Bioprintable Alginate/gélatine Hydrogel 3D In Vitro systèmes modèles induisent la Formation de sphéroïde de cellule

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, telles que la formation de tumeurs, le suivi de la migration cellulaire et la signalisation du cancer et des cellules saines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’étudier la tumorigenèse dans un environnement 3D avec des cellules stromales, telles que des fibroblastes, avec un faible coût et une reproductibilité élevée. Il est important de s’assurer que les matériaux sont à la fois bioimprimables et biofonctionnels, ce qui nécessite une étude quantitative de ses propriétés rhéologiques et de sa compatibilité cellulaire.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation de l’hydrogel et de mélange de l’hydrogel cellulaire sont difficiles à apprendre car la formation de bulles interfère avec la fidélité du modèle imprimé. Dans une enceinte de biosécurité, mélangez trois grammes d’alginate et sept grammes de poudre de gélatine dans un bécher de 250 millilitres. Ajoutez un agitateur magnétique et 100 millilitres de DPBS.

Scellez le bécher avec un film de paraffine stérile et du papier d’aluminium pour éviter toute contamination. Ensuite, montrez au participant les tracés polaires uniques et spécifiques qui correspondent à leurs modèles d’électromyographie, ou EMG. Après cela, continuez l’agitation à température ambiante pendant deux heures.

Chauffez la solution à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le gel subisse une transition de phase vers l’état liquide. Transférez ensuite la solution dans des tubes à centrifuger coniques stériles de 50 millilitres et fermez-les. Centrifugez les tubes à 834 fois g pendant cinq minutes pour éliminer toute bulle de gaz.

Ensuite, aspirez le précurseur de l’hydrogel dans des seringues de 10 millilitres. Fermez les seringues avec des capuchons et un film de paraffine. Conserver à quatre degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser.

Lorsque vous êtes prêt à commencer les tests, placez une seringue de précurseur d’hydrogel préparé dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant que la seringue chauffe, allumez et initialisez le rhéomètre. Au bout d’une heure, retirez la seringue du bain-marie.

Extrudez environ 0,5 millilitre du précurseur sur la plate-forme du rhéomètre. Sur le panneau de configuration, cliquez sur le bouton du triangle vers le bas. Attendez que l’outil de mesure descende en position de coupe.

À l’aide d’une spatule, coupez tout précurseur en excès qui s’est échappé du bord de l’outil de mesure et jetez le matériau superflu. Ensuite, pipetez l’huile minérale sur le bord de l’outil de mesure. Attendez que l’huile scelle complètement la limite.

Dans le panneau de configuration, cliquez sur Continuer. Cliquez ensuite sur le bouton Démarrer. Une fois le test terminé, relâchez l’outil de mesure et cliquez sur le bouton du triangle vers le haut.

Retirez l’outil de mesure. Nettoyez à la fois l’outil de mesure et la plate-forme avec de l’éthanol à 70 %. Tout d’abord, effectuez des balayages d’amplitude et de température comme indiqué dans le protocole de texte.

Pour commencer un balayage temporel isotherme, cliquez sur Mes applications, puis sur le modèle de test isothermique temps-température. Cliquez sur l’étape Mesure dans le flux de travail. Cliquez ensuite sur la déformation d’oscillation variable et ouvrez la fenêtre de configuration.

Réglez la contrainte d’oscillation sur 0,1 % et réglez la fréquence d’oscillation sur un hertz. Dans la fenêtre déroulante, définissez le nombre de points de données sur 120. Définissez la fréquence de collecte des données sur un point par minute.

Cliquez sur le bouton Ajouter pour ajouter la variable de température. Cliquez sur la température variable et réglez-la sur 25 degrés Celsius. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étape Appareil, Se déplacer vers le point de mesure dans le flux de travail.

Cliquez sur Supprimer. Cliquez ensuite sur l’étape Appareil, Définir la valeur. Décochez la case Attendre que la valeur soit atteinte et réglez la valeur sur 25 degrés Celsius.

Cliquez sur Image, Titre, Boutons en bas de l’écran. Décochez la case Continuer. Cliquez ensuite sur l’étape Démarrer, nommez le projet et enregistrez-le.

Chargez maintenant l’échantillon sur la plate-forme du rhéomètre et commencez le test en suivant le protocole général de test décrit précédemment. Après cela, observez le G premier et G double prime en fonction du temps. Trouvez le point de croisement de G prime et G double prime, et déterminez le temps au point de croisement.

Cliquez ensuite sur Table, copiez toutes les données et collez-les dans un fichier texte. Pour mesurer la limite d’élasticité à différents moments de gélification, cliquez sur Mes applications. Cliquez sur le modèle pour Limite d’élasticité et contrainte d’écoulement, semblable à celle d’un gel.

Nommez ce projet. Ensuite, cliquez sur l’étape Démarrer dans le flux de travail. Dans le menu supérieur, cliquez sur Insérer.

Ensuite, dans le menu déroulant, sélectionnez Attendre. Ouvrez la fenêtre de configuration et réglez le temps d’attente sur 50 minutes. Cliquez sur Démarrer, puis sur Insérer à nouveau.

Sélectionnez Appareil dans le menu déroulant. Ouvrez la fenêtre de configuration, sélectionnez Température et réglez-la sur 25 degrés Celsius. Décochez la case Attendre que la valeur soit atteinte.

Dans le workflow, sélectionnez l’étape Mesure. Sélectionnez la variable Contrainte de cisaillement et ouvrez la fenêtre de configuration. Réglez la contrainte de cisaillement initiale et finale sur zéro et 10 000 pascals, respectivement.

Cliquez ensuite sur Calculatrice, réglez la densité de points sur 0,2 point par pascal. Dans l’onglet Points de données sur la gauche, définissez un point par seconde. En bas de la fenêtre déroulante, sélectionnez l’onglet Contrôle d’événement, définissez le critère Arrêter la mesure si le taux de cisaillement est supérieur à 100 par seconde.

Chargez l’échantillon sur la plate-forme du rhéomètre et commencez le test en suivant le protocole général de test décrit précédemment. Une fois l’essai terminé, cliquez sur Diagramme pour observer la courbe déformation-contrainte. Répétez ce test pour des temps d’attente de 30, 40 et 50 minutes.

Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles. Pour commencer, stérilisez la bio-imprimante en la vaporisant soigneusement avec de l’éthanol à 70 %, puis en l’exposant à la lumière UV pendant la nuit. Retirez une seringue de précurseur d’hydrogel de l’entrepôt et réchauffez-la dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Transférez une fiole en T de cellules préalablement cultivées d’un incubateur de CO2 vers l’enceinte de biosécurité. Jetez le milieu de culture, puis rincez les cellules deux fois avec du DPBS. Ajoutez une solution chaude de trypsine-EDTA aux cellules.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant six minutes. Après cela, inactivez la trypsine en ajoutant le même volume de FBS. Retirez la seringue de précurseur d’hydrogel du bain-marie et nettoyez-la.

Stérilisez la seringue avec de l’éthanol à 70 % avant de la transférer dans l’enceinte de biosécurité. Extrudez environ trois millilitres de précurseur d’hydrogel dans une cartouche d’impression de 10 millilitres. Mélangez le précurseur avec des cellules MDA-MB-231-GFP à une concentration d’un million de cellules par millilitre en le pipetant lentement pour éviter de produire des bulles.

Couvrez la cartouche avec l’extrémité et les capuchons supérieurs, et scellez-la avec un film de paraffine. Ensuite, centrifugez-le à 834 fois g pendant une minute pour éliminer toute bulle de gaz. Répétez tout ce processus pour les autres précurseurs.

Après cela, stérilisez les trois cartouches avec de l’éthanol à 70 %. Chargez les cartouches stérilisées dans les chambres de la bio-imprimante. Dans le logiciel de contrôle de l’imprimante, cliquez sur manuel.

Développez ensuite l’onglet Tête d’outil dans le logiciel de contrôle de l’imprimante. Cliquez sur une cartouche sur l’interface graphique sur le côté gauche, réglez la température de la cartouche sur 25 degrés Celsius et attendez 35 minutes pour permettre au précurseur d’atteindre les conditions d’impression. Répétez cette opération pour les deux autres cartouches.

Dans le logiciel de contrôle de l’imprimante, développez l’onglet Tête d’outil. Cliquez sur une cartouche dans l’interface graphique, puis cliquez sur le bouton de mesure courte pour mesurer la position de la pointe de la buse. Répétez cette opération pour les deux autres cartouches.

Ensuite, placez une microplaque en polystyrène transparent sur la platine de l’imprimante. Ouvrez le fichier G-code et modifiez la pression à 200 kilopascals pour toutes les cartouches. Revenez au logiciel de contrôle et cliquez sur l’onglet Générateur d’échafaudage.

Sélectionnez un point pour lancer l’impression, puis cliquez sur le bouton Exécuter. Répétez cette opération pour obtenir trois répétitions. Après cela, ajoutez une solution de chlorure de calcium de 100 millimolaires pendant une minute pour réticuler les modèles.

Rincez deux fois avec DPBS. Ensuite, à l’aide d’une spatule, transférez soigneusement les modèles sur une plaque à six puits recouverte d’agarose. Ajoutez cinq millilitres de DMEM dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en remplaçant le milieu de culture cellulaire tous les trois jours.

Dans cette étude, des systèmes d’hydrogel tridimensionnels sont fabriqués pour récapituler les microenvironnements tumoraux in vivo et faciliter la formation de sphéroïdes tumoraux multicellulaires. Un balayage de température du précurseur A3G7 montre que G double prime est supérieur à G prime à 37 degrés Celsius, ce qui valide les propriétés connues du précurseur. Lorsque la température diminue, le précurseur subit une gélification physique en raison de l’intrication physique spontanée des molécules de gélatine dans une formation en trois hélices.

Les deux augmentations G prime et G double prime font baisser la température et convergent à 30,6 degrés Celsius, indiquant une transition sol-gel. La microscopie confocale du modèle d’hélice imprimé montre que les cellules MDA-MB-231-GFP commencent à développer des sphéroïdes 15 jours après le début de la période de culture, et que les sphéroïdes continuent d’augmenter en taille et en nombre jusqu’au 30e jour. Certaines des cellules IMR-90-mCherry forment également des agglomérations.

Après 30 jours de culture, des cellules IMR-90-mCherry ont pu être observées dans la région initialement occupée par les cellules MDA-MB-231-GFP, tandis que les cellules MDA-MB-231-GFP ont pu être observées dans la région dominée par IMR-90-mCherry. Cela implique des événements de migration possibles dans le modèle. La microscopie confocale du modèle à disque révèle que les cellules MDA-MB-231-GFP se comportent de la même manière que dans le modèle à hélice, ce qui donne un hydrogel chargé de sphéroïdes après 21 jours de culture.

Une fois maîtrisée, cette technique d’impression de maquettes peut se faire en deux heures, si elle est bien exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder l’hydrogel et les cellules aussi frais que possible, de ne pas mélanger d’anciens lots d’hydrogel avec de nouveaux et de travailler dans des conditions stériles pour éviter des résultats trompeurs. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie électronique à balayage et la microscopie time-lapse peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la porosité du matériau, le taux de migration cellulaire et le remodelage matriciel.

L’implication de cette technique s’étend à la thérapie du cancer car ce modèle in vitro permet des études systématiquement contrôlées de la formation et du comportement des tumeurs dans des systèmes de co-culture. Outre les cellules cancéreuses du sein, le modèle peut également être facilement appliqué à des systèmes utilisant d’autres types de cellules à divers emplacements initiaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer des modèles de maladies hétérogènes en 3D en préparant correctement les hydrogels, en intégrant des cellules et en imprimant le matériau dans la fenêtre d’impression optimale.

N’oubliez pas que travailler avec des échantillons biologiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’équipements de protection individuelle, tels que des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité lors de cette procédure.