Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre
25 octobre 2018
En vrac gene expression mesures nuage cellule individuelle différences dans les populations de cellules hétérogènes. Nous décrivons ici un protocole pour analyse de l’expression génique et l’index Comment unicellulaires Tri par Florescence activé cellule Tri (FACS) peut être combiné pour délimiter l’hétérogénéité et immunophenotypically caractériser les populations cellulaires moléculairement distinctes.
Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines des cellules souches et du cancer, comme l’hétérogénéité des cellules souches et la façon dont la thérapie dans les cellules cancéreuses sensibles peut être isolée. Le principal avantage de cette étude est qu’elle combine l’analyse techniquement robuste de l’expression des gènes unicell cellules avec la vaccinose pour une caractérisation plus poussée en aval des sous-populations cibles. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier le cancer et l’hétérogénéité des cellules souches, elle peut également donner un aperçu de l’amorçage génétique et du potentiel de lignée.
Pour commencer le protocole, sur un banc exempt d’ARN/ADN, préparer suffisamment de tampon de lyse pour 96 puits avec 10% de plus en mélangeant 390 microlitres d’eau sans nucléase, 17 microlitres de 10%NP-40, 2,8 microlitres 10 milli molaires dNTP, 10 microlitres 0,1 molaire DTT, et 5,3 microlitres inhibiteur RNAse. Vortex et tourner dans le tube. Ensuite, distribuez quatre microlitres de tampon de lyse à chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits et scellez les plaques avec du film adhésif.
Faites tourner les plaques pour recueillir le liquide au fond. Garder les plaques sur la glace jusqu’à ce que les cellules soient triées pendant un maximum de 24 heures. Une fois que la machine FACS a été correctement configurée, effectuez une réanalyse de la population cible en triant au moins 100 cellules cibles dans un nouveau tube de microcentrifugeuse avec 100 microlitres de tampon de tache.
Facs analyser les cellules triées en enregistrant l’échantillon trié et assurez-vous qu’ils se retrouvent dans la porte de tri. Ensuite, installez le tri des plaques unicell cellules en centralant la chute du puits A1 dans la plaque de 96 puits. Lorsqu’il est centré, trier 50 à 106 particules de micromètres dans tous les puits autour du bord d’une plaque vide de 96 puits pour s’assurer que tous les puits auront une cellule au centre de chaque puits.
Retirer le film adhésif des plaques. Trier une seule cellule de Lin-CD34 plus CD38 moins les cellules dans 92 des 96 puits. Activez le tri d’index dans le logiciel de tri FACS pour enregistrer le profil immunophéotypique pour CD45RA, CD49F et CD90 pour chaque cellule.
Trier deux puits avec respectivement 10 et 20 cellules pour les contrôles de linéarité dans l’amplification PCR. Les puits H1 et H2 sont généralement utilisés. Gardez deux puits sans cellules car aucun modèle ne contrôle, puits généralement H3 et H4. Sceller les plaques avec un film adhésif clair et faire tourner les plaques à 300 fois la gravité pendant une minute.
Casser le gel des plaques sur la glace sèche. Rangez-les ensuite à moins 80 degrés Celsius. Faites la transcription inverse et le mélange spécifique d’amplification cible en ajoutant 632,5 microlitres de mélange d’amorce de deux fois, 101,2 microlitres Taq/SuperscriptIII, 151,8 microlitres mélange d’amorce, et 0,7 microlitres piqués dans l’ARN de contrôle.
Vortex la solution et tournez-la vers le bas pour recueillir le liquide au fond du tube. Garder le mélange sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être ajouté à l’échantillon. Ensuite, décongelez les plaques de lysate sur la glace.
Ajoutez 8,75 microlitres de la transcription inversée précédemment préparée et du mélange d’amplification cible spécifique à 92 puits, y compris la linéarité et aucun contrôle de modèle. Ajouter 8,75 microlitres sans mélange de commande de transcription inversée aux quatre puits restants. Ensuite, sceller les plaques avec un film adhésif clair et faire tourner les plaques pour recueillir le liquide au fond.
Effectuez la transcription inverse et l’amplification cible spécifique en exécutant la plaque dans une machine PCR selon le programme préampli. Préparer la plaque de chargement d’essai en pipetant trois microlitres de réachemit de chargement d’essai à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter trois microlitres de chaque amorce aux puits individuels dans la plaque de chargement d’essai.
Sceller la plaque avec un film adhésif et la faire tourner vers le bas. Après avoir fait tourner la plaque, préparer la plaque de dilution en pipetant huit microlitres d’eau sans nucléase dans tous les puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter deux microlitres d’échantillon amplifié à la plaque de dilution.
Sceller la plaque avec un film adhésif. Mélanger en tourbillonnant la plaque pendant 10 secondes. Ensuite, tournez vers le bas de la plaque.
Ensuite, préparez le mélange de chargement de l’échantillon en mélangeant soigneusement 352 microlitres de mélange principal avec 35,2 microlitres de réaccent de chargement par échantillon. Préparer la plaque de chargement de l’échantillon en incitant 3,3 microlitres de mélange de chargement à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 2,7 microlitres de l’échantillon dilué dans chaque puits de la plaque de chargement de l’échantillon.
Sceller la plaque avec un film adhésif et la faire tourner vers le bas. Sortez une nouvelle puce microfluidique 96 by 96. Préparez les entrées en les piquer avec une seringue avec un bouchon pour s’assurer qu’elles peuvent être déplacées.
Ajouter le volume total des seringues à chaque valve tout en inclinant la puce à 45 degrés et en appuyant sur la valve. Primez la puce avec le contrôleur IFC. Chargez chaque entrée d’analyse avec 4,25 microlitres de chacun des puits dans la plaque de chargement d’essai et évitez les bulles.
Si des bulles apparaissent dans le puits, retirez-les à l’aide d’une pointe de pipette. Continuez à charger chaque entrée d’échantillon avec 4,25 microlitres de chacun des puits de la plaque de chargement de l’échantillon, en évitant les bulles, et si des bulles semblent les enlever avec une pointe de pipette. Chargez la puce avec le contrôleur de circuit Fluidics intégré ou le contrôleur IFC.
Vérifiez que la puce semble même et que toutes les chambres ont été chargées. Retirez la poussière de la surface de la puce en la touchant avec du ruban adhésif. Enfin, exécutez la puce dans la plate-forme d’expression génétique microfluidique multiplexe.
Une carte thermique d’une course réussie affiche l’expression uniformément répartie à travers les échantillons avec un signal fort d’environ sept à 25 CTs. Cette courbe d’amplification de spiked dans l’ARN de commande vérifie que tous les puits ont l’expression claire d’environ 10 CT avec peu ou pas de variation, validant que la pré-amplification et les réactions de qPCR avaient été réussies pour toutes les cellules. L’analyse des composants principaux ou PCA qui visualise les similitudes entre les groupes cellulaires en utilisant la réduction des dimensions peut être utile pour distinguer les grappes de cellules moléculairement distinctes les unes des autres en identifiant ici quatre sous-groupes.
Pour identifier l’immunophénotype des cellules de différents groupes moléculaires, chargez le fichier FCS index dans FlowJo. Ouvrez l’éditeur de script et coller le script de l’index, appuyez sur Exécuter. Chaque cellule sera maintenant dans une porte séparée.
Ajoutez chaque cellule dans l’éditeur de mise en page et colorez-les en fonction du regroupement moléculairement défini de SCXV disponible dans le fichier sample_complete_data.xls. Les parcelles FACS montrent l’expression du marqueur de surface cellulaire pour les marqueurs hématopoïétiques de cellules souches CD90 et CD45RA qui peuvent être utilisés pour discriminer entre les grappes et les isoler pour une analyse fonctionnelle. À la suite de cette procédure, d’autres techniques comme le séquençage par ARN de sous-populations nouvellement découvertes ou d’expériences in vitro et in vivo peuvent être réalisées pour répondre à d’autres questions comme le mécanisme moléculaire qui cause cette hétérogénéité et comment la sous-population diffère-t-elle fonctionnellement.
Cette stratégie a ouvert la voie aux chercheurs non seulement pour étudier l’hétérogénéité dans l’hématopoïèse normale et maligne, mais peut également être utilisée pour isoler prospectivement les sous-populations découvertes pour les étudier davantage.
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Aperçu
Cet article présente un protocole qui combine l'analyse de l'expression génique au niveau monocellulaire avec le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) afin d'explorer l'hétérogénéité des populations cellulaires. Il vise à caractériser des types cellulaires moléculairement distincts, particulièrement dans le contexte des cellules souches et du cancer.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
- Recherche sur le cancer
Contexte
- Les mesures d'expression génique globales peuvent masquer les différences entre cellules individuelles.
- Comprendre l'hétérogénéité des cellules souches est essentiel pour les progrès thérapeutiques.
- La cytométrie en flux permet l'isolement de populations cellulaires spécifiques en vue d'une analyse détaillée.
- Cette méthode fournit des informations sur la préparation génique et le potentiel d'engagement lignagé.
Objectif de l'étude
- Pour délimiter l'hétérogénéité des populations cellulaires.
- Pour caractériser immunophénotypiquement des types cellulaires distincts.
- Pour étudier les effets des thérapies sur les cellules cancéreuses sensibles.
Méthodes utilisées
- Préparation du tampon de lyse pour l'analyse de cellules uniques.
- Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
- Analyse de l'expression génique à l'échelle de la cellule unique.
- Caractérisation en aval des sous-populations cibles.
Résultats principaux
- La méthode révèle efficacement l'hétérogénéité des cellules souches.
- Elle permet l'isolement de populations spécifiques de cellules cancéreuses.
- Des informations sur l'amorçage génique et le potentiel d'engagement lignagé ont été obtenues.
- Le protocole est techniquement robuste et reproductible.
Conclusions
- Cette approche améliore la compréhension de la diversité cellulaire.
- Elle présente des applications potentielles dans la recherche sur les cellules souches et sur le cancer.
- La combinaison de techniques permet une analyse complète des populations cellulaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette approche combinatoire à l’échelle de la cellule unique permet de surmonter un goulot d’étranglement critique dans la recherche sur les cellules souches et le cancer en préservant la résolution à l’échelle de la cellule unique lors du profilage moléculaire, permettant ainsi une identification précise de sous-populations rares responsables de la résistance thérapeutique ou de la différenciation des lignées cellulaires. En associant les marqueurs immunophénotypiques aux profils d’expression génique à l’échelle de la cellule unique, cette méthode renforce la fiabilité de la validation des cibles et soutient la réduction des risques mécanistiques dans les phases précoces des parcours de découverte. L’approche offre un protocole évolutif et reproductible pour générer des données quantitatives et multimodales qui éclairent les décisions d’avancement ou d’abandon dans les efforts de priorisation des cibles et d’identification des candidats prometteurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en résolvant l'hétérogénéité moléculaire et immunophénotypique au sein des populations de cellules souches et progénitrices.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à la corrélation entre l'expression des marqueurs de surface et des panels de gènes pré-sélectionnés, réduisant ainsi les faux positifs lors du choix des cibles.
- Valeur prédictive : Facilite l'identification de sous-populations moléculairement distinctes pour une isolation ultérieure, améliorant la fiabilité des évaluations du potentiel d'engagement lignéaire et de l'amorçage génique.
Élaboration de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des données quantitatives normalisées d'expression génique associées au tri FACS selon l'index, permettant un criblage reproductible des états moléculaires au sein des populations cellulaires.
- Extensibilité : Compatible avec les formats 96-puits et les plateformes microfluidiques, prenant en charge le criblage à débit moyen de panels génétiques prédéfinis dans des échantillons humains primaires.
- Reproductibilité : Réduit la variabilité technique grâce à la lyse cellulaire unique dans un tampon et aux étapes de pré-amplification, assurant une détection cohérente des transcrits peu abondants.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet l'isolement prospectif de sous-populations définies sur le plan moléculaire pour une validation fonctionnelle in vitro et in vivo, reliant ainsi la découverte au développement préclinique.
- Alignement sur les biomarqueurs : Facilite l'identification de signatures de marqueurs d'expression membranaires corrélées aux groupes moléculaires, contribuant au développement de biomarqueurs translationnels pour la stratification des patients.
- Progression ajustée au risque : Fournit des connaissances mécanistiques sur l'hétérogénéité permettant d'orienter le choix des modèles précliniques et de réduire les risques biologiques en phase avancée du développement thérapeutique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase initiale de découverte en permettant un profilage haute résolution de populations hétérogènes avant l'identification du composé candidat, notamment dans les cancers d'origine cellulaire souches et les programmes de médecine régénérative. Elle établit la caractérisation moléculaire et phénotypique comme une capacité continue et réutilisable, plutôt que comme un test ponctuel, soutenant ainsi un affinement itératif de la cible.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en associant l'expression génique unicellulaire à des profils immunophénotypiques, permettant ainsi une détection biologique des cibles dans des contextes hématopoïétiques et oncogéniques.
- Criblage : Fournit des résultats quantitatifs prêts à l'analyse à partir d'ADN complémentaire préamplifié, facilitant la comparaison fiable des états moléculaires entre cellules uniques triées.
- Analyse : Permet l'analyse en composantes principales (ACP) et la visualisation sous forme de cartes thermiques afin d'identifier des groupes moléculaires et de les corréler à l'expression de marqueurs de surface pour distinguer les sous-populations.
- Recherche translationnelle : Associe le regroupement moléculaire à la validation fonctionnelle par l'isolement prospectif de sous-populations destinées à un séquençage ARN en aval ou à des tests in vivo.
- Réutilisation institutionnelle : Établit un protocole standardisé pour l'analyse multiplexée de cellules uniques, adaptable à divers systèmes modèles et domaines thérapeutiques, réduisant ainsi les développements méthodologiques redondants.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en résolvant l'hétérogénéité moléculaire masquée par les analyses en masse.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés de lyse, de pré-amplification et de PCR quantitative, compatibles avec les infrastructures existantes de tri cellulaire (FACS) et de microfluidique.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant l'identification précoce de sous-populations fonctionnellement pertinentes, réduisant ainsi les investissements dans des cibles non viables.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en fournissant un fondement mécanistique pour faire progresser les populations définies sur le plan moléculaire vers la validation préclinique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en tri FACS avec indexation, en manipulation de cellules uniques et en plateformes de qPCR microfluidiques.
- Suppose l'accès à des cytomètres en flux activateurs de fluorescence dotés de la fonction de tri avec indexation et à des systèmes d'expression génique microfluidiques.
- Exige une standardisation entre les équipes pour la préparation des tampons de lyse, les stratégies de tri par fenêtrage et les pipelines d'analyse des données.
- L'adaptation à des systèmes non hématopoïétiques peut nécessiter une optimisation des panels de marqueurs d'interface et des conditions de lyse.
- Les limites pratiques incluent des contraintes de débit liées à la vitesse de tri et au chargement des puces microfluidiques, ce qui rend la méthode plus adaptée à des panels ciblés qu'au criblage du transcriptome complet.
