Une fois séchées, conservez les plaques dans une boîte en plastique pendant la nuit à température ambiante pour induire la production d’ARN double brin.

Ensuite, conservez les plaques jusqu’à deux semaines à quatre degrés Celsius. Pour les animaux, collectez des animaux adultes gravides dans M9. Lavez-les deux fois avec M9. Répéter la rotation à l’aspiration. Ensuite, remettez en suspension C.elegans dans quatre millilitres de M9 et ajoutez deux millilitres de solution d’hypochlorite.

Maintenant, faites immédiatement vortex les vers pendant trois minutes, en secouant périodiquement et vigoureusement. Ensuite, sous un microscope à dissection, recherchez un nuage d’œufs. Si le nuage n’est pas visible, vortex les vers pendant 10 à 20 secondes supplémentaires.

Ensuite, lavez rapidement les œufs avec M9, deux fois, comme précédemment. Et remettre en suspension les œufs lavés dans trois millilitres M9. Ensuite, transférez les œufs dans un nouveau tube de 15 millilitres et incubez le tube à 20 degrés Celsius avec une rotation douce, et laissez les embryons éclore pendant la nuit. Le lendemain, déterminez la masse volumique de la solution L1 préparée en calculant le nombre moyen de L1 par microlitre en trois gouttes de 10 microlitres.

Remplissez les plaques préparées de 50 animaux L1 chacune. Installez les plaques dans un incubateur Celsuis à 20 degrés, jusqu’à ce que les embryons se développent jusqu’au stade L4. Le développement normal de L1 à L4 prend environ 40 heures.

Ensuite, pour éviter la production de descendance, ajoutez 160 microlitres de 50x FUdR dans chaque plaque. Ensuite, retirez les mâles, car la durée de vie n’est généralement mesurée qu’avec les hermaphrodites. Une fois terminé, remballez les assiettes dans l’incubateur à 20 degrés Celsius.

Jusqu’à ce que tous les vers soient morts, évaluez leur viabilité sur une base quotidienne. Pour ce faire, touchez doucement chaque nématode immobile sur la tête avec un fil de platine ou un cil. Les animaux non réactifs sont morts et doivent être retirés de la plaque.

Prenez note de toute anomalie au cours de cette routine. Les répliques et les méthodes traditionnelles d’analyse de la durée de vie de C. elegans produisent des résultats similaires avec des animaux N2 de type sauvage. Par exemple, l’inhibition de l’ARNi par mml-1 ou mxl-2 par l’alimentation a considérablement réduit la durée de vie normale.

Cela a été mesuré à la fois par un test de durée de vie traditionnel et par le test de réplique. Une longévité prolongée peut également être détectée. Vu ici, l’ARNi pour mdl-1 ou mxl-1 a significativement augmenté la durée de vie de C. Elegans lorsqu’il a été mesuré par l’une ou l’autre méthodologie.

En utilisant la méthode des répliques, il est possible de quantifier simultanément les changements de durée de vie dans plus de 100 conditions, ce qui ne serait pas raisonnable avec une approche plus traditionnelle. Par exemple, un criblage ARNi basé sur l’alimentation à l’échelle du génome a identifié 159 gènes nécessaires à l’augmentation de la durée de vie conférée par la diminution de la signalisation analogue à l’insuline daf-2. La relation entre la signalisation analogue à l’insuline et ces gènes a été décrite plus en détail en mesurant la durée de vie en bonne santé des animaux.

La santé était indiquée par c. Elegans qui se débattait lorsqu’il était en suspension dans la solution. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’ARNi basé sur l’alimentation pour mesurer la durée de vie de C.Elegans.

Mais l’ARNi est polyvalent et peut être appliqué à de nombreux phénotypes différents. Une fois maîtrisée, la méthode du replica set permet d’évaluer la durée de vie de plus de 100 clones d’ARNi chaque jour, si elle est correctement réalisée. Les points tôt et tard peuvent être marqués rapidement.

Tous les animaux d’un puits seront soit vivants et en mouvement, soit morts. Le pointage prend plus de temps lorsque les animaux commencent à mourir. Échelonnez la mise en place d’essais indépendants en gardant cela à l’esprit.