Name: Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Découvrez une approche combinant l'analyse d'expression génique en cellule unique et le tri cellulaire FACS pour caractériser l'hétérogénéité des populations cellulaires souches et cancéreuses. Cette méthode permet d'isoler des sous-populations cibles pour une étude approfondie.

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Ce travail est soutenu par des subventions du suédois Cancer Society, The Swedish Research Council, The Swedish Society for Medical Research, The Swedish Childhood Cancer Foundation, la Fondation de Söderberg de Ragnar et The Knut et Alice Wallenberg Foundation

1. préparation des plaques de lyse
<ol><li>À l’aide d’un banc libre ARN/ADN, préparer suffisamment tampon de lyse à 96 puits, avec 10 % de bonus, en mélangeant l’eau libre nucléase µL 390, 17 µL de 10 % NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0,1 M DTT et inhibiteur de RNAse 5,3 µL (voir Table des matières). Vortex et la centrifuger.</li>
	<li>Distribuer 4 µL de tampon de lyse dans chaque puits d’une plaque de PCR 96 puits et les plaques avec du film adhésif d’étanchéité. Tournez en bas tubes pour recueillir le liquide au fond des assiettes. Conservez les plaques sur la glace jusqu'à cellule Tri (maximum 24h).</li>
</ol>2. préparation des cellules pour le tri des cellules
<ol><li>Décongeler le nombre approprié de cellules (ici, CD34 enrichi souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices) pour l’expérience. 1 x 106 cellules ne conviennent pas pour le tri environ trois plaques à 96 puits de single-cellules avec des contrôles.</li>
	<li>Transfert de cellules décongelées dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1 mL FBS toutes les 30 s jusqu'à ce que soit atteint un volume total de 8 mL. Tourner les cellules dans une centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules en 8 mL tampon de coloration (PBS contenant 2 % FBS) et centrifuger à 350 g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre les cellules en coloration de 200 µL tampon et éliminer les cellules pour les taches de contrôle.</li>
	<li>Faire de Fluorescence moins une commande (OGP) à chaque fluorophore, par coloration une fraction des cellules dans 50 µL de tampon de coloration. Dans cet exemple, 6 tubes de microcentrifuge avec 20 000 cellules sont utilisées comme FMOSs. Notez que le nombre de cellules doit être ajusté selon les populations étudiées. Ajouter tous les anticorps à la même concentration que dans la coloration de l’échantillon sauf un dans chaque tube.</li>
	<li>Faire des taches unique pour chaque fluorophore par coloration une fraction des cellules dans 50 µL de tampon pour chaque fluorophore utilisé. Dans cet exemple, 6 tubes de microcentrifuge avec 20 000 cellules sont utilisés. Notez que l’objectif pour chacun des anticorps doit être exprimé par les cellules utilisées pour les contrôles. Ajouter chaque anticorps à la même concentration que dans la coloration de l’échantillon dans des tubes individuels. En outre garder 20 000 cellules incolores dans 50 µL comme un contrôle non coloré.</li>
	<li>Ajouter à l’échantillon cellulaire, anticorps à leur concentration appropriée. Utilisés ici sont CD34-FITC à une concentration de 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 et lignée Mix : CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, 1/50, CD16-PECy5 et CD235a-PECy5 1/1000.</li>
	<li>Incuber les cellules avec des anticorps pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver les cellules avec 3 mL de tampon de coloration. Centrifuger à 350 x g pendant 10 min à 4 ° C, les cellules et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules et répétez l’étape 2,9.</li>
	<li>Resuspendre échantillon dans 500 µL et OGP dans 100 µL de tampon avec des cellules 7AAD et filtre de 1/100 de coloration à travers un filtre de 50 µm pour obtenir une suspension de cellules individuelles.</li>
</ol>3. cellule Tri
<ol><li>Assurez-vous que la machine de FACS est réglée correctement avec retard de goutte et cytomètre installation et suivi (CST) qui ont récemment été exécutés conformément aux instructions du fabricant, pour s’assurer que les cellules appropriées sont triés. Pour les cellules hématopoïétiques, l’utilisation de la vitesse de 85 microns buse et maximum de 4 est recommandée, tandis que le taux d’événements optimale est entre 800 et 2000 événements/s.</li>
	<li>Corriger de chevauchement spectrale par exécuter la compensation de fluorescence et définissez gates selon FMO contrôles ou contrôles négatifs internes.</li>
	<li>Effectuer une nouvelle analyse de la population cible en triant au moins 100 cellules cibles dans un nouveau tube de microcentrifuge avec 100 µL de tampon de la tache. FACS analyser les cellules triées en enregistrant l’échantillon trié et s’assurer qu’ils se retrouvent dans la porte de la sorte.</li>
	<li>Mise en place simple plaque cellulaire tri en centrant la chute dans le puits A1 dans une plaque 96 puits. Quand elle est centrée, trier les particules de 50 – 100 6 µm dans tous les puits sur le pourtour d’une assiette bien 96 vide pour s’assurer que tous les puits aura une cellule au centre de chaque puits.</li>
	<li>Si possible, un contrôle supplémentaire pour s’assurer que les cellules viables sont triés peut être ajouté en triant les single-cellules in vitro la croissance. Cellules hématopoïétiques peuvent être cultivés en fond U 96 plaques puits dans 100 µl SFEM avec 1 % streptomycine de pénicilline, 100 ng/mL FLT3L, TPO et SCF. Analyser chaque puits après 3 jours de culture pour les colonies de cellules à l’aide d’un microscope.</li>
	<li>Retirer pellicule adhésive de plaques. Trier une seule cellule d’intérêt (ICIS Lin-CD34 + CD38-cellules) en 92 sur les 96 puits, activer INDEX-tri dans les FACS tri logiciel pour sauvegarder le profil immunophénotypiques des autres marqueurs d’intérêt (ici CD45RA, CD49f et CD90) pour chaque cellule.</li>
	<li>Trier les deux puits avec des cellules de 10 et 20 respectivement pour les contrôles de linéarité dans l’amplification par PCR. Puits H1 et H2 sont habituellement utilisés.</li>
	<li>Garder deux puits sans n’importe quelle cellule comme modèle de non contrôle, généralement puits H3 et H4.</li>
	<li>Sceller les plaques avec du film transparent adhésif et tourner les plaques à 300 x g pendant 1 min avant snap gel sur la glace sèche.</li>
	<li>Stocker des plats congelés à-80 ° C. NOTE : Point d’arrêt sécurisé. Cellules triées et lysés peuvent être conservés à-80 ° C pour le stockage à long terme.</li>
</ol>4. inverser la Transcription et l’Amplification de la cible spécifique
<ol><li>Préparer le mélange de l’apprêt pour toutes les cibles de gène 96 en ajoutant 2 µL de chaque paire d’amorces, y compris amorces pour contrôle dopés à ARN et amorces de gène de ménage dans un tube gratuit de RNAse sur un banc libre ARN/ADN de 1,5 mL. Si vous utilisez moins de 96 amorces, ajouter un volume équivalent d’eau libre nucléase pour les amorces manquants. Amorces sont classés séparément pour faire correspondre le panneau du gène désiré.</li>
	<li>Faire la transcription inverse et amplification de cible spécifique mélanger en ajoutant 632,5 µL 2 x mélange réactionnel, 101,2 µL Taq/SuperscriptIII, 151,8 µL Amorce mix et 0.7 µL dopés dans control RNA. Préforme cette étape sur un banc libre de l’ADN. Mix de vortex et rotation vers le bas pour recueillir le liquide dans le fond du tube. Rester sur la glace jusqu'à addition à l’échantillon.</li>
	<li>Marque non-reverse transcription contrôle mix pour quatre puits en mélangeant 27,5 µL de 2 x mélange réactionnel, 1,76 µL d’enzyme Taq, 6,6 µL du mélange de l’apprêt et 2,64 µL d’eau libre nucléase. Spike dans control RNA. Effectuez cette étape sur un banc libre de l’ADN. Vortex et rotation vers le bas pour recueillir le liquide dans le fond du tube et les garder sur la glace jusqu'à l’ajout d’échantillon.</li>
	<li>Décongeler le lysats plaques sur la glace. Ajouter 8,75 µL de la transcriptase inverse préalablement préparée et cible spécifique amplification mix à 92 Herbert George wells, y compris les contrôles de linéarité et de non-modèle. Ajouter 8,75 µL du mélange de contrôle de non-reverse transcription dans les quatre puits restants. Joint de plaques avec film transparent adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.</li>
	<li>Préforme de la transcriptase inverse et l’amplification de la cible spécifique en exécutant la plaque dans une machine PCR selon le programme de préampli ; étape 01:50 ° C pendant 60 min, étape 2 : 95 ° C pendant 2 min, étape 3 : 95 ° C pendant 15 s, étape 4 : 60 ° C pendant 4 min, répéter les étapes 3 et 4 24 fois et enfin l’étape 5 : 8 ° C pour toujours.</li>
	<li>Après que PCR est terminée, garder la plaque à 8 ° C pour le stockage à court terme et -20 ° C pour le stockage à long terme. NOTE : Point d’arrêt sécurisé. Matériel amplifié peut être conservé à 8 ° C pour le stockage à court terme et à-20 ° C pour le stockage à long terme.</li>
</ol>5. préparation de l’échantillon et de plaques d’essai pour Multiplex Microfluidic Gene Expression Analysis
<ol><li>Préparer l’essai de plaque de chargement de pipetage 3 µL de réactif de chargement test dans chaque puits d’une plaque 96 puits. Ajouter 3 µL de chaque amorce dans des puits individuels dans l’essai de plaque de chargement.</li>
	<li>Flasque avec film adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.</li>
	<li>Préparez plaque de dilution en pipettant : 8 l de nucléase eau gratuite dans tous les puits d’une plaque 96 puits. Ajouter 2 µL de l’échantillon amplifié à la plaque de la dilution, faire une dilution finale de 1 / 5.</li>
	<li>Flasque avec film adhésif, de la composition de la plaque de vortex pour 10 s et enfin tourner à frais viré liquide au fond des assiettes.</li>
	<li>Préparer les mix de chargement d’échantillon en mélangeant soigneusement 352 µL du mélange maître avec 35,2 µL de réactif de chargement d’échantillon. Préparer la plaque de chargement d’échantillon en aliquotage 3.3 µL du mélange dans chaque puits d’une plaque 96 puits de chargement.</li>
	<li>Ajouter 2,7 µL de l’échantillon dilué dans chaque puits de l’échantillon plaque de chargement.</li>
	<li>Flasque avec film adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.</li>
</ol>6. chargement de la puce microfluidique
<ol><li>Souscrire à une nouvelle puce microfluidique de 96 x 96. Préparer les anses de piquer avec une seringue avec cap sur pour s’assurer qu’ils peuvent être déplacés.</li>
	<li>Retirer les bulles de seringues. Ajouter plein volume des seringues à chaque valve tout en inclinant la puce 45 degrés et en appuyant vers le bas de la soupape. Premier morceau avec le contrôleur de la SFI.</li>
	<li>Chargez chaque entrée de dosage avec 4,25 µL de chaque puits dans l’essai de plaque de chargement. Éviter les bulles. Si des bulles apparaissent dans le puits, enlevez-les avec un embout de la pipette.</li>
	<li>Continuer à charger la bouche de chaque échantillon avec un 4,25 µL de chaque puits dans l’échantillon de plaque de chargement, d’éviter les bulles et si des bulles apparaissent, enlevé à la pointe de pipette.</li>
	<li>Puce de charge avec le contrôleur de la SFI.</li>
	<li>Vérifiez que la puce semble encore et que toutes les chambres ont été chargés. Enlever la poussière de la surface de la puce par le toucher avec du ruban adhésif. Exécutez la puce dans la plate-forme d’expression de gène multiplex microfluidiques.</li>
</ol>7. exécution Chip sur Multiplex Microfluidic Gene Expression plate-forme
<ol><li>Après chargement de puce dans la plate-forme d’expression de gène multiplex microfluidique, nom de l’échantillon.</li>
	<li>La valeur de ROX comme colorant passive. Fluorescence de définir seule sonde et FAM-BTP. Utilisez 96 x 96 standard v2 comme protocole. Commencer l’exécution.</li>
	<li>Supprimer les puces lorsqu’il est exécuté sont terminée.</li>
</ol>8. preliminary Analysis of Chip Run
<ol><li>Charger des données dans le logiciel d’analyse de PCR en temps réel.</li>
	<li>Charger les noms de gènes et cellules en collant cellulaire et génique mises en page d’un fichier délimité par des tabulations.</li>
	<li>Ouvrez affichage de l’image et sélectionnez ROX comme colorant. Vérifiez si tous les puits ont colorant passive ROX.</li>
	<li>Vérifier si toutes les placettes d’amplification regarder OK, avec une courbe d’amplification lisse sans crampons (semblable à la Figure 3E).</li>
	<li>S’assurer que toutes les cellules de single-expression de contrôle fortifiés à ARN pour s’assurer que tous ont été chargés correctement.</li>
	<li>S’assurer que toutes les cellules sont l’expression de gène de ménage et donc ont été triées correctement.</li>
	<li>S’assurer que les contrôles de linéarité cellule 10 et 20 environ 1ct différence pour valider l’amplification linéaire.</li>
	<li>Vérifier si il y a expression dans les échantillons de contrôle noRT. Si expression est détectée dans noRT envisager de changer les sondes aux sondes qui ne détectent pas l’ADN génomique pour les exécutions suivantes.</li>
	<li>Exporter des données dans des fichiers csv pour une analyse ultérieure.</li>
</ol>9. unicellulaires analyse à l’aide de SCExV
Remarque : Un film d’introduction est présents20 d’introduire l’outil. Ici, une recommandation courte du comment faire l’analyse en utilisant les contrôles introduits dans le protocole est présentée.
<ol><li>Se connecter au site Web SCexV20.</li>
	<li>Télécharger des fichiers CSV exportés.</li>
	<li>A choisi le contrôle dopés à RNA comme contrôle positif. Supprimer n’importe quelle cellule qui possède un contrôle RNA CT supérieure à 25. Normaliser les données d’expression médiane du contrôle RNA.</li>
	<li>Cliquez sur « ici -> Analyze ». Enlever le noRT, notemplate, 10 et 20 contrôles de cellule dans l’option de cellule d’exclure.</li>
	<li>Grappe de cellules avec la démarche de clustering de choix avec le nombre attendu de grappes. Valeur des exportations a analysé.</li>
</ol>10. tri des Index analyse
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’analyse de FACS et charger les échantillons indexées.</li>
	<li>Ouvrez l’éditeur de script et exécutez le script disponible de Quinn J. et al. 21
</li>
	<li>Maintenant que le logiciel d’analyse de FACS aurait dû une porte pour chacune des cellules simples, ouvrez l’éditeur de mise en page et la couleur les cellules selon le groupement de SCexV (disponible dans le fichier nommé « Sample_complete_Data.xls »).</li>
</ol>

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<li>Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansion+and+interrelatedness+of+distinct+B-lineage+compartments+in+multiple+myeloma+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow.</a> Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ces dernières années, analyse de l’expression génique de la cellule unique est devenu un atout précieux pour définir l’hétérogénéité des différentes cellules populations23. L’avènement des technologies de séquençage de RNA offre théoriquement une possibilité permettant de mesurer le transcriptome entier d’une cellule, cependant ces méthodes sont compliquées par des variations de profondeurs de séquençage de cellule-cellule et abandons. Unicellulaire qPCR offre une analyse sensible et robuste de l’...

Chaque cellule individuelle de sang est censé résider dans une hiérarchie cellulaire, où les cellules souches forment l’apex au sommet d’une série de plus en plus engagés progéniteurs intermédiaires qui différencient finalement en phase terminale dans les cellules effectrices final porteurs spécifiques fonctions biologiques1. Une grande partie de la connaissance au sujet de comment sont organisés les systèmes de cellules souches a été générée dans le système hématopoïétique, principalement en raison de la capacité d’isoler prospectivement des populations distinctes de hématopoïétiques hautement enrichies pour les cellules souches ou cellules souches diverses2 par un tri de FACS. Cela a permis à bon nombre de ces populations à analyser sur le plan fonctionnel ou moléculairement, principalement à travers l’expression de gènes3,4. Toutefois lorsque analyser l’expression des gènes de la majeure partie des populations des différences individuelles entre les cellules sont en moyenne et perdu5. Ainsi, l’incapacité à détecter les variations de la cellule-cellule au sein des fractions cellulaires hétérogènes peut-être entraîner notre compréhension des processus biologiques critiques si petits sous-ensembles des cellules responsables de la fonction biologique inférée de cette population6, 7. À l’inverse, enquête des signatures d’expression génique à cellule unique résolution offrent une possibilité de délimiter l’hétérogénéité et contourner les influences éclipsa surreprésentés sous-ensembles de cellules8.
À ce jour de nombreux protocoles pour l’analyse de l’expression génique de la cellule unique ont été développées ; avec chaque approche ayant ses propres réserves. La première méthode était RNA Fluorescent in situ hybridation (RNA-poisson), qui mesure un nombre limité de relevés de notes à la fois, mais est unique parce qu’elle permet pour enquête de RNA localization9,11. Méthodes précoces à l’aide de la PCR et qPCR pour détecter qu'un seul ou quelques transcriptions ont été également mis au point12. Cependant, ils ont dernièrement été remplacés par des méthodes axées sur la microfluidique qui peuvent analyser simultanément l’expression de centaines de transcriptions par cellule chez des centaines de cellules par l’intermédiaire de qPCR et ainsi permettre d’hétérogénéité de grande dimension à l’aide de l’analyse prédéterminé gène panneaux10,13. Récemment technologies basées sur le séquençage de RNA ont devenu employé couramment pour analyse unicellulaires, puisque ceux-ci peuvent théoriquement mesurer le transcriptome entier d’une cellule et ainsi ajouter une dimension exploratoire à l’hétérogénéité analyse10, 14. multiplexé qPCR analyse et le séquençage de RNA unicellulaires ont des caractéristiques différentes, la justification de l’utilisation de méthodes dépend donc de la question posée ainsi que le nombre de cellules dans la population cible. Le haut débit et à faible coût par cellule ainsi que des caractéristiques non biaisées, exploratoires du séquençage de RNA unicellulaires sont souhaitables lorsque cellule inconnue ou grandes populations ont été étudiées. Cependant, séquençage RNA unicellulaire est également biaisé en faveur de séquençage hautes transcriptions abondantes plus fréquemment tandis que les relevés de notes peu abondantes sont sujettes aux décrocheurs. Cela peut conduire à des données beaucoup complexes qui met haute-exigences sur l’analyse bioinformatique pour révéler les signaux moléculaires importants qui sont souvent subtiles ou masqués en bruit technique15. Ainsi, pour tissus bien caractérisés, monocellulaires qPCR analyse utilisant prédéterminé panneaux amorces sélectionnées pour fonctionnellement importants gènes ou marqueurs moléculaires peut servir d’une approche sensible, simple pour déterminer l’hétérogénéité d’un population. Toutefois, il est à noter que par rapport à cellule unique RNA-seq, le coût par cellule est généralement plus élevé pour les méthodes qPCR unicellulaires. Nous décrivons ici une approche qui combine single-cell RT-qPCR (modifié d’après J. Teles et al. ( 16), à l’index de FACS tri simultanément les17 et bioinformatique analyse18 afin de caractériser l’hétérogénéité moléculaire et immunophénotypiques au sein des populations.
Dans cette approche, la population de cellules d’intérêt est tachée et single-cellules sont triés par FACS directement dans le tampon de lyse en plaques PCR 96 puits. Simultanément, les niveaux d’expression d’un ensemble de marqueurs de surface cellulaire supplémentaires sont comptabilisés pour chaque cellule unique pendant FACS-tri, une méthode qui est appelée indice de tri. Le matériau à cellules lysées est amplifié par la suite et l’expression de gène d’un ensemble sélectionné de gènes analysés avec la RT-qPCR, utilisant une plate-forme microfluidique. Cette stratégie permet une analyse moléculaire de la caractérisation de cellule unique mais aussi simultanée triée d’expression de marqueurs de surface cellulaire de chaque cellule individuelle. En mappant directement des sous-ensembles moléculairement distinctes des cellules à l’expression des marqueurs triés indexées, les sous-populations peuvent être liées à une immunophenotype spécifique qui peut être utilisé pour leur isolement éventuels. La méthode est décrite étape par étape dans la Figure 1. Outre une Comité pré-déterminé gène contribue à une résolution plus élevée de l’expression du gène ciblé, car il contourne la mesure de non pertinents gènes abondantes qui peuvent autrement occlure des signaux d’expression génique subtile. De plus, l’amplification de la cible spécifique, transcription inverse une étape et amplification permet de mesurer robuste de faibles transcriptions exprimées, comme des facteurs de transcription ou non-poly-adenylated ARN. Ce qui est important, les méthodes de qPCR permettent pour la mesure des ARNm des protéines de fusion, qui sont importants dans les enquêtes sur certaines maladies malignes19. Enfin, le nombre ciblé des gènes étudiés, faibles taux d’abandon, et limité les différences techniques entre les cellules font cette méthode facilement analysée par rapport aux méthodes dimensionnelles plus élevées, comme unicellulaires RNA-Seq. En suivant le protocole, une expérience entière peut être effectuée, du tri des cellules aux résultats analysés, dans les trois jours, ce qui en fait une méthode simple et rapide pour l’analyse d’expression génique de cellules individuelles sensibles et à haut débit.

<table><tbody><tr><td>CD14 PECY5</td><td>eBioscience</td><td>15-0149-42</td><td>Clone : 61D3</td></tr><tr><td>CD16 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302010</td><td>Clone : 3G8</td></tr><tr><td>CD56 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>304608</td><td>Clone : MEM-188</td></tr><tr><td>CD19 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302210</td><td>Clone : HIB19</td></tr><tr><td>CD2 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300210</td><td>Clone : RPA-2.10</td></tr><tr><td>CD3 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300310</td><td>Clone : HIT3a</td></tr><tr><td>CD123 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>306008</td><td>Clone : 6H6</td></tr><tr><td>CD235A PECY5</td><td>BD Pharma</td><td>559944</td><td>Clone GAR2</td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>Biolegend</td><td>343604</td><td>Clone : 561</td></tr><tr><td>CD38 APC</td><td>Biolegend</td><td>303510</td><td>Clone : Hit2</td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>Clone : 5E10</td></tr><tr><td>CD45RA BV421</td><td>BD bioscience</td><td>560362</td><td>Clone : HI100</td></tr><tr><td>CD49f Pecy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0495-82</td><td>Clone : eBioGOH3</td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond en U à 96 puits</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>SFEM</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline streptomycine</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorph tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Billes CST</td><td>BD</td><td></td><td></td>642412</tr><tr><td>Perles Accudrop</td><td>BD</td><td>345249</td><td>6 & micro ; particules M&nbsp ;</td></tr><tr><td>Film adhésif Clear</td><td>Thermo scientific&nbsp ;</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>Film adhésif Thermo</td><td>scientific&nbsp ;</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Plaque PCR 96 puits</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>T100 Cycleur PCR</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>10 % NP40</td><td>Thermo scientific&nbsp ;</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>RNAsout</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Inhibiteur de l’ARNase</td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans neucléase</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>de CellsDirect kit</td></tr><tr><td>2x Reaction Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>de CellsDirect kit</td></tr><tr><td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>de CellsDirect kit</td></tr><tr><td>Platinum&nbsp ; Taq&nbsp ; ADN polymérase</td><td>Invitrogen</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td></td></tr><tr><td>Xeno RNA Control</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td>From TaqMan Cells-to-CT Control</td></tr><tr><td>20x Xeno RNA RNA Taqman Gene Expression Assay</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td></tr><tr><td>96.96 Sample/Loading Kit&mdash ; 10 IFCs</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96</td><td></td></tr><tr><td>2x Réactif de Chargement</td> de <td>Dosage Fluidigm</td><td></td><td>À partir de 96.96 Kit de Chargement/Échantillon</td></tr><tr><td>20x GE Chargement de Réactif</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>À partir de 96.96 Kit d’échantillon/Chargement de</td></tr><tr><td>Ligne de contrôle Fluid&nbsp ;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>à partir de 96.96 Kit d’échantillonnage/chargement</td></tr><tr><td>TaqMan Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>BMKHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96GT</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>V10</td><td>TreeStar</td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Analyse PCR en temps réel Fluidigm</td><td></td><td>Fluidigm</td><td></td></tr><tr><td>CD179a.VPREB1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00356766_g1</td><td></td></tr><tr><td>ACE</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00174179_m1</td><td></td></tr><tr><td>AHR</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00169233_m1</td><td></td>scientifique</tr><tr><td>BCR_ABL.52</td><td>Thermofisher Hs03043652_ft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCR_ABL41</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs03024541_ft</td><td></td></tr><tr><td>BMI1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00995536_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNA2</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00996788_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01030099_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB2</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01084593_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNC</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01029304_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNE1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01026535_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNF</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00171049_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCR9</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01890924_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD10. MME</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00153510_m1</td><td></td>scientifique</tr><tr><td>CD11a</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00158218_m1</td><td></td>scientifique</tr><tr><td>CD11c.ITAX</td><td>Thermofisher Hs00174217_m1</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>CD123. IL3RA</td><td>Thermofisher Hs00608141_m1</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>CD133. PROM1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01009250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD151</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00911635_g1</td><td></td></tr><tr><td>CD220. INSR</td><td>Thermofisher Hs00961554_m1</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>CD24. HSA</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs03044178_g1</td><td></td></tr><tr><td>NCOR1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01094540_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD26. DPP4</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00175210_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD274</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01125301_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD276</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00987207_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD32. FCGR2B</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01634996_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD33</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01076281_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00990732_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD344. FZD4</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00201853_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD352. SLAMF6</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01559920_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD38</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01120071_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01058407_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD41. ITGA2B</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01116228_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD49f.ITGA6</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01041011_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD56. NCAM1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00941830_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00233521_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD97</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00173542_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00908458_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDK6</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01026371_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1A</td><td>Thermofisher Hs00355782_m1</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>CDKN1B</td><td>Thermofisher</td><td>scientifique Hs01597588_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1C</td><td>Thermofisher</td><td>scientifique Hs00175938_m1</td><td></td></tr><tr><td>CEBPa</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00269972_s1</td><td></td></tr><tr><td>CSF1r</td><td>Thermofisher</td><td>scientifique Hs00911250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CSF2RA</td><td>Thermofisher scientifique</td><td></td><td></td>Hs00531296_g1</tr><tr><td>CSF3RA</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01114427_m1</td><td></td></tr><tr><td>E2A. TCF3</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00413032_m1</td><td></td></tr><tr><td>EBF1</td><td>Thermofisher</td><td>scientifique Hs01092694_m1</td><td></td></tr><tr><td>ENG</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00923996_m1</td><td></td></tr><tr><td>EPOR</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00959427_m1</td><td></td></tr><tr><td>ERG</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01554629_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLI1</td><td>Thermofisher Hs00956711_m1</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>FLT3</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00174690_m1</td><td></td></tr><tr><td>FOXO1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01054576_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>GATA1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00231112_m1</td><td></td></tr><tr><td>GATA2</td><td>Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>Hs00231119_m1</tr><tr><td>GATA3</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00231122_m1</td><td></td></tr><tr><td>GFI1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00382207_m1</td><td></td></tr><tr><td>HES1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01118947_g1</td><td></td></tr><tr><td>HLF</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00171406_m1</td><td></td></tr><tr><td>HMGA2</td><td>Thermofisher Hs00171569_m1</td><td></td><td></td> scientifique</tr><tr><td>HOXA5</td><td>Thermofisher Hs00430330_m1</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>HOXB4</td><td>Thermofisher Hs00256884_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ID2</td><td>Thermofisher Hs04187239_m1 scientifique</td><td>IGF2BP1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher Hs00198023_m1</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>IGF2BP2</td><td>Thermofisher Hs01118009_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IKZF1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00172991_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL1RAP</td><td>Thermofisher</td><td>scientifique Hs00895050_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL2RG</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00953624_m1</td><td></td></tr><tr><td>IRF8</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00175238_m1</td><td></td></tr><tr><td>ITGB7</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01565750_m1</td><td></td></tr><tr><td>KIT</td><td>Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>Hs00174029_m1</tr><tr><td>Lin28B</td><td>Thermofisher</td><td>scientifique</td> Hs01013729_m1 <td></td></tr><tr><td>LMO2</td><td>Thermofisher</td><td>scientifique Hs00153473_m1</td><td></td></tr><tr><td>LYL1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01089802_g1</td><td></td></tr><tr><td>Meis1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td></td> Hs01017441_m1 <td></td></tr><tr><td>mKi67</td><td>Thermofisher</td><td>scientifique Hs01032443_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPL</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00180489_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPO</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00924296_m1</td><td></td></tr><tr><td>scientifique NFIB</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01029175_m1</td><td></td></tr><tr><td>Notch1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01062011_m1</td><td></td></tr><tr><td>Pten</td><td>Thermofisher Hs02621230_s1</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>scientifiqueRAG2</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01851142_s1</td><td></td></tr><tr><td>RPS18</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01375212_g1</td><td></td></tr><tr><td>RUNX1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00231079_m1</td><td></td></tr><tr><td>Shisa2</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01590823_m1</td><td></td></tr><tr><td>Spi1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs02786711_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile.IgH</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00378435_m1</td><td></td></tr><tr><td>TAL1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs01097987_m1</td><td></td></tr><tr><td>THY1</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00264235_s1</td><td></td></tr><tr><td>Tim.3.HAVCR2</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>Hs00958618_m1</td><td></td></tr><tr><td>VWF</td><td>Thermofisher Hs00169795_m1</td><td></td><td></td> scientifique</tr></tbody></table>

une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des populations de l’ancêtre

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophénotypiques caractérisation et analyse moléculaire ont longtemps servis à délimiter l’hétérogénéité et de définir les populations cellulaires distincts. FACS est en soi un dosage unicellulaires, toutefois avant l’analyse moléculaire, les cellules cibles sont souvent prospectivement isolées en vrac, perdant ainsi la résolution unicellulaire. Analyse de l’expression génique de la cellule unique fournit un moyen de comprendre les différences moléculaires entre les cellules individuelles dans les populations de cellules hétérogènes. Dans l’analyse de cellules en vrac une surreprésentation d’un type de cellules distinctes donne les préjugés et les occlusions des signaux des cellules rares avec importance biologique. En utilisant FACS indice tri couplé à l’analyse de l’expression génique de la cellule unique, les populations peuvent être étudiées sans la perte de résolution unicellulaire, tandis que les cellules avec l’expression de marqueurs de surface de cellules intermédiaires sont également capturés, permettant l’évaluation de la pertinence de l’expression du marqueur de surface continue. Nous décrivons ici une approche qui combine monocellulaires transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) et FACS index tri afin de caractériser simultanément le moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité au sein de populations de cellules.
Contrairement aux méthodes de séquençage de l’ARN unicellulaire, l’utilisation de qPCR avec l’amplification de la cible spécifique permet des mesures robustes des transcriptions de faible abondance avec moins d’abandons, alors qu’il n’est pas confondue par les questions liées aux variations de cellule-à lire profondeur. En outre, par directement tri indice unique-cellules en lysis buffer cette méthode, permet pour la synthèse de cDNA et préamplification cible spécifique à effectuer en une seule étape, aussi bien en ce qui concerne la corrélation des signatures moléculaires dérivés par la suite avec la surface de la cellule expression du marqueur. L’approche décrite a été développé pour enquêter sur le single-cellules hématopoïétiques, mais ont aussi été utilisées avec succès sur d’autres types de cellules.
En conclusion, l’approche décrite ci-après permet de mesurer sensible d’expression de l’ARNm pour un groupe de gènes présélectionnés avec la possibilité d’élaborer des protocoles d’isolement éventuels ultérieur de sous-populations moléculairement distinctes.

Le protocole décrit est rapide, facilement exécutées et très fiable. Un aperçu de la mise en place expérimentale est présenté dans la Figure 1. L’ensemble du protocole, du tri de simples cellules, amplification de la cible spécifique, mesures d’expression de gène et analyse préliminaire peut être effectué en trois jours. Un exemple des résultats analysés sous la forme d’une carte de chaleur qui représente ont analysé les données préliminaires de l’analyse l’e...

En vrac gene expression mesures nuage cellule individuelle différences dans les populations de cellules hétérogènes. Nous décrivons ici un protocole pour analyse de l’expression génique et l’index Comment unicellulaires Tri par Florescence activé cellule Tri (FACS) peut être combiné pour délimiter l’hétérogénéité et immunophenotypically caractériser les populations cellulaires moléculairement distinctes.

Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines des cellules souches et du cancer, comme l’hétérogénéité des cellules souches et la façon dont la thérapie dans les cellules cancéreuses sensibles peut être isolée. Le principal avantage de cette étude est qu’elle combine l’analyse techniquement robuste de l’expression des gènes unicell cellules avec la vaccinose pour une caractérisation plus poussée en aval des sous-populations cibles. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier le cancer et l’hétérogénéité des cellules souches, elle peut également donner un aperçu de l’amorçage génétique et du potentiel de lignée.Pour commencer le protocole, sur un banc exempt d’ARN/ADN, préparer suffisamment de tampon de lyse pour 96 puits avec 10% de plus en mélangeant 390 microlitres d’eau sans nucléase, 17 microlitres de 10%NP-40, 2,8 microlitres 10 milli molaires dNTP, 10 microlitres 0,1 molaire DTT, et 5,3 microlitres inhibiteur RNAse. Vortex et tourner dans le tube. Ensuite, distribuez quatre microlitres de tampon de lyse à chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits et scellez les plaques avec du film adhésif.Faites tourner les plaques pour recueillir le liquide au fond. Garder les plaques sur la glace jusqu’à ce que les cellules soient triées pendant un maximum de 24 heures. Une fois que la machine FACS a été correctement configurée, effectuez une réanalyse de la population cible en triant au moins 100 cellules cibles dans un nouveau tube de microcentrifugeuse avec 100 microlitres de tampon de tache.Facs analyser les cellules triées en enregistrant l’échantillon trié et assurez-vous qu’ils se retrouvent dans la porte de tri. Ensuite, installez le tri des plaques unicell cellules en centralant la chute du puits A1 dans la plaque de 96 puits. Lorsqu’il est centré, trier 50 à 106 particules de micromètres dans tous les puits autour du bord d’une plaque vide de 96 puits pour s’assurer que tous les puits auront une cellule au centre de chaque puits.Retirer le film adhésif des plaques. Trier une seule cellule de Lin-CD34 plus CD38 moins les cellules dans 92 des 96 puits. Activez le tri d’index dans le logiciel de tri FACS pour enregistrer le profil immunophéotypique pour CD45RA, CD49F et CD90 pour chaque cellule.Trier deux puits avec respectivement 10 et 20 cellules pour les contrôles de linéarité dans l’amplification PCR. Les puits H1 et H2 sont généralement utilisés. Gardez deux puits sans cellules car aucun modèle ne contrôle, puits généralement H3 et H4. Sceller les plaques avec un film adhésif clair et faire tourner les plaques à 300 fois la gravité pendant une minute.Casser le gel des plaques sur la glace sèche. Rangez-les ensuite à moins 80 degrés Celsius. Faites la transcription inverse et le mélange spécifique d’amplification cible en ajoutant 632,5 microlitres de mélange d’amorce de deux fois, 101,2 microlitres Taq/SuperscriptIII, 151,8 microlitres mélange d’amorce, et 0,7 microlitres piqués dans l’ARN de contrôle.Vortex la solution et tournez-la vers le bas pour recueillir le liquide au fond du tube. Garder le mélange sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être ajouté à l’échantillon. Ensuite, décongelez les plaques de lysate sur la glace.Ajoutez 8,75 microlitres de la transcription inversée précédemment préparée et du mélange d’amplification cible spécifique à 92 puits, y compris la linéarité et aucun contrôle de modèle. Ajouter 8,75 microlitres sans mélange de commande de transcription inversée aux quatre puits restants. Ensuite, sceller les plaques avec un film adhésif clair et faire tourner les plaques pour recueillir le liquide au fond.Effectuez la transcription inverse et l’amplification cible spécifique en exécutant la plaque dans une machine PCR selon le programme préampli. Préparer la plaque de chargement d’essai en pipetant trois microlitres de réachemit de chargement d’essai à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter trois microlitres de chaque amorce aux puits individuels dans la plaque de chargement d’essai.Sceller la plaque avec un film adhésif et la faire tourner vers le bas. Après avoir fait tourner la plaque, préparer la plaque de dilution en pipetant huit microlitres d’eau sans nucléase dans tous les puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter deux microlitres d’échantillon amplifié à la plaque de dilution.Sceller la plaque avec un film adhésif. Mélanger en tourbillonnant la plaque pendant 10 secondes. Ensuite, tournez vers le bas de la plaque.Ensuite, préparez le mélange de chargement de l’échantillon en mélangeant soigneusement 352 microlitres de mélange principal avec 35,2 microlitres de réaccent de chargement par échantillon. Préparer la plaque de chargement de l’échantillon en incitant 3,3 microlitres de mélange de chargement à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 2,7 microlitres de l’échantillon dilué dans chaque puits de la plaque de chargement de l’échantillon.Sceller la plaque avec un film adhésif et la faire tourner vers le bas. Sortez une nouvelle puce microfluidique 96 by 96. Préparez les entrées en les piquer avec une seringue avec un bouchon pour s’assurer qu’elles peuvent être déplacées.Ajouter le volume total des seringues à chaque valve tout en inclinant la puce à 45 degrés et en appuyant sur la valve. Primez la puce avec le contrôleur IFC. Chargez chaque entrée d’analyse avec 4,25 microlitres de chacun des puits dans la plaque de chargement d’essai et évitez les bulles.Si des bulles apparaissent dans le puits, retirez-les à l’aide d’une pointe de pipette. Continuez à charger chaque entrée d’échantillon avec 4,25 microlitres de chacun des puits de la plaque de chargement de l’échantillon, en évitant les bulles, et si des bulles semblent les enlever avec une pointe de pipette. Chargez la puce avec le contrôleur de circuit Fluidics intégré ou le contrôleur IFC.Vérifiez que la puce semble même et que toutes les chambres ont été chargées. Retirez la poussière de la surface de la puce en la touchant avec du ruban adhésif. Enfin, exécutez la puce dans la plate-forme d’expression génétique microfluidique multiplexe.Une carte thermique d’une course réussie affiche l’expression uniformément répartie à travers les échantillons avec un signal fort d’environ sept à 25 CTs. Cette courbe d’amplification de spiked dans l’ARN de commande vérifie que tous les puits ont l’expression claire d’environ 10 CT avec peu ou pas de variation, validant que la pré-amplification et les réactions de qPCR avaient été réussies pour toutes les cellules. L’analyse des composants principaux ou PCA qui visualise les similitudes entre les groupes cellulaires en utilisant la réduction des dimensions peut être utile pour distinguer les grappes de cellules moléculairement distinctes les unes des autres en identifiant ici quatre sous-groupes.Pour identifier l’immunophénotype des cellules de différents groupes moléculaires, chargez le fichier FCS index dans FlowJo. Ouvrez l’éditeur de script et coller le script de l’index, appuyez sur Exécuter. Chaque cellule sera maintenant dans une porte séparée.Ajoutez chaque cellule dans l’éditeur de mise en page et colorez-les en fonction du regroupement moléculairement défini de SCXV disponible dans le fichier sample_complete_data.xls. Les parcelles FACS montrent l’expression du marqueur de surface cellulaire pour les marqueurs hématopoïétiques de cellules souches CD90 et CD45RA qui peuvent être utilisés pour discriminer entre les grappes et les isoler pour une analyse fonctionnelle. À la suite de cette procédure, d’autres techniques comme le séquençage par ARN de sous-populations nouvellement découvertes ou d’expériences in vitro et in vivo peuvent être réalisées pour répondre à d’autres questions comme le mécanisme moléculaire qui cause cette hétérogénéité et comment la sous-population diffère-t-elle fonctionnellement.Cette stratégie a ouvert la voie aux chercheurs non seulement pour étudier l’hétérogénéité dans l’hématopoïèse normale et maligne, mais peut également être utilisée pour isoler prospectivement les sous-populations découvertes pour les étudier davantage.

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Génétique

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

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Un seul dosage de l'expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Ce protocole décrit comment évaluer l'expression d'un large éventail de gènes au niveau clonal. Unicellulaire RT-qPCR produit des résultats très fiables avec une forte sensibilité pour des centaines d'échantillons et les gènes.

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Nous avons développé un nouveau protocole pour étudier la dynamique de la population hétéro-cellulaire en réponse à des perturbations. Ce manuscrit décrit une plate-forme basée sur l'imagerie qui produit des jeux de données quantitatifs pour la caractérisation simultanée de multiples phénotypes cellulaires de populations hétéro-cellulaires de manière robuste.

Discrimination et caractérisation des populations hétéro-cellulaires à l&#39;aide de techniques d&#39;imagerie quantitative

Nous présentons ici la méthodologie pour l’analyse clonale de cellules souches hématopoïétiques précurseurs au cours du développement embryonnaire murin. Nous combinons indice tri des cellules individuelles de la région d’aorte-gonades-mésonéphros embryonnaire avec co-culture de cellules endothéliales et la transplantation pour caractériser les propriétés phénotypiques et le potentiel de prise de greffe des précurseurs hématopoïétiques unique.

Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

Nous présentons une méthode de cytométrie de flux pour identifier simultanément différents types de cellules récupérées du cerveau de souris ou de la moelle épinière. Cette méthode pourrait être exploitée pour isoler ou caractériser les populations cellulaires pures dans les maladies neurodégénératives ou pour quantifier l'étendue du ciblage cellulaire sur l'administration in vivo de vecteurs viraux ou de nanoparticules.

Caractérisation cytométrique simultanée des types de cellules multiples récupérées du cerveau de la souris / moelle épinière grâce à différentes méthodes d'homogénéisation

Présenté ici est une technique basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer simultanément le nombre de divisions cellulaires, le phénotype des cellules de surface et la parenté cellulaire. Ces propriétés peuvent être testées statistiquement à l’aide d’un framework basé sur la permutation.

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Le succès de la transcriptomique unicellulaire/mononoyau et de la multi-omique dépend en grande partie de la qualité des cellules/noyaux. Par conséquent, l’isolement des cellules/noyaux des tissus et leur purification doivent être hautement standardisés. Ce protocole décrit la préparation des noyaux du cerveau et de la moelle osseuse pour l’essai multiome à noyau unique en aval.

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Ce protocole décrit l’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence des cellules souches mésenchymateuses humaines à l’aide de la méthode de tri unicellulaire. Plus précisément, l’utilisation du tri unicellulaire permet d’atteindre une pureté de 99 % des cellules immunophénotypées d’une population hétérogène lorsqu’elle est associée à une approche multiparamétrique basée sur la cytométrie en flux.

Tri unicellulaire de cellules souches mésenchymateuses immunophénotypées à partir de dents de lait exfoliées humaines

Le protocole présenté ici permet l’identification et l’analyse de haute dimension des cellules souches musculaires et progénitrices par cytométrie de masse unicellulaire et leur purification par FACS pour des études approfondies de leur fonction. Cette approche peut être appliquée pour étudier la dynamique de régénération dans des modèles de maladies et tester l’efficacité d’interventions pharmacologiques.

Identification et analyse de progéniteurs myogéniques in vivo au cours d’une lésion aiguë des muscles squelettiques par cytométrie de masse unicellulaire de grande dimension

Nous présentons ici des protocoles qui permettent d’isoler des cellules stromales de l’os murin, de la moelle osseuse, du thymus et du tissu thymique humain compatibles avec la multiomique unicellulaire.

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Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre (Vidéo) | JoVE Journal

Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre

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