Name: Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez l'expression et la purification des canaux ioniques Bestrophin de mammifères. Cette méthode utilise des cellules HEK293F pour produire des protéines fonctionnelles et faciliter l'étude de la biophysique des canaux chlorure activés par le calcium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce projet a été financé par le NIH subventions EY025290, GM127652 et University of Rochester fonds de démarrage.

1. production BacMam Expression baculovirus
<ol><li>Insérez la séquence codante d’une protéine bestrophin mammifères désiré dans la cheville BacMam vector18 avec une séquence de reconnaissance de protéase tabac Etch Virus (TEV), suivie d’un GFP-10 x son étiquette à l’extrémité C-terminale de la protéine.</li>
	<li>Transfecter transitoirement le plasmide expression adhésif HEK293 cellules19,20,21,22,23. Contrôler l’expression de la protéine GFP-fusion sous un microscope à fluorescence avec 10 X ou 20 X grossissement, une source d’excitation 488 nm et un filtre d’émission de 510 nm (Figure 1 a). Remarque : Transfection à base de polymères est assurée de 1 μg d’ADN plasmidique pour un plat de 35 mm de cellules HEK293.</li>
	<li>Produire les baculovirus dans des cellules d’insecte Sf9 comme précédemment décrit16,17. Remarque : Le passage 3 (P3) virus, qui sera utilisé pour infecter les cellules HEK293-F pour la production de protéines, peuvent être stocké à 4 ° C pendant 1 mois.</li>
	<li>Déterminer le titre (unités infectieuses) du virus P3 par la plaque formation test16,17. Remarque : Comme la protéine d’intérêt est le tag GFP, une méthode plus rapide pour le contrôle des unités infectieuses est d’infecter les cellules Sf9 avec des dilutions successives du virus et de compter le nombre de cellules fluorescentes après 48 h.</li>
</ol>2. Expression de la protéine
<ol><li>Maintenir les cellules HEK293-F dans une culture en suspension avec le médium d’expression HEK293-F dans un incubateur à 37 ° C humidifié avec 8 % de CO2. Utiliser des flacons de culture jetable qui sont 2 à 2,5 fois plus grand que le volume de la culture et de faire pivoter la culture sur une plate-forme orbitale à 135 tr/min. Remarque : Il est recommandé d’infecter les cellules lorsqu’elles sont entre 5 et 30 passages et pour effectuer ces actions sous un capot de culture cellulaire.</li>
	<li>24h avant l’infection virale, ajouter 15 μL de bleu Trypan dans une aliquote de 15 μL de culture cellulaire et vérifier la densité cellulaire et la viabilité à l’aide d’un hémocytomètre sous un microscope. Diluer les cellules à 0,6 x 106 cellules/mL dans des fioles de 2 x 2 L chacun, 500 ml de milieu préchauffée à 37 ° C. Remarque : Les cellules mortes sont colorées bleu de Trypan Blues. La viabilité de la cellule souhaitée est &gt; 95 %.</li>
	<li>Le jour de l’infection, vérifiez la densité cellulaire et la viabilité (étape 2.2). Remarque : Une grande viabilité cellulaire de &gt; 95 % est essentiel pour l’expression efficace de l’infection et de protéines. La densité cellulaire attendue est ~1.0 x 106 cellules/mL (cultivée pendant la nuit de 2 x 500 mL le 0,6 x culture de cellules de 106 cellules/mL). Le nombre total de cellules est ~1.0 x 109.</li>
	<li>Les baculovirus P3 s’ajoute des cellules à une multiplicité d’infection (MOI) de 5. Pour déterminer la quantité de virus pour ensemencer, utilisez l’équation suivante : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57832/57832eq1.jpg">
</li>
	<li>Secouer les cellules sur la plate-forme orbitale à 135 tr/min dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 8 % CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Ajouter 10 mM du butyrate de sodium à la culture de cellules et continuer en incubation pendant 48 h. Remarque : Pour certaines protéines, réduisant la température de culture cellulaire à 30 ° C après que addition de butyrate de sodium peut améliorer expression et la stabilité.</li>
	<li>Sous un microscope à fluorescence avec 10 X ou 20 X grossissement, une source d’excitation 488 nm et un filtre de d’émission 510 nm, vérifiez le pourcentage et la luminosité des cellules vertes, qui représentent directement le rendement de protéine (bestrophin-GFP-10xHis) (Figure 1 b). Remarque : Le pourcentage de cellules vertes est calculé en : 100 x (cellules cellules vertes/Total). Niveau d’expression de protéine bon est indiqué par la forte fluorescence verte sous le microscope.</li>
	<li>Récolter les cellules par centrifugation à 1 000 x g à 4 ° C pendant 20 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les pellets de la cellule avec la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour un volume final de ~ 80 mL. Split, la suspension cellulaire dans les tubes coniques de 2 x 50 mL et centrifuger à 1 000 x g à 4 ° C pendant 20 min. stocker les pellets de cellule à-80 ° C.</li>
</ol>3. Purification de protéine
<ol><li>Incuber les tubes coniques contenant des granulés de cellule dans un bain d’eau à température ambiante pendant 10-15 min en remuant pour qu’ils dégèlent. Remettre en suspension les cellules à 2 x volume (p/v) de tampon A (tableau 1) (p. ex., 10 g de pastilles de cellule dans 20 mL de tampon) complétée avec des inhibiteurs de protéinase (aprotinine, leupeptine, pepstatine A et phénylméthylsulfonyle fluorure) à 0,1 à 1,0 mM. Pipette de haut en bas longuement pour obtenir une suspension cellulaire homogène.</li>
	<li>Lyse des cellules à l’aide d’un homogénéisateur haute pression. Exécutez la suspension cellulaire par le biais de l’homogénéisateur à 7-10 MPa pour un total de 3 - 4 fois pour obtenir une homogénéisation complète. Garder la cellule lysat sur glace pendant 2-3 minutes entre les rounds.</li>
	<li>Ajouter du détergent [par exemple, 2 % w/v sol-grade n-dodécyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)] pour le lysat cellulaire. Incuber en agitant pendant 1 h à 20 ° C pour extraire les protéines de la membrane. Remarque : Le type de détergent doit être optimisé pour chaque protéine cible18,24.</li>
	<li>Centrifuger à 150 000 x g dans une ultracentrifugeuse à 4 ° C pendant 1 h. Remarque : Toutes les étapes suivantes sont effectuées à 4 ° C.</li>
	<li>Ramassez les lysats de cellules claires et les flux à travers une 5 mL son piège Ni2 +LTN - colonne d’affinité préalablement équilibrés avec tampon A (tableau 1). Remarque : Après centrifugation, le lysat de cellules claires sera intercalé entre un culot au fond et une couche nuageuse sur le dessus. Utiliser une pipette de transfert de 10 mL pour recueillir soigneusement le lysat clair et ensuite passer à une pipette 1 mL pour le dernier quelques millilitres de lysat. Éviter le culot, qui peut boucher la colonne de Ni2 + ; Cependant, une petite quantité de la couche supérieure est très bien ou peut être filtrée avec un filtre 1,5 μm.</li>
	<li>Laver la colonne avec 25 mL de tampon B, puis 40 mL de tampon C (tableaux 2 et 3, respectivement). Remarque : C’est un bon endroit pour prendre une pause, comme purification totale peut prendre jusqu'à 12 h et de la protéine peut demeurer stable bien qu’attachée à la colonne du jour au lendemain.</li>
	<li>Fixer la colonne sur un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide et éluer avec fractionnement, la protéine de la colonne avec 13 mL de tampon D (tableau 3). Recueillir les fractions enrichies en protéines selon la lecture d’absorbance UV. Remarque: conditions de la FPLC sont les suivantes : une taille de fraction de 1,0 mL, une alarme de pression de la précolonne égale à 0,3 MPa et un débit de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Mesurer la concentration de produit protéine éluée sur un spectrophotomètre microvolume. Lire l’absorbance à 280 nm.</li>
	<li>(Facultatif) Pour supprimer la balise de GFP-10xHis, ajouter la protéase TEV dans un rapport de masse de 1:1 et incuber à 4 ° C pendant 30 min. Note : La balise peut ou peut ne pas affecter la fonction ou la structure du canal purifié. Calculer le montant TEV de la volume et de la concentration de la protéine recueillie des étapes 3,7 à 3,8. Par exemple, si 10 mL de produit d’élution est recueilli et mesurée à 0,1 mg/mL, la protéine totale masse est 10 x 0,1 = 1 mg et 1 mg de TEV sera utilisée pour la digestion.</li>
	<li>Concentrer la protéine avec un 15 mL centrifuge (50 ou 100 kDa) unité de filtration de la filature à 4 000 x g à 4 ° C pour un volume final de 400-500 μL (pour une boucle de chargement d’échantillon de 2 mL sur FPLC). Remarque : Le temps de centrifugation pour concentration varie en fonction de la concentration et la taille de la protéine. Pour éviter de trop se concentrer, qui peut provoquer la précipitation de protéines, tourner pendant 10 min dans un premier temps, puis observer le volume restant et estimer le temps pour une rotation ultérieure (par exemple, 2-5 min), et ainsi de suite, pour obtenir le volume final. Pipette entre les spins pour disperser la protéine, qui est tirée vers le bas du filtre.</li>
	<li>Transférer le concentré de protéine pour une nouvelle 1,5 mL de tube et de retirer le produit concentré de n’importe quel précipité ou bulles. Tournent à &gt; 12 000 x g pendant 5-10 min à 4 ° C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Charger le produit final avec une seringue de 1 mL et une aiguille ronde-pointe sur un système FPLC pour chromatographie liquide d’exclusion avec une colonne de taille-exclusion préalable équilibrée avec tampon E (tableau 5). Remarque: conditions de la FPLC sont les suivantes : une taille de fraction 0,5 mL, une alarme de pression de la colonne avant la valeur 2,50 MPa, un volume de flux définie dans 30 mL de tampon E (tableau 5), et un débit préréglé à 0,5 mL/min.</li>
	<li>Notez que les protéines sages exécutent en tant qu’un seul pic (Figure 2 a) et recueillent le procède de la protéine correspondant à ce pic (Figure 2 a).</li>
	<li>Concentrer la protéine avec une unité de filtration centrifuge de 4 mL ou 0,5 mL (de la même coupure de poids moléculaire comme à l’étape 3.10) et un essorage à 4 000 x g à 4 ° C à une concentration finale de 5 à 10 μg/μL. Le spectrophotomètre permet de vérifier la concentration du produit final (étape 3,8). Note : Temps de Centrifugation varie, comme le volume du produit final peut différer entre les essais de purification. Habituellement, la centrifugation prend 10-20 min. Il est recommandé de pipette entre les spins pour disperser la protéine, qui est tirée vers le bas du filtre.</li>
	<li>Le concentré de protéine de transfert dans un nouveau tube de 1,5 mL. Supprimer n’importe quel précipité par centrifugation à &gt; 12 000 x g pendant 5-10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Apportez 10 μL parties aliquotes pour stockage à-80 ° C et enregistrez une aliquote petits de 2-5 μL d’exécuter sur un gel SDS-PAGE dégradé de 4 à 15 % à 9 V/cm (Figure 2 b).</li>
	<li>Confirmer l’identité de la protéine purifiée par spectrométrie de masse8. Note : In vitro d’analyse de la fonction et la structure de la protéine purifiée peuvent être effectuées par le biais de bicouches lipidiques planes et cristallographie de rayon x, respectivement de5,8.</li>
</ol>

<ol><li>Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+bestrophins%3A+multifunctional+membrane+proteins+linked+to+best+disease+and+other+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Review%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies.</a> Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).</li>
<li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin%2C+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+%28VMD2%29%2C+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li>
<li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+novel+gene%2C+VMD2%2C+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li>
<li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1%27s+essential+role+in+mediating+Ca2%2B-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Tsunenari, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+the+bestrophin+family+of+anion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).</li>
<li>Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+insights+into+the+function+of+a+Ca%282%2B%29-activated+Cl%28-%29+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel.</a> Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Johnson, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28153808">Bestrophin 1 and retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).</li>
<li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).</li>
<li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein%2C+bestrophin-1%2C+cause+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).</li>
<li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best+disease%29+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).</li>
<li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+%28ADVIRC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li>
<li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEST1%3A+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nature Communications. 4, 2540(2013).</li>
<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> Public Library of Science One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+and+cross-linking+mass+spectrometry+%28CX-MS%29+for+structural+elucidation+of+large+protein+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Opinions+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies.</a> Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).</li>
<li>Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+and+development+for+rare+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Drug discovery and development for rare genetic disorders.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit un pipeline utile pour l’expression et purification des canaux ioniques bestrophin mammifère à être utilisé pour des analyses futures in vitro . Alors que l’appareil FPLC est nécessaire pour la chromatographie d’exclusion stérique, un pousse-seringue est suffisante pour toutes les étapes de la chromatographie d’affinité y compris contraignantes, lavage et d’élution. Lorsque vous utilisez une pompe à seringue pour pousser des solutions (dans une seringue) à travers une colonne, il est essentie...

Bestrophins sont une famille de canaux ioniques conservés par espèces variant de bactéries à l’homme1. Chez l’homme, le gène BEST1 , situé sur le chromosome 11q12.3, code pour la protéine de la membrane Bestrophin-1 (BEST1) qui s’exprime principalement dans la membrane basolatérale des cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien des yeux2,3 ,4. Composé de 585 acides aminés, la première ~ 350 qui sont hautement conservées entre les espèces et contenir sa région transmembranaire, BEST1 agit comme un CaCC dans les humains1,5,6. En outre, les homologues BEST1 chez les poulets et Klebsiella pneumoniae à la fois fonctionnent comme homopentamers7,8, ce qui suggère un niveau élevé de conservation tout au long de l’évolution.
Chez l’homme, plus de 200 mutations du gène BEST1 ont été cliniquement liées à un groupe de maladies de dégénérescence rétinienne appelé bestrophinopathies1,9. Cinq bestrophinopathies spécifiques ont été signalés, notamment maladie de Best, dystrophie Vitelliforme de l’adulte, autosomique dominante vitreoretinochoroidopathy, autosomique récessive bestrophinopathy et rétinite pigmentaire3,4 ,10,11,12,13,14. Ces maladies, qui conduisent à une diminution de la vue et même la cécité, sont actuellement incurables. Afin de développer des traitements thérapeutiques et médicaments potentiellement personnalisés, il est essentiel de comprendre comment ces mutations pathogènes de BEST1 influencent la fonction et la structure des BEST1 canal15. À ces fins, les chercheurs doivent obtenir des canaux bestrophin purifié (souche sauvage et/ou mutant) et conduite in vitro analyses5,8.
La première étape clée est l’expression des canaux bestrophin des espèces plus élevées dans les cellules de mammifères. Comme baculovirus transduction des cellules HEK293-F (système BacMam) est une méthode puissante pour exprimer façon hétérologue protéines de membrane16,17, ce protocole utilise un vecteur de BacMam (pEG BacMam) optimisé pour expression robuste de la cibler les protéines18, dans ce cas, qui est un homologue de bestrophin chez les mammifères. Ce vecteur a été utilisé pour l’expression de diverses protéines de membrane, y compris des récepteurs couplés aux protéines G, récepteurs nucléaires et autres de canaux d’ion18. Il semble également que les protéines produites sont adaptés pour la cristallographie18. Avec des niveaux élevés d’expression dans les cellules HEK293-F, les protéines peuvent alors être épurées chromatographie ; plus précisément, dans le cas de bestrophins, affinité et chromatographie liquide d’exclusion peuvent être utilisés.
Une fois que ce protocole est affiné pour une chaîne de bestrophin, la protéine purifiée puis peut être analysée que pour sa fonction et sa structure à travers la bicouche lipidique plane et cristallographie de rayon x, respectivement de5,8. Au total, ces techniques offrent un pipeline puissant pour les études fonctionnelles et structurelles des bestrophins et d’autres canaux ioniques.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327265000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446212500</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC301870010</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>Scientific AC197530010&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA4058704</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ63039MA</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61188MB&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine A</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ20037MB</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740050</td><td></td></tr><tr><td>DDM sol-grade</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>DDM anagrade</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II</td><td>SFM ThermoFisher</td><td>10902179</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle medium</td><td>ThermoFisher</td><td>12338018</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur haute pression</td><td>Avestin</td><td>Emulsiflex-C5</td><td></td></tr><tr><td>Colonne HisTrap</td><td>GE</td><td>17-5248-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex-200</td><td>Colonne GE</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Pure</td><td>GE</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-15 unités de filtration centrifuge</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-4 Unités de filtration</td> centrifuge <td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-0,5 Unités de filtration centrifuge</td><td>Millipore</td><td>UFC505024</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Gel préfabriqué Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur T100</td> Réactif de transfection <td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>Vecteur</td><td></td> SignaGen SL100688 <td></td></tr><tr><td>pEG BacMam</td><td>Obtenu du laboratoire de Gouaux à l’Institut Vollum</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression et purification des canaux ioniques de mammifères bestrophin

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Le génome humain code pour quatre bestrophin paralogues, nommément BEST1, BEST2, BEST3 et BEST4. Best1, codée par le gène BEST1 , est un Ca2 +-activé Cl– canal (CaCC) principalement exprimée dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE). La signification physiologique et pathologique de BEST1 est mis en évidence par le fait que plus de 200 mutations différentes du gène BEST1 ont été génétiquement liées à un éventail d’au moins cinq troubles dégénératifs rétiniens, comme meilleur Vitelliforme Dystrophie maculaire (meilleure maladie). Par conséquent, comprendre la biophysique des canaux de bestrophin à l’échelle de la molécule unique est titulaire d’importance considérable. Cependant, obtenir des canaux ioniques mammifères purifiée est souvent une tâche difficile. Nous rapportons ici un protocole pour l’expression des protéines de mammifères bestrophin avec le système de transfert de gène de baculovirus BacMam et leur purification par affinité et chromatographie d’exclusion stérique. Les protéines purifiées ont le potentiel d’être utilisé dans les analyses subséquentes fonctionnelles et structurelles, telles que l’enregistrement électrophysiologique dans les bicouches lipidiques et cristallographie. Ce qui est important, ce pipeline peut être adapté pour étudier les fonctions et les structures d’autres canaux ioniques.

L’intensité de la fluorescence dans les cellules transfectées de manière transitoire de HEK293 adhésifs (Figure 1 a) est un bon indicateur pour le niveau d’expression de protéine projetées dans les cellules HEK293-F suspension (Figure 1 b). Si la protéine cible n’est pas bien exprimée ou est mal localisée dans les cellules HEK293 après transfection transitoire, il est recommandé d’envisager de modifier la construction de l’expres...

La purification des canaux ioniques est souvent difficile, mais une fois atteint, il peut potentiellement permettre in vitro les enquêtes des fonctions et des structures des canaux. Nous décrivons ici les procédures pas à pas pour l’expression et purification des protéines de mammifères bestrophin, une famille de Ca2 +-activé les canaux Cl– .

Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à la biophysique des canaux ioniques des mammifères, y compris, mais sans s’y limiter, la famille des canaux ioniques de la bestrophine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée à d’autres types de canaux ioniques et génère des produits clés pour divers essais in vitro en aval. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des bestrophinopathies, car les tests utilisant la protéine purifiée contribuent à notre connaissance du fonctionnement des canaux de la bestrophine dans la rétine et de la façon dont les mutations du gène BEST1 provoquent la dégénérescence maculaire.Vingt-quatre heures avant l’infection virale, ajoutez un volume égal de bleu de trypan à une aliquote de 15 microlitres de culture cellulaire HEK293F et vérifiez la densité et la viabilité cellulaires à l’aide d’un hémocytomètre au microscope. Après avoir effectué la numération cellulaire, déposer 0,6 fois 10 à la sixième cellule par millilitre dans un volume de 500 millilitres dans chacune des deux fioles jetables de deux litres. Placez les flacons dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 8 % de

expression-and-purification-of-mammalian-bestrophin-ion-channels

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

Les tentatives pour exprimer le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR)...

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

Procédures pour les reconstitution complète d'un canal de de potassium tension-à déchenchements périodiques prototype dans des membranes de lipides sont décrits. Les canaux reconstitués sont adaptés à des dosages biochimiques, les enregistrements électriques, le dépistage du ligand et des études cristallographiques d'électrons. Ces méthodes peuvent avoir des applications générales aux études structurales et fonctionnelles d'autres protéines membranaires.

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

Décrit ici est un procédé rapide et efficace pour la reconstitution fonctionnelle de type sauvage purifiée et une protéine de CFTR mutante qui conserve l'activité de ce canal de chlorure, qui est défectueux dans la fibrose kystique. Efflux d'iodure de protéoliposomes reconstituées médiées par CFTR permet des études de l'activité du canal et les effets de petites molécules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

Il s’agit d’un protocole rapide et rentable pour la production de protéines de mammifères glycosylées sécrétées et la purification ultérieure en une seule étape avec des rendements suffisants de protéines homogènes pour la cristallographie aux rayons X et d’autres études biophysiques.

Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

Le protocole ici décrit les interactions de protéine purifiée hEAG1 de canal ionique avec la petite molécule lipidique ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). La mesure démontre que BLI pourrait être une méthode potentielle pour le dépistage de nouvelles petites molécules ion canal ligand.

Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche

Cet article décrit des méthodes spécifiques pour obtenir des quantités biochimiques de TRPV1 solubilisée détergent pour analyse spectroscopique. Les protocoles combinés offrent des outils biochimiques et biophysiques qui peuvent être adaptées afin de faciliter les études structurales et fonctionnelles des canaux ioniques mammifères dans un environnement contrôlé en membrane.

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.

Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Nous présentons ici un protocole visant à exprimer, solubiliser et purifier plusieurs transporteurs de borate eucaryotes avec une homologie avec la famille de transporteur SLC4 à l’aide de la levure. Nous décrivons également un test de réticulation chimique afin d’évaluer les protéines purifiées homomères multimériques l’Assemblée. Ces protocoles peuvent être adaptées pour d’autres protéines membranaires difficiles.

Expression, solubilisation et Purification des transporteurs de Borate eucaryotes

Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, dans ce protocole, une stratégie modifiée de purification d’affinité et de compétition a été développée pour purifier le canal endogène TRP de la drosophile .

Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile

Les études structurales et biochimiques des transporteurs membranaires humains nécessitent des quantités de quelques milligrammes de protéines stables, intactes et homogènes. Nous décrivons ici des méthodes évolutives pour cribler, exprimer et purifier les transporteurs de solutés humains à l’aide de gènes optimisés pour les codons.

Expression et purification à haut débit de vecteurs de solutés humains pour des études structurales et biochimiques

Découvrez l'expression et la purification des canaux ioniques Bestrophin de mammifères. Cette méthode utilise des cellules HEK293F pour produire des protéines fonctionnelles et faciliter l'étude de la biophysique des canaux chlorure activés par le calcium.

Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin

Explorer plus de vidéos