Name: balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Découvrez la culture de Balanus improvisus pour la biologie marine et l'étude de l'expression génique. Cette méthode permet de produire jusqu'à 50 000 nauplius par semaine avec un taux de développement élevé.

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Cette recherche a été financée par grant 2017-04559 par le Conseil de recherche suédois (VR) et le projet pris en charge front de mer de l’UE à Anders Blomberg. En particulier, la création de la facilité de culture, au cours des années, bénéficie de subventions à par R. Jonsson auprès des agences de financement suivantes : SSF (Fondation suédoise pour la recherche stratégique) grâce au programme de sciences de la mer et la technologie et MISTRA grâce au programme de peinture Marine. Kent Berntsson a joué un rôle dans les premières phases de mise en place de la culturingfacility. Financement supplémentaire pour établir la facilité de culture est venu du Centre pour la biologie Marine de l’évolution (www.cemeb.science.gu.se), qui est financée par une subvention de Linné du suédois recherche conseils FORMAS et VR.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

La culture de barnacle au laboratoire de recherche Marine Tjärnö (Suède) a fonctionné plus de 20 ans et a été utilisée pour des études dans de nombreux domaines de recherche différents. Plus de 30 articles scientifiques ont été publiés qui ont utilisé le système de culture au cours des dernières années, y compris les études en antifouling13,22, hydrodynamique,23, écologie chimique24, le changement climatique16 , Biologie Evolutive5et2de la biologie moléculaire.
Pour éviter la sélection de certaines personnes qui sont plus adaptées à l’environnement de laboratoire (individus qui pourrait ne pas être représentatif de la population sauvage), il est recommandé de recueillir un nouveau stock de géniteurs du champ chaque année. En outre, il est également conseillé de rajeunir la culture chaque année, puisqu’il n’y a à peu près 50-80 % de la mortalité chez les adultes au cours d’une année normale. Toutefois, si le but est de produire des lignées autofécondées ou de mettre en place des études de l’évolution expérimentale, seules les familles élevées en laboratoire doivent être utilisées.
Un bon moment pour recueillir des b. improvisus sur les panneaux au laboratoire de recherche Marine Tjärnö est en juin – août parce qu’à ce moment-là, il y a une bonne provision d’une larve cypris la mer. Vérifiez les panneaux chaque semaine pour voir quand la colonie barnacle commence et supprimer manuellement des autres se sont installés d’espèces b. improvisus (p. ex., les moules, tuniciers, bryozoaires, hydres, némertiens/vers tubicoles et autres espèces de barnacle) de la panneaux (par exemple, avec une brosse à dents). Autour de Tjärnö, il y a trois eaux peu profondes barnacle espèces présentes (b. improvisus, Semibalanus balanoideset Balanus crenatus). Cependant, b. improvisus est le principal fouler de surfaces dures lisses en juillet – août. S. balanoides a sa période de règlement au début du printemps et préfère principalement sur les substrats naturels (p. ex., pierres). B. crenatus peut survenir à faibles effectifs sur les panneaux au cours de l’été.
Il est également possible de démarrer de nouvelles générations balane adulte de cypris cultivées, ce qui serait essentiel si certains Chehalis avec des traits spécifiques ont été établies, ou dans l’étude de l’évolution expérimentale. Pour démarrer de nouvelles générations d’adultes, la plus commode consiste à régler cypris sur panneaux thermoplastiques en laboratoire. Ces panneaux avec cypris nouvellement établis pourrait également être utilisé dans les traitements expérimentaux ou pour exposition sur le terrain. En cas d’urgence, on peut aussi utiliser des adultes sur les rochers d’un site à proximité (par exemple, Idefjorden dans le cas du laboratoire de recherche Marine de Tjärnö) où b. improvisus est fréquente. Ces adultes déjà établies sont traités de la même manière que les adultes sur les panneaux, donc être placés dans des plateaux et alimentés par l’intermédiaire de système. Cellules d’écoulement permet également de créer des panneaux avec balanes25. Voici les accréditifs chambres avec filet sur les côtés où les cypris ne vous contentez pas, avec des panneaux sous la surface du seul établissement pour les larves à plancton.
Il y a plusieurs étapes qui sont essentielles pour mettre en place une culture barnacle fonctionnement à long terme, y compris toutes les étapes de la vie. Les méthodes utilisées pour la culture b. improvisus sont probablement, dans une large mesure, également applicable à d’autres invertébrés marins pélagiques, larves planctoniques. Procédures de culture de certaines espèces sont déjà bien décrites (par exemple, pour les différentes espèces d’huîtres et de moules bleues)26, tandis que pour d’autres invertébrés marins, il y a seulement quelques exemples des cultures à long terme couvrant toute leur vie cycle. Une des premières tentatives réussies de balanes (B. amphitrite) de la culture a été réalisée par Rittschof et al. 15. les ressources financières et personnelles à long terme devraient être en place avant d’envisager la mise en place d’une balane facilité de culture. L’entretien de ce type d’année-autour de barnacle culture nécessite au moins une personne travail mi-temps. Il peut y avoir quelque potentiel pour l’automatisation future de certaines étapes de la chaîne de production, principalement la culture de micro-algues27. En outre, pour réussir, il est essentiel d’avoir accès à de grandes quantités d’eau de mer de haute qualité. La culture de microalgues, Artemia et balanes n’implique pas des procédures particulières de sécurité. Cependant, les essais de certains antifouling substances ou produits chimiques toxiques peuvent devoir des précautions spéciales.
Les panneaux ont été vérifiés plusieurs fois par semaine pour des contaminations. L’eau de mer utilisée dans la culture a été pompé vers le haut d’une profondeur de 40 m dans le Fjord de Koster en dehors du laboratoire de recherche Marine de Tjärnö et était passé à travers deux filtres à sable avant d’entrer dans le circuit d’eau de laboratoire. Si aucun filtrage de l’eau n’avait été faite, il y aurait beaucoup plus de contamination dans la culture. Il est essentiel de nettoyer régulièrement les panneaux dans la culture de détritus et d’autres invertébrés (par exemple, renforcement des stolons hydroïdes et prédateurs némertiens) qui entrent dans le système par le biais de l’approvisionnement en eau de mer sur le terrain. Par exemple, si aucune larve n’est produites malgré le fait que la culture a été bien nourris et autrement semble être en bon état, le problème pourrait être la présence des némertiens qui semblent inhiber l’accouplement. Naturellement, bon nombre des organismes contaminants dans la culture au laboratoire de recherche Marine Tjärnö étaient spécifiques à la côte ouest suédoise, et autres types de contamination des organismes seront répandues et être plus difficile à d’autres endroits. Sur la côte ouest de la Suède, il est rare de trouver de la contamination par d’autres espèces de balanes sur les panneaux. Parfois, la mise en place de S. balanoides a été trouvé, mais il s’agit d’un problème très marginal (tout au plus, un art. balanoides contaminant pour 10 000 échantillons de b. improvisus ). L’absence de contamination des espèces dépendait probablement le régime pour établir de nouvelles cultures durant l’été, quand les larvaefrom b. improvisus ont été très dominante. En outre, il y avait aussi un enrichissement clair de b. improvisus sur les panneaux puisque cette espèce est sélective pour les surfaces lisses,13.
Il est indispensable d’éliminer les balanes adultes morts. Si les coquilles vides sont laissées sur les panneaux, ils peuvent devenir un refuge pour nauplies d’artémias et diverses espèces de contaminants. En outre, il a été remarqué que les individus morts influent sur le bien-être des individus, probablement avec la libération de composés toxiques lors de la décomposition de voisins. Une autre conséquence de la mortalité adulte est que certaines personnes seront laissés seul et loin de tout autres adultes afin de permettre l’accouplement (même si les balanes ont le pénis plus longs dans le monde animal par rapport à sa taille)28. Ces personnes vont survivre mais sont non productives pour les larves. Toutefois, ces individus adultes solitaires doucement peuvent être enlevés sans endommager la plaque de base et être placés horizontalement à proximité d’autres pour permettre l’accouplement. Balanes peuvent également être utilisées en plaçant des panneaux avec un adulte sur chacun, mais assez proche pour que la fécondation croisée peut survenir. De cette façon, les lignées génétiques peuvent être produite14.
Il est essentiel pour produire un flux de haute qualité et nourrir des cultures presque tous les jours. Encore quelques jours sans nourriture peuvent entraîner une libération décroissante des larves. Des essais antérieurs de la composition du régime alimentaire ont montré que les diatomées sont essentielles pour la croissance et la survie des nauplius de barnacle. Plusieurs espèces de diatomées semblent suffisantes comme se nourrir, bien que les cellules petites ou solitaires (moins de 10 µm de diamètre) peuvent être nécessaires pour l’ingestion de la nauplius. L’espèce S. marinoi, c. simplexet T. pseudonana ont tous s’est avérée l’alimentation adéquate pour nauplies de b. improvisus , ainsi que facile à cultiver. En outre, la qualité fourragère est généralement plus élevée en croissance exponentielle des algues. Il a également été signalé que les diatomées sont essentielles pour établir les cultures productives d’amphitrite B.15. Une théorie de l’importance des diatomées est qu’ils ont un profil d’acide gras unique et sont particulièrement riches en acides gras très polyinsaturés 20:529. Il a été démontré que certains acides gras sont importants pour le succès du développement des larves d’oyster30.
Au cours des années, il n’y a eu aucune incidence de maladies nuisibles dans la culture de barnacle. Dans beaucoup de commercial aquaculture d’invertébrés, comme les huîtres et les moules, les maladies sont assez communs et peuvent être très nocifs. Les effets néfastes des virus ont également des populations sauvages. L’huître indigène en France a été remplacé par l’huître portugaise Crassostrea angulata en 1925, mais cette espèce a été anéantie par un iridovirus autour de 1970,31. Plus récemment, il y a eu épisodes de mortalité massive dans l’huître Crassostrea gigas dans les cultures dans le monde entier, ce qui semble être associée à l' herpèsvirus de type 1 d’ostreid32. Aucun rapport sur les agents pathogènes, bactéries ou les virus sur les bernaches n’ont été publiés jusqu'à présent. Cependant, ont observe des séquences du virus dans le génome-projet en cours sur improvisus b., (Alm Rosenblad et al., données non publiées) mais sans aucun lien apparent aux symptômes des maladies. Mélanges d’antibiotiques ont précédemment été appliqués aux cultures afin de minimiser le risque d’infections bactériennes ; Toutefois, cette procédure est actuellement abandonnée et jusqu’ici, cela n’a pas causé des problèmes de contamination.
Si l’eau de mer est chauffée (comme décrit ci-dessus), la surchauffe peut être le risque le plus grave dans la ligne de production de la culture. Bien sûr, il est difficile de protéger contre la surchauffe, même si les capteurs et systèmes d’alerte appropriés peuvent être utilisés (par exemple, envoyer des messages e-mail ou texte à personnes responsables). L’incidence de ce type dans le passé ont entraîné la mort importante d’adultes dans la culture. Ceci peut, bien sûr, être dévastateur et ruiner les investissements à long terme de temps et d’argent. En particulier, ce serait catastrophique si les lignées génétiques ont été établies. Pour assurer la longévité de ces lignes et fixez-les à perte accidentelle, il serait souhaitable d’élaborer une méthodologie de cryoconservation des balanes. Il a été signalé que les larves de l’huître du Pacifique peuvent être congelés vers le bas et relancés avec succès partiel33. Cryobanking a également été un outil précieux pour préserver les ressources génétiques d’un large éventail d’espèces34. Même les nauplii de B. amphitrite sont censés survivre congélation35, et il a été constaté que 20 % des individus congelés en bas avec succès métamorphosé en cypris36. Toutefois, appliquant le gel pour assurer la durabilité à long terme des cultures n’a jusqu'à présent pas été adoptée, mais cela serait en effet nécessaire pour l’entretien des lignes sélectionnées ; ce serait une étape essentielle pour établir fermement b. improvisus dans un modelsystem puissant de marine.
Ici, un protocole a été présenté pour la dissection des tissus différents des adultes b. improvisus (c.-à-d., cirres, soma et manteau). Toutefois, il convient de souligner que les autres tissus peuvent également être extraits. Par exemple, les tissus mous entre le manteau extérieur et intérieur de l’espèce membraneux-base Tetraclita japonica formosana a été soigneusement isolé et utilisé pour une extraction de l’ARN et l’analyse de la RNA-seq de gene expression37. Le protocole d’extraction optimisée décrit décrit ici fournit des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité pour le séquençage d’une quantité minimale de matière première. Tout d’abord, la collection de larves individuels directement dans les tubes d’homogénéisation minimise toute perte lors du transfert d’un tube à l’autre. En outre, parmi les différentes méthodes testées, l’homogénéisation avec perles en céramique s’est avérés pour être le rendement le plus efficace en termes de RNA et intégrité, par rapport à l’homogénéisation de sonication ou un pilon. Lors de la planification pour l’expression des gènes ou des expériences de génomique, il faut garder à l’esprit le défi de la variation génétique élevé de balanes, au moins pour b. improvisus. Barnacle présente une diversité génétique dans la gamme de 3 à 5 %, même dans les régions (Alm Rosenblad et al., données inédites) de codage. Ceci, bien sûr, met les demandes spécifiques sur la conception d’amorces pour l’analyse de qPCR, où plus conservé les régions devraient être identifiées et utilisées comme modèles pour les amorces afin d’obtenir l’expression cohérente des résultats betweenbatches. Des régions conservées de gènes cibles, comme les aquaporines et Na + / K + ATPases, peuvent être identifiés par l’étude de la variabilité de la séquence de ces gènes dans RNA-seq données obtenues à partir des populations de cypris contenant des centaines de personnes. Pour une analyse du génome, ADN est échantillonné. Cependant, obtenir l’ADN de haute qualité de b. improvisus peut être difficile de21.
En conclusion, la culture établie barnacle s’est avéré pour être instrumental dans différents types d’études expérimentales. En particulier, la production de larves tous-an-environ nous permet de réaliser des expériences sans être limité à la période de frai naturelle (pour b. improvisus, c’est au cours de l’été). Les larves obtenues peuvent être utilisés pour effectuer un large ensemble d’études expérimentales, y compris les essais de colonisation, tests de comportement, études sur l’expression des gènes spécifiques, ainsi que génome transcriptome études.

Balanes sont des crustacés marins accompagné d’un adulte sessile et larves nageuses, planctoniques. La plupart des 1 200 espèces de Bernaches vivent dans des eaux peu profondes et beaucoup sont souvent exposés à faible salinité. Une seule espèce, la baie balane Balanus (Amphibalanus) improvise (b. improvisus), peut tolérer presque d’eau douce et Charles Darwin décrit cette espèce d’un petit ruisseau dans l’estuaire du Rio de la Plata en Uruguay1. La salinité de tolow tolérance extrême rend improvisus b. , un modèle particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes osmorégulateur2,3. Ce barnacle préfère des conditions saumâtres, mais est capable de vivre dans les eaux des salinités de psu environ 1,6 à aussi haut que 40 bloc d’alimentation4. C’est l’espèce de barnacle seulement trouvée dans l’eaux saumâtres de la Baltique. B. improvisus est censé provenir de la côte est du continent américain mais aujourd'hui se trouve dans le monde entier en raison de la dispersion par expédition5. C’est un important organisme salissants et trouve couramment sur les rochers, jetées et les coques de bateau et est donc d’intérêt général pour la compréhension des mécanismes de l’encrassement biologique sur les constructions dans les eaux marines et saumâtres6,7.
Comme pour la plupart des autres Bernaches, b. improvisus est hermaphrodite avec multiples métissages ; la reproduction se fait par le biais de l’accouplement entre individus voisins utilisant un pénis allongé et la fécondation interne. La période de reproduction est principalement de mai à septembre. B. improvisus a sept stades larvaire pélagiques (six nauplii suivies d’un cypris étape8). Les écoutilles d’ovule fécondé en une larve nauplius qui est nageant librement et se nourrit dans la colonne d’eau pour jusqu'à plusieurs semaines avant la mue en une larve cypris sans alimentation. Les cypris utilise plusieurs indices pour trouver un emplacement convenable pour régler et puis subit une métamorphose dans une balane juvénile sessiles9. Les espèces peuvent être cultivées en laboratoire et ont une durée de vie de 1 à 2 ans dans la mer (2 à 3 ans en culture en laboratoire). En moyenne, b. improvisus jusqu'à 10 mm de diamètre (avec un maximum d’environ 20 mm) et atteint une hauteur maximale d’environ 6 mm (même si elle peut grandir dans des conditions surpeuplées). L’espèce peut être identifié par son enveloppe même calcaire lisse (blanc ou gris), la base de calcaire radialement à motifs de la plaque de la coquille et la forme des plaques tergal1,10.
La nonnette b. improvisus a plusieurs caractéristiques avantageuses comme un modèle pour les études d’osmorégulation, en mettant l’accent sur les mécanismes moléculaires et physiologiques ainsi que des interactions écologiques et des conséquences évolutives. Il est aussi largement utilisé comme modèle pour les enquêtes de régler la biologie, en particulier en ce qui concerne la recherche d’antifouling et les mécanismes impliqués7,11,12,13. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de larve cypris pour études. La capacité à la culture ce barnacle à travers son cycle de vie entier tout au long de l’année est, par conséquent, un atout majeur pour permettre à différents types d’études moléculaires et mécanistes. En outre, sa présence dans les eaux saumâtres/marine dans le monde entier permet une combinaison de terrain et les études expérimentales. Reproduction contrôlée peut également produire des familles des pedigrees connues pour la culture à long terme14, et un temps de génération de quelques mois peut permettre une évolution expérimentale à long terme. Il existe aussi un génome de projet et plusieurs transcriptions, et ces ressources ont été utilisées pour le clonage de plusieurs gènes (par exemple, les gènes d’importance dans l’osmorégulation)2,3.
Ce protocole vise à décrire comment établir et maintenir une culture de la nonnette b. improvisus tout au long de l’année afin d’effectuer des études d’expression génique sur adultes ou larves de cet organisme. Rittschof et al. 15 a brièvement décrit une méthode pour la culture des Bernaches de la libération de nauplies au règlement des cypris pour les espèces Balanus amphitrite. Le protocole a été adapté pour la culture tout au long de l’année des b. improvisus au laboratoire de recherche Marine Tjärnö (Suède), et une description détaillée de toutes les étapes de la chaîne de production est exposée, y compris la production et l’élevage de barnacle les larves, ainsi que l’administration d’aliments pour les adultes et les larves. Pour un aperçu de l’ensemble de la procédure, voir la Figure 1. L’utilisation du système de culture est illustrée avec certaines configurations expérimentales communes et illustrée dans des études de génomique fonctionnelle de Na+/k+ ATPase et aquaporines, élucider leurs fonctions possibles à l’osmorégulation2, 3. Il est parfois essentiel d’étudier l’expression des gènes dans des tissus spécifiques, et quelques-unes des bases de la dissection barnacle seront couverts. Un bon approvisionnement en eau de mer de haute qualité, la mise en culture de la nonnette b. improvisuset potentiellement beaucoup d’autres espèces, devrait être possible dans les laboratoires marins dans le monde entier.

<table><tbody><tr><td>Panneaux en plexiglas (polyméthacrylate de méthyle)</td><td>Produit en plastique, Bromma, Suède</td><td></td><td>Verre transparent</td></tr><tr><td>Bouteille</td><td></td><td></td><td></td>en PET de 1,5 L</tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE Aquaculture, Belgique</td><td></td><td>Nous avons testé différentes entreprises ; c’est vraiment la meilleure</td></tr> <tr><td>Skeletonema marinoi (souche CCAP 1077/5)</td><td>CCAP (Collection de cultures d’algues et de protozoaires) ; Ecosse&nbsp ;</td><td>souche 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>Chaetoceros simplex var. gracilis (souche CCAP 1085/3)</td><td>CCAP (Collection de cultures d’algues et de protozoaires) ; Ecosse&nbsp ;</td><td>souche 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>Système de filtration à cartouche Millipore</td><td>Millipore&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cartouche avec une taille nominale de pores de 0,2 & micro ; m</td><td>Millipore&nbsp ;</td><td>cartouche CWSS01S03</td><td>Haute capacité pour les grands volumes</td></tr><tr><td>bouteille en polycarbonate</td><td>Nalgene</td><td></td><td>ARN autoclavable</td></tr><tr><td>plus tard</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&nbsp ; Solution de fixation pour préserver l’ARN</td></tr><tr><td>TURBO KIT SANS ADN</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td>AM1907</td><td>Kit d’ADN pour prélever l’ADN de l’ARN préparé</td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc iScript Kit de synthèse d’ADNc</td><td>Biorad</td><td>1708890</td><td>SYBR</td></tr><tr><td>Green supermix</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>Dye pour QPCR</td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Extraction d’ARN d’adultes ou de nombreux cypridés</td></tr><tr><td>Homogénéisation des tissus mous CK 14, tubes de 2 ml</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>Perles en céramique pour l’homogénéisation</td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Extraction d’ARN de quelques cyprides</td></tr></tbody></table>

balane balanus improvisus comme modèle marine - culture et l’expression des gènes

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Balanes sont des crustacés marins accompagné d’un adulte sessile et larves nageuses, planctoniques. La balane Balanus (Amphibalanus) improvisus est particulièrement pertinente comme un modèle pour l’étude des mécanismes de l’osmorégulation en raison de son extrême tolérance à la salinité faible. Il est aussi largement utilisé comme un modèle de décantation de biologie, en particulier en ce qui concerne la recherche d’antifouling. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de larve cypris pour études. Un protocole pour la culture tout au long de l’année des b. improvisus a été développé et une description détaillée de toutes les étapes de la chaîne de production est décrit (p. ex., la mise en place de cultures adultes sur les panneaux, la collecte et l’élevage du larves de balanes et l’administration d’aliments pour les adultes et les larves). Aussi, la description fournit des conseils sur le dépannage et discute des paramètres critiques (par exemple, l’élimination de la contamination, la production d’aliments de qualité, les effectifs nécessaires et l’importance de la qualité d’eau de mer). Chaque lot du système de culture au maximum donne environ 12 000 nauplies et peut livrer quatre lots dans une semaine, donc jusqu'à presque 50 000 larves par semaine peuvent être produites. La méthode utilisée pour la culture b. improvisus est, probablement, dans une large mesure également applicable à d’autres invertébrés marins avec libre-swimminglarvae. Protocoles sont présentés pour la dissection des tissus différents pour adultes ainsi que la production d’ARN de haute qualité pour les études sur l’expression génique. Il est également décrits comment des adultes et cypris élevés peuvent être utilisées dans un large éventail de conceptions expérimentales pour étudier l’expression des gènes en fonction de facteurs externes. L’utilisation de bernacles cultivées dans l’expression des gènes est illustrée avec des études de rôles osmorégulateurs possibles de Na+/k+ ATPase et aquaporines.

Avec la procédure décrite pour la mise en culture des balanes adultes de b. improvisus, jusqu'à quatre lots de nauplius larves peuvent être produits par semaine. Il serait possible de recueillir les larves nauplius presque tous les soirs, mais cela requiert plus de personnes et d’infrastructures (avec beaucoup de bernacles dans le stock de géniteurs, une culture publiera les larves en continu). Un autre facteur limitant pour la production de larves semble être la disponibilité des aliments de haute qualité, en particulier au sujet de la diatomée Skeletonema. Au maximum, chaque lot provenant du système de culture se compose d’environ 12 000 nauplius, jusqu'à 50 000 nauplius par semaine peut donc être cultivé. Cependant, quelques semaines, il peut y avoir jusqu'à dix fois moins les larves produites. Un seul adulte peut produire jusqu'à 7 000 larves par jour14, ce qui signifie que 1-2 adultes libèrent des larves pour chaque lot. Moins d’une semaine, environ 70 à 90 % des nauplies recueillies deviendra cypris (produisant environ 30 000 cypris par semaine, au maximum) qui peut être utilisé pour les essais de colonisation et les études moléculaires.
Il convient de souligner qu’il existe des variations dans les caractéristiques de cypris entre les lots, et en général, il y a des grandes variations entre les lots que dans les lots. Par exemple, le succès de décantation dans les essais de colonisation varie entre 30 et 70 % pour les différents lots. Probablement, cela est dû à la variation génétique individuelle entre les paires spécifiques des adultes libérant des larves pendant les périodes d’échantillonnage différentes. Il est, bien sûr, recommandé que les expériences répétées (réplique biologique) devraient inclure cypris d’un certain nombre de lots si les déclarations plus générales concernant les résultats doivent être effectués. La variation de lot met exigences sur le plan expérimental, où les contrôles appropriés et les normalisations en études d’expression de gène doivent être appliquées. Cependant, même après que plusieurs procédures de normalisation statistique ont été mises en œuvre qui réduisent considérablement la variation entre les lots, certains effets du lot sont habituellement toujours apparentes (données non publiées).
Suivant le protocole fourni, il est possible d’obtenir, en moyenne, 500 ng d’ARN de haute qualité de cypris aussi peu que 20, quel que soit le stade de l’établissement barnacle (tableau 1). La qualité de l’ARN est habituellement mesurée par le ratio entre les pics de 18 s et 28 (la position attendue des deux sommets sont indiqués à la Figure 4). Toutefois, dans le cas de balanes et beaucoup d’autres arthropodes, l’ARNr 28 s tombe en panne lorsqu’il est chauffé (dans le cadre de la méthode d’analyse) et migre avec le pic de 18 s20. C’est pourquoi il est, en principe, un seul pic de rRNA dans ce type d’analyse pour les balanes. Il ressort de ce test (Figure 4) qu’une homogénéisation de perles en céramique donne l’ARN la plus haute intégrité et qu’il est, par conséquent, la méthode de choix. L’ARN est suffisante en quantité et en qualité pour générer des bibliothèques de séquençage de haute qualité pour le séquençage, aboutissant à une moyenne de 70 millions de lectures par échantillon (le nombre de lectures, dépend bien sûr, le niveau du multiplexage au cours de la séquence). La quantité d’ARN est également suffisante pour l’ARNC synthèse et qPCR expression analyse d’un grand nombre de gènes.
La figure 5 illustre le résultat des analyses de qPCR d’aquaporines et de Na+/k+ ATPase (NAK1) splice variantes, où les modifications de l’expression ont été étudiées pour répondre aux changements dans les signaux environnementaux2,3. Une comparaison de l’expression relative de la longue et courte splice variantes de NAK1 montre une double augmentation pour l’ARNm NAK1 long faible salinité en ce qui concerne le court NAK (Figure 5A). Par conséquent, les données indiquent que l’épissage alternatif rend la forme longue prédominant dans des conditions de faible salinité. Dans le cas des aquaporines, il est évident que les deux paralogues transport de l’eau de AQP1 et AQP2 affichent l’expression différentielle (Figure 5B). En particulier, dans le tissu du manteau, il est évident que la AQP1 est nettement diminuées à des salinités inférieures, qui n’est pas considéré pour AQP2. Au lieu de cela, AQP2 affiche une expression légèrement accrue à des salinités inférieures, mais dans le soma. Ces résultats fournissent une base pour enquêtes des rôles fonctionnels des différents transporteurs ioniques b. improvisus et des aquaporines dans l’osmorégulation barnacle.
<img alt="Schéma du cycle de vie marin : échantillonnage d’ADN/ARN, culture de nauplies à cyprides, processus de fixation des adultes." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Vue d’ensemble de toute culture de procédure et l’extraction de l’ARN pour les études sur l’expression génique chez les adultes. Pour initier une nouvelle culture, les panneaux sont attachées à un cadre et déployé dans la mer à 1-3 m de profondeur. Après plusieurs semaines, les panneaux avec les adultes/adolescents sont placés verticalement dans les racks dans les bacs en laboratoire. Chaque plateau contient environ 40 panneaux avec des adultes. Avec environ 100 adultes par panneau, en total ≈ 4 000 individus adultes sont cultivées par plateau. Les balanes adultes sont nourris avec des artémias et peut être gardés an-autour. Les larves nauplius sont prélevés plusieurs fois par semaine depuis les plateaux via un filtrage à travers un tamis. Les nauplies collectées sont transférées à godets maintenue à 26 ° C dans un bain d’eau et nourris avec des microalgues. Nauplii sont élevés jusqu'à ce qu’ils muent dans cypris sans alimentation, qui sont perçus par le filtrage. Nouveaux panneaux peut être établi en laboratoire par la décantation des cypris sur panneaux, soit pour fournir de nouveaux panneaux pour l’année-autour de la culture, ou d’être utilisée pour spécifiques montages expérimentaux avec des conditions extérieures altérées. ARN est ensuite extrait de mineurs / d’adultes à la fin de l’expérience ou à des moments spécifiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Expérience de filtration aquatique ; l’équipement et les étapes du processus ; installation de séparation des sédiments ; recherche." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Images de quelques étapes importantes dans la procédure culture. (A), cette image montre les images avec des panneaux de collecte de nouvelles populations sur le terrain. (B) cette image montre les panneaux avec des balanes adultes de b. improvisus dans les paniers qui sont placés dans des plateaux. Les panneaux sont placés environ 2 cm de distance. (C), cette image montre les plateaux avec la balane, panneaux et le réservoir d’alimentation à gauche. De chaque plateau, il y a une prise où les tamis sont placées pour la collecte des larves nauplius. (D) cette image montre que la production d’artémia d’alimentation pour les balanes adultes. (E) cette image montre l’élevage de nauplies en seaux placés dans un bain d’eau réglé à 26 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme d’anatomie des balanes ; plaques operculaires, coquille, détails du corps ; étude biologique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Description des étapes initiales de la dissection des balanes adultes : retirer le corps de sa coquille. Grab (A) une des plaques operculaires en insérant les pinces doucement à travers l’ouverture. Tirer doucement pour enlever la plaque et exposer l’animal. (B) retirer l’animal en saisissant la partie soma juste en dessous les cirres. (C), ce tableau montre l’anatomie générale de balanes acorn. Le manteau et potentiellement fécondés (dans l’ovaire) restent dans la cavité de la coquille lorsque le corps est tiré. Une note sur l’anatomie des balanes (pour un exposé plus approfondi, voir Anderson)9: les plaques murales d’une balane pente vers l’intérieur, et ensemble, elles forment un cône du volcan-like. Une ouverture, l’ouverture, est couverte par les deux plaques operculaires, qui forment une porte, ou l’opercule, pour fermer l’ouverture. Balanes Acorn ont généralement une plaque basale calcaire qui est collée fermement au substrat ; Cependant, certaines espèces de balanes n’ont pas ce plateau calcaire (p. ex., S. balanoides). Balanes sécrètent l’exosquelette du manteau fortement pigmenté (la carapace). La surface extérieure de la double couche du manteau est calcifiée pour devenir rigide, tandis que la surface intérieure du manteau n’est pas calcifiée et est donc flexible. À l’intérieur de l’ouverture, les cirres sont présentes en position rétractée. Ce sont les appendices thoraciques qui balanes utilisent pour l’alimentation de la suspension. Les ovaires sont situés à proximité de la base de la balane, tandis que les testicules se trouvent dans le soma. Ce chiffre a été adopté de Panova et al. 21 a été publié avec la permission de Springer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphique du temps de fluorescence en fonction de l’intensité, analyse des données des pics d’émission, étude spectroscopique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Détermination de l’intégrité des ARNr par électrophorèse capillaire. RNA a été préparé par deux méthodes différentes d’homogénéisation : la sonication (A) et (B) les perles en céramique. L’unité sur l’axe des ordonnées, FU, est synonyme d’unités de fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagrammes à barres comparant les effets de la salinité et de la pCO₂ sur l’expression de NKA-L1/NAK-S ; Expression de l’aquaporine dans les tissus." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : Expression génétique résulte de deux études différentes de gènes importants pour l’osmorégulation chez b. improvisus. (A), ce panneau indique l’expression différentielle telle que mesurée par qPCR de variants d’épissage de la Na+/k+ ATPase NAK1 en réponse à différentes salinités et BCP2 niveaux3. Dans le traitement de faible salinité, l’expression de l’isoforme longue (NAK1-L) est augmentée par rapport au court (ANOVA, P &lt; 0,001). (B), ce panneau indique l’expression des aquaporines chez les adultes de b. improvisus lors de leur exposition aux différentes salinités2. qPCR a servi à déterminer les niveaux d’expression aquaporin relativement à l’actine. Les individus adultes ont été incubés à 3 différentes salinités (PSU 3, 20 et 33) pendant 14 jours. Pour la préparation d’ARN, le soma, les cirres et manteau des adultes ont été séparés. Dans les deux figures, barres d’erreur indiquent l’écart-type. Le ** et *** indiquent le niveau de signification (ANOVA), 0,01 à 0,001, respectivement. Ces chiffres ont été modifiés de Lind et al. 2 , 3. les deux chiffres sont publiés avec la permission de PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Phase de colonisation</td>
			<td>Montant total de l’ARN (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nage libre</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exploration : Recherche étroite</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cypris ci-joint</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nouvellement métamorphosés juvénile</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : rendements d’ARN. Ce tableau indique la quantité de RNA extraite avec un kit de préparation d’ARN de piscines de 20 individus de cypris recueillis à différentes étapes au cours du processus de règlement.

La balane Balanus (Amphibalanus) improvisus est un modèle pour étudier l’osmorégulation et antifouling. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de la larve cypris. Ici, un protocole pour la cultiver tout au long de l’année des b. improvisus est décrite, y compris la production de larves. L’utilisation de bernacles cultivées dans des études d’expression génique est illustrée.

balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

L’installation d’élevage peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’écologie larvaire, de l’encrassement biologique et de la biologie évolutive. Plus précisément, il peut être utilisé dans des études sur les interactions récepteur-ligand lors de la fixation larvaire, le développement de nouvelles technologies antifouling et l’évolution et la fonction des gènes impliqués dans l’osmorégulation. Le principal avantage de cet organisme modèle est que la balane Balanus improvisus est robuste, se reproduit toute l’année et a une durée de génération relativement courte.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’élevage des balanes, elle peut également être appliquée à l’élevage d’autres organismes marins. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison du grand nombre de détails importants pour le succès, tels que l’approvisionnement en eau de mer de bonne qualité, la production robuste d’aliments de haute qualité et une attention constante au nettoyage et à l’alimentation des cultures. Martin Ogemark et Anna-Lisa Wrange, techniciennes et chercheuses travaillant avec les balanes, feront la démonstration de la procédure.Pour commencer, installez des cadres pouvant contenir plusieurs panneaux thermoplastiques transparents. Percez deux trous dans les coins supérieurs de chaque panneau et utilisez des serre-câbles pour fixer les panneaux aux cadres. Pour ramasser les balanes adultes, déployez les panneaux verticalement à une profondeur d’un à trois mètres dans les eaux calmes.Après avoir laissé les balanes s’installer et atteindre cinq millimètres de diamètre, apportez les panneaux dans le laboratoire. Placez ensuite les panneaux verticalement dans un support avec des rainures fraisées dans un plateau en polyéthylène. Tout d’abord, à l’aide de ruban adhésif non toxique et résistant à l’eau, collez cinq panneaux ensemble pour créer un cube ouvert en haut.Placez le cube dans un petit plateau et remplissez-le d’eau de mer. Ensuite, ajoutez environ 200 cypridés en haut du cube. Tous les deux jours, nourrissez les balanes juvéniles avec 100 millilitres de Skeletonema marinoi.Après deux à trois semaines, les panneaux du cube doivent contenir des juvéniles établis d’au moins cinq millimètres de diamètre. Démontez le cube et déplacez les panneaux dans des plateaux avec de l’eau de mer qui coule. Pour récolter les nauplies d’Artemia, éteignez d’abord la pompe d’aération et noircissez la bouteille, puis éclairez la partie inférieure de la bouteille pendant 10 minutes.Les nauplii d’Artemia éclos nageront vers la lumière. Les kystes non éclos couleront au fond, tandis que les coquilles de kystes flotteront vers le haut. Ouvrez la pince au fond et collectez la fraction intermédiaire sous forme de population dense de nauplies d’Artemia nageurs.Pour nettoyer les panneaux avec des balanes adultes, vaporisez-les doucement d’eau douce et enlevez tout salissure avec une brosse à dents souple. Nettoyez les plateaux sans balanes et les tubes avec de l’eau douce chaude. Ensuite, placez un tamis dans le plateau en polyéthylène avec un orifice de trop-plein.Récupérez les larves de balanes qui se déposent dans le tamis pendant la nuit. Remplissez ensuite un seau avec 20 litres d’eau de mer filtrée et un litre d’un mélange de microalgues de diatomées pour créer une densité de 50 000 diatomées par millilitre. Transférez les nauplies de balanes précédemment collectées dans un plat de cristallisation et illuminez le plat par le côté.Ensuite, à l’aide d’une pipette, récupérez les nauplii qui nagent vers la lumière et transférez-les dans un autre plat. Transférez les nauplii dans un bécher contenant un litre d’eau de mer filtrée pour le comptage. Ensuite, ajoutez un litre de nauplii dans le seau préalablement préparé.Après trois jours, utilisez un tamis de 90 micromètres pour recueillir les nauplies de balanes, puis nettoyez le seau, remplissez-le d’eau de mer filtrée et ajoutez de nouvelles diatomées et les nauplies de balanes. Après deux à trois jours supplémentaires d’incubation, utilisez un tamis de 320 micromètres sur un tamis de 160 micromètres pour séparer les nauplies de balanes non muées des cyprides. Après avoir mis en place quatre bouteilles de quatre litres pour la culture de microalgues, placez les bouteilles à la lumière à une intensité de 50 à 100 micromoles par mètre carré.Récoltez les cultures lorsqu’elles sont suffisamment denses pour être utilisées pour l’alimentation. Tout d’abord, sélectionnez des individus de grande taille et retenez la nourriture pendant deux jours avant la dissection. Ensuite, nettoyez la coquille de balane avec une brosse à dents et rincez-la à l’eau pour minimiser la contamination par d’autres espèces présentes dans l’environnement.Placez une balane individuelle sur une surface plane pour la dissection, puis insérez la pointe d’une paire de pinces entre les plaques tergales et scutales. Saisissez une assiette et tirez-la doucement pour la retirer. Ensuite, utilisez des pinces pour saisir le cirri et tirez le bernacle tout droit.Enfin, placez les balanes disséquées directement dans une solution d’éthanol ou d’ARN stabilisant à 96 % pour la fixation. Avec le protocole décrit ici, jusqu’à quatre lots de larves de nauplies nonnettes peuvent être produits en une semaine. Au maximum, chaque lot du système de culture se compose d’environ 12 000 nauplii, ce qui signifie que jusqu’à 50 000 nauplii peuvent être cultivés par semaine.En l’espace d’une semaine, 70 à 90 % des nauplii collectés se transformeront en cypridés, ce qui donnera environ 30 000 cypridés par semaine. Une moyenne de 500 nanogrammes d’ARN de haute qualité a été obtenue à partir d’aussi peu que 20 cypridés individuels, quel que soit le stade de fixation. Chez les balanes, l’ARNr 28S se décompose lorsqu’il est chauffé.L’homogénéisation par des billes de céramique confère à l’ARN la plus grande intégrité, ce qui en fait la méthode privilégiée pour manipuler les tissus de balanes et d’arthropodes. À l’aide de l’analyse qPCR, une augmentation de deux fois a été observée pour les variantes longues de l’ARNm NAK1 et une faible salinité par rapport aux variantes courtes de NAK. Cela indique que la forme longue est prédominante dans des conditions de faible salinité.Quelques semaines de formation sont nécessaires pour maîtriser les différentes étapes de l’élevage des balanes. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est particulièrement important de minimiser la contamination à toutes les étapes du flux de travail de culture. Après son développement, cette technique d’élevage a joué un rôle déterminant dans notre compréhension de l’écologie, de la physiologie et de la biologie moléculaire des balanes.C’est aussi une pierre angulaire importante pour faire du balane Balanus improvisus un puissant système de modèle marin.

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Environment

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Le hawaiensis amphipode Parhyale est un organisme modèle prometteur pour l'étude de l'embryologie crustacé et le développement des arthropodes et l'évolution comparatives. Ce protocole décrit une méthode de suppression manuelle de blastomères simples à partir d'embryons à un stade préliminaire de clivage de Parhyale.

Ablation d&#39;une cellule unique de huit cellules d&#39;embryons de crustacés amphipodes les<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Méthodes qui produisent des embryons morphant sont indispensables pour étudier les mécanismes de développement et les réseaux de régulation génétique. L'étoile de mer Patiria miniata est un système de modèle émergent de ces études. Nous présentons ici un protocole pour obtenir des gamètes, la production de cultures d'embryons, et la micro-injection rapide de zygotes de cette espèce.

Une méthode pour micro-injection de Patiria minata zygotes

Nous rapportons ici l'expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l'injection d'ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l'imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes.

L'expression de protéines fluorescentes en Branchiostoma lanceolatum Par injection dans l'ARNm non fécondés ovocytes

L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs un ensemble de méthodes pour la décapsulation à haut débit des embryons et des larves de Lymnaea stagnalis en préparation de l’hybridation in situ sur l’ensemble du mont, et pour les traitements ultérieurs de pré et post-hybridation.

A Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Ici, nous montrons comment induire et surveiller la régénération chez l’anémone de mer starlette Nematostella vectensis, un anthozoaire cnidaire modèle.  Nous montrons comment amputer et catégoriser la régénération à l’aide d’un système de stadification morphologique, et nous utilisons ce système pour révéler une nécessité d’autophagie dans la régénération des structures polypes.

Induire complète Polyp Régénération du aboral Physa de la mer Anémone Starlet Nematostella vectensis

L’objectif de ce protocole consiste à effectuer l’hybridation in situ sur des échantillons de corail adultes qui ont été incorporés à la paraffine et sectionnés sur lames de verre. Il s’agit d’une méthode qualitative permettant de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN anti-sens dans les tissus inclus en paraffine.

In Situ Techniques d’hybridation pour échantillons de corail adultes paraffine

Le but de ce protocole est de génotype de l'anémone de mer Nematostella vectensis pendant la gastrulation sans sacrifier l'embryon.

Génotypage de l'anémone de mer pendant le développement précoce

Les doliolides, y compris l'espèce Dolioletta gegenbauri, sont de petits zooplanctonmarins marins gélatineux d'importance écologique que l'on trouve sur les plateaux sous-continentaux productifs du monde entier. La difficulté de cultiver ces organismes délicats limite leur recherche. Dans cette étude, nous décrivons les approches de culture pour la collecte, l'élevage et l'entretien du doliolide Dolioletta gegenbauri.

Cultivation du Tunicate pélagique marin Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) pour les études expérimentales

L’article présente des méthodes de culture larvaire du gastéropode Crepidula fornicata dans un système à l’échelle du laboratoire de petit volume et dans un système de mésocosme d’eau de mer ambiante qui peut être déployé sur le terrain.

Culture en laboratoire et sur le terrain de larves de la patelle slipper, Crepidula fornicata

Cette étude décrit un cadre pour l’élaboration d’un modèle de biofilm polymicrobien agrégé et l’optimisation d’un protocole d’extraction d’ARN afin d’évaluer l’expression du gène Pseudomonas aeruginosa reflétant l’environnement pulmonaire de la fibrose kystique. Les applications comprennent l’évaluation des effets antimicrobiens et l’étude d’alternatives antibiotiques dans des conditions pertinentes pour la fibrose kystique.

Modèle de biofilm agrégé de fibrose kystique pour étudier l’expression génique liée à l’infection

Cette étude a développé un flux de travail pour la génération et le maintien de lignées mutantes stables pour l’escargot pommier d’eau douce, Pomacea canaliculata. Les protocoles incluent la collecte de zygotes, leur microinjection avec les composants du système CRISPR/Cas9 pour induire l’édition du génome, la culture ex ovo des embryons, et le génotypage après des croisements contrôlés.

L’escargot pommaque dorée Pomacea canaliculata : des zygotes aux lignées mutantes stables

Découvrez la culture de Balanus improvisus pour la biologie marine et l'étude de l'expression génique. Cette méthode permet de produire jusqu'à 50 000 nauplius par semaine avec un taux de développement élevé.

balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

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