Essai de co-immunoprécipitation des protéines nucléaires endogènes de cellules cultivées dans des Conditions hypoxiques

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine hypoxique, telles que les interactions endogènes et natives entre les facteurs de transcription et leurs corégulateurs transcriptionnels dans des conditions hypoxiques. Le principal avantage de cette technique est que les cellules hypoxiques sont récoltées dans des conditions hypoxiques et que les fractions nucléaires sont utilisées pour la co-immunoprécipitation. Ce protocole utilise des cellules embryonnaires humaines de rein 293A cultivées dans quatre boîtes de 10 centimètres.

Grainez trois à cinq fois 10 à six cellules par boîte dans 10 millilitres de milieu Eagle’s modifié de Dulbeco complété par 10 % de FBS, de la L-glutamine, du pyruvate de sodium, de la pénicilline et de la streptomycine. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone. Vingt-quatre heures après l’ensemencement, lorsque les cellules ont atteint 80 à 90 % de confluence, placez deux plats dans la sous-chambre d’hypoxie de la boîte à gants de l’incubateur avec 1 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Gardez les deux autres plats à la normoxie. La veille de la récolte des cellules traitées à l’hypoxie, pré-équilibrez le DPBS dans des conditions hypoxiques en plaçant une bouteille de réactif en verre de 100 millilitres remplie de DPBS dans la sous-chambre d’hypoxie pendant 24 heures. Environ une heure avant de récolter les cellules, placez une glacière contenant de la glace dans la chambre de traitement de la boîte à gants, qui a été équilibrée à 1 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone.

Transférez la bouteille contenant le DPBS hypoxique pré-équilibré de la sous-chambre d’hypoxie à la chambre de traitement et placez-la sur de la glace. Quatre heures après le traitement par hypoxie, transférez les cellules de la sous-chambre d’hypoxie à la chambre de traitement qui a été pré-équilibrée à 1 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Retirer le milieu de culture par aspiration et à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, rincer une fois les cellules avec 10 millilitres de DPBS hypoxique pré-équilibré glacé.

À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, ajoutez 5 millilitres de DPBS pré-équilibré glacé et délogez les cellules en grattant avec un grattoir cellulaire. Inclinez la plaque de culture cellulaire, collectez les cellules détachées à l’aide d’une pipette de 10 millilitres et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Gardez le tube de cellules sur de la glace.

Ouvrez la porte entre les chambres de traitement et de tampon dans la boîte à gants, qui ont toutes deux été pré-équilibrées à 1 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Transférez les tubes coniques de 15 millilitres sur de la glace contenant des cellules traitées à l’hypoxie de la chambre de traitement à la chambre tampon. Ouvrez la porte de la chambre tampon et retirez complètement les cellules de la boîte à gants.

Granulez les cellules hypoxiques et les cellules normoxiques par centrifugation à 1000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Un kit d’extraction nucléaire sera utilisé pour cette procédure. Commencez par remettre doucement en suspension chaque pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de lyse NL, complété par un cocktail inhibiteur de protéase 1X dans 0,1 molaire de DTT en pipetant plusieurs fois de haut en bas.

Ajoutez 25 microlitres de solution détergente NP à la suspension cellulaire et vortex pendant 10 secondes à vitesse maximale. Centrifuger à 1000 fois 10 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Conservez à la fois le surnageant et la pastille nucléaire.

Après avoir collecté et stocké le surnageant comme décrit dans le protocole textuel, remettre en suspension les noyaux cellulaires contenant des pastilles dans 500 microlitres de tampon de lyse NL, complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 1X et 0,1 molaire de DTT par vortex pendant cinq secondes à la vitesse maximale. Remettre en suspension la pastille nucléaire dans 50 microlitres de tampon d’extraction NX1, complété par un cocktail inhibiteur de protéase 1X en pipetant la pastille de haut en bas plusieurs fois. Incuber sur glace pendant 30 minutes.

Toutes les cinq minutes, vortex pendant 10 secondes à vitesse maximale. Centrifugeuse à 12 000 x g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Recueillir le surnageant et le transférer dans des mini-appareils de dialyse d’un volume maximal de 100 microlitres par unité pour le dessalage.

Fermez les mini-appareils de dialyse et placez-les dans un dispositif de flottaison. Placez le dispositif de flottaison dans un bécher contenant 500 millilitres de tampon de dialyse pré-refroidi. Attention à éviter tout contact direct avec la peau ou l’inhalation du tampon de dialyse, car il contient du PMSF.

Incuber à quatre degrés Celsius en remuant doucement pendant 30 minutes. Après 30 minutes, prélevez les échantillons dans le coin des mini-appareils de dialyse et transférez-les dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Centrifugeuse à 12 mille fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Aliquote 25 microlitres de chaque surnageant dans un tube à centrifuger de 1,5 microlitre et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Préparez les billes de sépharose de protéine AG à utiliser dans l’immunoamortissement. Pipetez 50 microlitres de billes dans chacun des quatre tubes à centrifuger de 1,5 millilitre et ajoutez 500 microlitres de tampon DPBS par tube.

Granulez les billes par centrifugation. Jetez le surnageant et remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon TBS. Ajouter deux microlitres d’anticorps monoclonal anti-ARNT de souris ou d’immunoglobuline G de souris préparée en reconstituant 0,7 milligramme d’IgG de souris dans 500 microlitres de tampon TBS.

Apportez les tubes de microcentrifugation contenant les billes dans une chambre froide. Placez-les dans un rotateur de tube et incubez à 10 tr/min pendant deux heures. Au bout de deux heures, granulez les billes par centrifugation et jetez les surnageants.

Diluer 200 microgrammes de lysat de protéine nucléaire préparé précédemment dans 800 microlitres de tampon d’immunoprécipitation. Incuber le lysat avec les billes couplées aux anticorps à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, granulez les billes par centrifugation à 3000 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Ajoutez un millilitre de TBS glacé contenant 0,2 % de NP-40 dans chaque tube et tournez. De cette manière, lavez les billes trois fois avec du TBS glacé contenant 0,2 % de NP-40.

Faites bouillir les billes dans 50 microlitres de tampon d’échantillon Laemmli à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Centrifugez les billes à 10 mille fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Récupérez le surnageant et jetez les perles.

Les niveaux d’expression dans la localisation subcellulaire des composants du complexe HIF-1 après un traitement par hypoxie ont été examinés dans HEK293A cellules. Comme prévu, les niveaux totaux de HIF-1a ont été régulés à la hausse par l’hypoxie, tandis que les niveaux d’ARNT dans les lysats cellulaires totaux n’ont pas été modifiés de manière significative. De plus, l’hypoxie a induit l’accumulation nucléaire de HIF-1a et d’ARNT.

Des expériences de co-immunoprécipitation ont été réalisées à l’aide d’extraits nucléaires de cellules HEK293A exposées à des conditions normoxiques ou hypoxiques. Comme le montre ici, HIF-1a a été co-immunoprécipité avec l’ARNT à partir d’extraits nucléaires de cellules HEK293A hypoxiques, ce qui indique que HIF-1a interagit avec l’ARNT dans des conditions hypoxiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’hypoxie pour explorer les interactions entre les protéines nucléaires endogènes et leurs conditions hypoxiques.