Name: Méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide Gamma - aminobutyrique tapez une Neurotransmission (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Découvrez une cascade de criblage pour identifier de nouveaux ligands des récepteurs GABA-A utilisant des oocytes de Xenopus et des tranches de cerveau de rongeur. Cette méthode combine liaison de radioligands et enregistrements électrophysiologiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs remercient Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab et Marie Claire Pflimlin de la Roche et Tifany Schaer et Deborah Paolucci de HiQScreen pour leur assistance technique excellente.

Xenopus laevis sont logés et manipulés conformément aux lignes directrices Animal Canton de Genève.
1. radioligands
<ol><li>
Préparation de la plaque d’essai
	<ol>
<li>Préparer le 1,5 L de tampon avec 5 mM de KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl et 15 mM Tris ; ajuster le pH avec du HCl à 7,4.</li>
		<li>Préparer les composés à tester à 50,76 µM (par exemple, un composé à 10 mM dans un 980 µL de tampon de dosage dans un tube de microcentrifuge de 5 µL). Mélangez-les bien en utilisant une machine de vortex à grande vitesse pour 2 à 5 s.</li>
		<li>Préparer une dilution préalable de la flumazénil composé de référence en pipettant : 1 l de ce composé (10 mM) à 1 970 µL de tampon. Mélangez-les bien en utilisant une machine de vortex à grande vitesse pour 2 à 5 s.</li>
		<li>Diluer une solution mère de flumazénil [3H] avec le tampon à 4 ° C à 4 nM dans un tube en polypropylène 50 mL.</li>
		<li>Pipetter 50 µL/puits de tampon dans les colonnes 1 et 3-11 d’une microplaque 96 puits comme illustré dans le schéma représenté à la Figure 2.</li>
		<li>Pipetter 73,2 µL des composés dilués à 50,76 µM (voir étape 1.1.2) dans la colonne 12 de la plaque.</li>
		<li>Diluer chaque composé, à l’aide d’une progression géométrique sur 9 étapes (1E-10 – 1E–06 M), avec un volume de transfert µL 23,12 et le remplissage colonnes 3 – 11. Bien mélanger la dilution. Changer l’embout après chaque dilution.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluer les membranes cellulaires
	<ol>
<li>Décongeler les membranes des cellules déjà isolés d’un récepteur de GABAA humain sur-exprimant HEK293 (0,025 – 0,15 mg/mL) pour obtenir 80 mL à température ambiante (RT) et transférer la suspension dans le tampon à 4 ° C.</li>
		<li>Resuspendre la solution membrane encore à 4 ° C avec un homogénéisateur de tissu pour 30 – 40 s à 10 000 – 12 000 tr/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluer le diazépam pour le contrôle de la liaison non spécifique (NSB)
	<ol>
<li>Diluer une solution mère de diazépam de 4 mM avec le tampon à une concentration de 40 µM dans 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Commencer la réaction
	<ol>
<li>Distribuer 50 µL de 4 nM [3H] flumazénil dans chaque puits de la plaque à 96 puits et conservez-le dans un récipient d’eau glacée.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de la préparation de membranes de sous-type de récepteur GABAA pour avoir une teneur en protéine de 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Pipetter 50 µL de 40 diazépam µM dans la colonne 2.</li>
		<li>Incuber la plaque pendant 1 h sur la glace.</li>
		<li>Ajouter 50 µL de tampon dans chaque puits d’une plaque 96 puits filtre de séparation par membrane ultérieures et de mesure de la radioactivité et arrêter la réaction par la suite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Arrêter la réaction
	<ol>
<li>Préparer un tampon de lavage avec 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.</li>
		<li>Filtrer la solution avec une abatteuse de cellule de 96 puits. Laver la plaque 3 x avec 300 µL de tampon de lavage glacee / puits.</li>
		<li>Sceller la partie inférieure de la plaque avec un film plastique et ajouter 40 µL de cocktail pour liquide de scintillation scintillation comptant chacune bien et essuyez-le avec de l’éthanol 70 %.</li>
		<li>Secouez légèrement la plaque pendant au moins 1 h à température ambiante. Laissez reposer pendant au moins une heure à température ambiante.</li>
		<li>Mesurer la radioactivité (en CPM) en plaçant la plaque sur un compteur à scintillation. Permettre une mesure pendant 3 min / puits.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse des données
	<ol>
<li>Déterminer que la moyenne pour les 8 réplique de liaison non spécifique (NSB) et de la fixation totale (CT) aussi bien en ce qui concerne les doublons ou réanalysés des échantillons. Calculer la % de fixation spécifique (SB) pour la moyenne de l’échantillon selon l’équation suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Ici, total SB = la moyenne to moins le moyen les ONN.</li>
		<li>Terrain en abscisse le SB % versus en ordonnée les concentrations de l’inhibiteur. Ajuster les données à l’aide de l’équation d’analyse de concurrence site unique : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Ici, y = le % de SB, A = le minimum y, B = la valeur maximale y, C = la ci50, X = le journal10 de la concentration du composé concurrente, D = pente de la courbe (un coefficient de Hill).</li>
		<li>Calculer l’affinité (Ki) en utilisant la moitié de la concentration inhibitrice maximale (IC50), la constante de dissociation (Kd) de flumazénil [3H] sur les membranes respectives9et la concentration de la [3H] flumazénil dans le dosage selon l’équation suivante à l’aide de données : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enregistrements dans des ovocytes de Xenopus et Expression du récepteur
<ol><li>Ovaires récolte et préparation des ovocytes
	<ol>
<li>Préparer la solution stérile de Barth avec 88 mM NaCl, KCl 1 mM, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O et 0,41 mM CaCl2.6H2O, à pH 7,4 , additionné de 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 µg/mL d’amphotéricine b.</li>
		<li>Préparer le milieu de x OR2 1 (aucun CaCl2) avec 88,5 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, à un pH de 7,4.</li>
		<li>Sacrifice une Xenopus Laevis femelle par une anesthésie profonde pendant 20 min en refroidi méthanesulfonate de tricaïne (à une concentration de 150 mg/L, ajusté à pH 7,4) et bicarbonate de sodium (300 mg/L) suivie par décapitation.</li>
		<li>Récolter les ovaires rapidement avec des ciseaux propres et forceps et placez-les dans 2 plats de Pétri (10 cm) contenant 40 mL de 1 x solution de Barth et antibiotiques/antimycosiques.</li>
		<li>Stocker les ovaires non dissociées jusqu'à 2 semaines dans une solution Barth à 4 ° C.</li>
		<li>Pour la dissociation, couper les ovaires avec une lame de rasoir propre en petites fractions (1 – 2 cm3) et incuber eux dans 50 mL d’OR2 moyen sans CaCl2 (OR2-noCaCl2) contenant 0,2 % collagénase (Type I) à 17 et 19 ° C dans un cône de 100 mL fiole avec une agitation lente pendant 4 à 5 h. vérifier que le barreau magnétique est placée environ 3 à 5 cm au-dessus du fond de la fiole de spinner pour ne pas écraser les ovocytes.</li>
		<li>Après 4-5 h, vérifier que la plupart des ovocytes est libérée de leur follicule (c.-à-d., ils nagent individuellement). Laver 5 x 200 ml d’OR2 additionné de 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Transférer la defolliculated ovocytes à boîtes de Pétri (10 cm) rempli de solution de Barth et antibiotiques/antimycotiques et garder au moins une nuit à 17 ° C avant l’injection d’ADNc ou ADN messagère.</li>
		<li>Le jour suivant, sélectionnez cette option, au titre de jumelles, un ovocyte en bonne santé présentant une claire et distincte animaux contre un poteau de vegetal (brun foncé pour le pôle animal contre jaune clair pour le pôle végétal). Utiliser des pipettes Pasteur propres et jeter les ovocytes un par un dans une plaque de puits 96-injection conique stérile. NOTE : Aucun soin particulier n’est nécessaire dans le placement des ovocytes pour les injections de l’ARNm ; considérant que, pour les injections de l’ARNC, il est indispensable d’orienter les ovocytes avec le pôle animal vers le haut.</li>
	</ol></li>
	<li>ARNm ou cDNA injection automatique
	<ol>
<li>Synthétiser les ARNm à l’aide d’un kit disponible dans le commerce en suivant les instructions recommandées. Nettoyer les instruments et la table avec de la RNase et porter des gants de protection appropriés. NOTE : La qualité de l’ARNm est déterminant pour obtenir une bonne expression, et il est indispensable de prévenir la dégradation de l’ARNm lors de la procédure d’injection.</li>
		<li>Préparer à l’aide d’un kit disponible dans le commerce des ADNc et dissoudre la quantité désirée dans l’eau Watercooling à une concentration de 0,2 µg/µL.</li>
		<li>Injecter 10 à 50 nL de solution d’ARNm à une concentration de 0,2 nL µg/µL ou 10 de cDNA de solution à une concentration allant de 0,02 à 0,2 µg/µL, de préférence en lots de 95 ovocytes.</li>
		<li>Pour membrane protéines nécessitant plusieurs sous-unités (c.-à-d., les récepteurs de GABAA α1β2γ2 hétéromérique), mélangez l’ADNc du ratio désiré ARNm correspondants (p. ex., 1:1:1 ou 1 / 10:1).</li>
		<li>Maintenir l’ovocyte à 17 ° C pour empêcher l’expression des protéines de choc thermique par les ovocytes ; stocker la microplaque dans un espace de rangement thermo-contrôlée.</li>
		<li>Dissoudre les composés d’essai qui ont été testés positifs dans le test de liaison chez OR2 à 0,1 – 1 000 µM pour les enregistrements électrophysiologiques et les éliminer dans une plaque en polypropylène à fond plat de 96 puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmides pour l’expression
	<ol>
<li>Suivre les notices des kits disponibles dans le commerce pour la synthèse de l’ARNm avec des promoteurs T7 ou T6 bactériennes et faire 20 µL d’une solution à 0,2 µg/µL en eau exempte de RNase.</li>
		<li>Préparer au moins 20 µL d’une solution contenant un vecteur d’expression eucaryote pour l’expression de la cDNA, généralement à 0,2 µg/µL, dissous dans l’eau Watercooling.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection dans l’ovocyte et la visualisation de sa qualité
	<ol>
<li>Injecter 10 à 50 nL de la solution contenant le plasmide (voir étape 2.3.1 ou 2.3.2) à l’aide d’une aiguille de la micro-injection de verre avec un diamètre allant jusqu'à 100 µm monté sur un micromanipulateur équipé d’un système d’éjection de pression ou avec un système à injection automatisée. Remarque : Dans l’exemple abordé ici, les ovocytes sont injectées par lots de 95 avec un système automatisé conçu pour fonctionner avec les ADNc ou ADN messagère.</li>
		<li>Remplir l’aiguille d’injection de 1 µL d’un colorant comme le bleu de méthylène à 1 % et injecter les ovocytes à l’aide de la procédure standard (que ce soit dans le noyau de cDNA ou dans le cytoplasme de l’ARNm).</li>
		<li>Disposer les ovocytes injectés pendant environ 1 min dans l’eau bouillante. Couper les ovocytes en deux avec une lame de rasoir sous les jumelles. Remarque : Le colorant soit localisé, comme illustré à la Figure 3E, ce qui permet une observation précise de l’injection.</li>
	</ol></li>
	<li>Enregistrements de deux électrodes de voltage clamp
	<ol>
<li>Placer la plaque bien contenant les ovocytes sur l’automatisme, qui utilise le principe illustré à la Figure 4. Remarque : À la différence du système à pince patch illustré à la Figure 5, le potentiel vrai de membrane de la cellule est lu par l’électrode tension.</li>
		<li>Programmer le système d’enregistrement automatisé à l’aide de l’interface à base d’icônes avec, par exemple, le schéma illustré à la Figure 6 pour la détermination de la relation de l’activité de concentration.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajustement de courbe
	<ol>
<li>Analyser les résultats en utilisant le logiciel approprié, à l’aide de la courbe d’activation concentration illustré, tracer l’amplitude du courant en fonction du logarithme de la concentration d’agoniste.</li>
		<li>Vous pouvez observer la courbe sigmoïde qui peut être équipée ultérieurement l’équation empirique de la colline sous la forme : <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Ici, Y= la fraction du courant évoqué, EC 50 = la concentration pour une activation de 50 %, x = la concentration du composé, nH = le coefficient de Hill ou la coopérativité apparente.</li>
		<li>Normaliser les courants à une unité en divisant l’amplitude de chaque réponse par rapport à la valeur enregistrée la plus forte concentration d’analyser les données obtenues à partir d’une série de cellules.</li>
		<li>Déterminer la moyenne et les écarts-types et se rendre compte de l’ajustement de la courbe à l’aide de logiciels disponibles de façon standard.</li>
	</ol></li>
</ol>3. électrophysiologiques enregistrements dans des tranches de cerveau
NOTE : Les tranches d’hippocampe de rat sont préparés conformément aux directives nationales et institutionnelles.
<ol><li>
Préparation de tranches de l’hippocampe
	<ol>
<li>Préparer la dissection artificiel céphalo-rachidien (dACSF) avec 124 mM 124 de NaCl, KCl 2,5 mM, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM de glucose et 4 mM saccharose, gazé dans la bouteille avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2.</li>
		<li>Préparer l’enregistrement artificiel céphalo-rachidien (rACSF) avec 124 mM NaCl, KCl 5 mM, 1.25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3et 10 mM de glucose gazés dans la bouteille avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2.</li>
		<li>Anesthésier les rats à l’aide d’un mélange de 2,5 % isoflurane et de l’oxygène pur et les décapiter.</li>
		<li>Couper le cuir chevelu, suit la ligne médiane avec une belle paire de ciseaux. Couper le crâne le long de la ligne médiane sans endommager les tissus sous-jacents. Retirez le crâne avec des pincettes et utilisez une spatule fine pour évider le cerveau.</li>
		<li>Placer le cerveau dans la solution de dACSF gazés à RT et disséquer la formation hippocampique gauche avec une spatule fine.</li>
		<li>Couper en tranches transversales (400 µm d’épaisseur) de la partie moyenne de l’hippocampe avec un hachoir de tissus et de les transférer à la chambre d’enregistrement à l’aide d’une brosse de peinture. Maintenir les tranches à ta pendant 45 min.</li>
		<li>Perfuse les tranches avec le rACSF gazé à 35 ° C et à un taux de 1,5 mL/min. de la bulle la solution avec un mélange de 95 % O2 et de 5 % de CO2. NOTE : Après cette étape, les tranches sont prêtes pour les expériences électrophysiologiques.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enregistrement de spike seule population
	<ol>
<li>Déposer une tranche de cerveau dans la chambre de microscope-monté.</li>
		<li>Perfuse la tranche à raison de 3 mL/min avec rACSF.</li>
		<li>Tirez une micropipette de verre borosilicaté avec l’extracteur de pipette ayant une résistance de ~ 2 MΩ. Remarque : Cette micropipette est utilisée comme une électrode d’enregistrement et est électriquement raccordée à l’amplificateur.</li>
		<li>Remplissez la micropipette avec une solution contenant 2 M NaCl et placez-le dans le porte-pipette de l’amplificateur.</li>
		<li>Position la micropipette d’enregistrement dans la strate pyramidale dans la région CA1 de l’hippocampe tranche en utilisant le micromanipulateur droit. Remarque : L’emplacement est schématiquement représenté à la Figure 7.</li>
		<li>Placez une électrode bipolaire isolé de platine/iridium dans la porte sur la gauche micromanipulateur. Remarque : Cette électrode est utilisée comme l’électrode de stimulation et est reliée électriquement au générateur de stimulus.</li>
		<li>Positionner l’électrode de stimulation dans les collatérales de Schaffer dans la région CA1 de l’hippocampe tranche en utilisant le micromanipulateur droit. Remarque : L’emplacement est schématiquement représenté à la Figure 7.</li>
		<li>Fournir une impulsion de courant à l’électrode de stimulation à l’aide du générateur d’impulsion toutes les 30 s (durées de 100 µs, à partir de 10 µA) et d’augmenter progressivement l’intensité de stimulation jusqu'à ce qu’apparaisse un pic de population (PS).</li>
		<li>Régler la puissance de stimulation pour évoquer un PS correspondant à 45 % de l’amplitude maximale qui peut être obtenue. PSs sont filtrés à 2,4 KHz et numérisés à 20 KHz à l’aide de l’amplificateur de signal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inhibition d’impulsions pairées
	<ol>
<li>Préparer les tranches de cerveau (étape 3.1) et procédez comme décrit précédemment (pas 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Fournir deux impulsions de courant (100 µs durées à un intervalle de 20 ms) à l’électrode de stimulation, toutes les 30 s en utilisant le générateur d’impulsion. Régler l’intensité de stimulation pour évoquer un PS correspondant à 45 % de l’amplitude maximale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Composé de tests
	<ol>
<li>Préparer des dilutions des composés qui seront essayés dans le FSCA gazé afin que la concentration finale de DMSO non supérieure à 0,1 %.</li>
		<li>Ajouter DMSO à la solution de contrôle à la même concentration que dans le composé en solution.</li>
		<li>Enregistrer un single (étape 3.2) ou un jumelé-pulse (étape 3.3) ch évoquée par les stimulations collatérales de Schaffer toutes les 30 s pendant au moins 30 min. La forme du PS doit être stable pendant cette période de référence.</li>
		<li>Préparer un bécher avec gazés rACSF contenant une concentration fixe de la substance à tester.</li>
		<li>Perfuse l’hippocampe tranche avec cette solution alors qu’il enregistrait encore le PS seul ou impulsions pairées.</li>
		<li>Évaluer la récupération de l’effet composé en perfusant la tranche de pain avec rACSF gazé sans le composé. Remarque : Pour les effets réversibles, le PS revient à sa forme initiale observée au cours de la période de base avant l’application de composés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse des données
	<ol>
<li>Moyenne les traces du PS enregistrement au cours de l’expérience dans des blocs de 4 en utilisant le logiciel d’analyse de données.</li>
		<li>Mesurer les amplitudes PS des traces en moyenne.</li>
		<li>Normaliser les amplitudes en pourcentage des valeurs de base enregistrées 10 min avant la perfusion d’un composé.</li>
		<li>Exprimer les données en moyenne ± SEM</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+classical+benzodiazepines%3A+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li>
<li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7568326">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19090692">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li>
<li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li>
<li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7516126">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li>
<li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinities%2C+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists%2C+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li>
<li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li>
<li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18936916">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li>
<li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor-mediated+neurotransmission%3A+Not+so+simple+after+all%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li>
<li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li>
<li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23308109">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323(2013).</li>
<li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li>
<li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11282419">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li>
<li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+channels%3A+from+subunits+to+functional+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li>
<li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li>
<li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).</li>
<li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li>
<li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="https://dokupdf.com/download/isoflurane-slows-inactivation-kinetics-of-rat-recombinant-122l-gabaa-receptors-enhancement-of-gabaergic-transmission-despite-an-open-channel-block-_5a034a51d64ab2b9bdf8bbd0_pdf">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li>
<li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17(2004).</li>
</ol>

Les auteurs Frédéric Knoflach et Maria-Clemencia Hernandez sont des employés de F. Hoffmann-La Roche AG, Bâle, 4070, une société pharmaceutique. L’auteur Daniel Bertrand est un employé de HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genève (Suisse), la fourniture d’installations de criblage aux compagnies pharmaceutiques.

Le développement de nouveaux composés actifs à un canal d’ion de ligand-dépendants tels que les récepteurs GABAA nécessite l’utilisation d’approches multiples. En règle générale, la première étape est souvent réalisée à l’aide d’essais de liaison ; Toutefois, ces mesures ne suffisent pas à caractériser l’activité physiologique de l’enceinte ou sa pharmacologie précis. En particulier, un composé qui se lie à un récepteur peut améliorer ou inhiber sa fonction ou même ne produire aucun effet fonctionnel (se taire) (c.-à-d., liaison au récepteur sans modifier sa fonction). Ainsi, un test fonctionnel est nécessaire pour une caractérisation complète composée.
Tests de liaison: Le principal avantage de l’essai de liaison est qu’il peut être mené efficacement sur un grand nombre d’échantillons allant jusqu'à plusieurs milliers, et qu’elle fournit les affinités de liaison pour les molécules actives. Tel que décrit ci-dessus, la première étape consiste à établir une méthode pour l’évaluation des sous-types de récepteurs désirée. Nommément, tandis que la liaison peut être effectuée sur des récepteurs natifs de fractions ou de cerveau entier, une telle méthode permettra d’éviter la détermination des affinités aux sous-types de récepteurs spécifiques. Par conséquent, il est nécessaire d’utiliser des systèmes recombinantes à des molécules de l’écran à la cible souhaitée. De nos jours, une transfection transitoire ou stable des ADNc sous-unité récepteur désiré dans les lignées cellulaires propose une méthode efficace et fiable pour exprimer les sous-types de récepteurs d’intérêt (p. ex., GABAA α5β3γ2). Liaison traditionnelle faire des essais sur l’utilisation de radioligands, mais de nos jours, les techniques sont disponibles qui éviter l’inconvénient de manipulation radioactivité (p. ex., quantitatifs basés sur la fluorescence ligands).
Expression fonctionnelle dans un système hôte : Pour exprimer les gènes dans un système hôte, la séquence codante d’intérêt doit être insérée dans un plasmide contenant les promoteurs adéquates. En général, pour in vitro le synthèse des ARNm, les promoteurs T7 ou T6 bactériennes sont utilisés. Pour une expression de cDNA, la transcription du gène d’intérêt doit être réglementée par un promoteur eucaryote comme CMV (cytomégalovirus) ou l’équivalent. De nos jours, plusieurs plasmides, y compris les deux promoteurs(p. ex., pUNIV, CMVp-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), sont disponibles permettant une synthèse in vitro des ARNm ou une expression de cDNA, comme illustré à la Figure 15. Obtient une expression des récepteurs GABAA peut être fidèlement dans des lignées cellulaires ou dans des ovocytes de Xenopus . Les principaux avantages de ce dernier sont l’absence d’une expression de récepteurs endogènes, la simplicité des manipulations et la disponibilité d’un système automatisé pour micro-les injections et les enregistrements. Les procédures décrites dans le présent protocole illustrent l’efficacité de l’automatisme, qui permet l’injection de 96 ovocytes en 7 min et ne nécessite aucune connaissance en micromanipulation. Se souvenant qu’un seul ovaire d’une Xenopus contienne entre 10 000-30 000 ovocytes, il est clair qu’un grand nombre de mesures de la cellule peut être effectué sur une seule préparation. En outre, comme une expression peut être effectuée en utilisant des injections de l’ARNC, les mêmes plasmides contenant les gènes d’intérêt qui sont développés pour les expériences de liaison peuvent être utilisés pour une caractérisation fonctionnelle sans devoir encore la biologie moléculaire manipulations.
Compte tenu de sa grande taille et haute expression superficielle, un seul ovocyte donne un nombre de récepteurs qui correspond approximativement aux cellules confluentes dans une boîte de Pétri de 35 mm. Cependant, une préparation des ovocytes et injection représente une fraction du coût d’une lignée de cellules, comme les expériences ne nécessitent pas un milieu de culture spécifique et manipulations stériles. L’activation d’un seul canal de GABAA donne quelques picoamperes (10-12) et des courants allant jusqu'à des dizaines de microampère (10-6) sont facilement enregistrées dans un seul ovocyte, qui confirme l’activité concomitante de plusieurs millions de récepteurs au cours d’une seule réponse.
Une première étape dans la caractérisation des canaux ioniques ligand-dépendants est souvent la détermination de l’affinité apparente des récepteurs. Les expériences qui doivent être réalisée consistant en appliquant une série d’impulsions d’essai bref agoniste et l’amplitude de l’évoqués actuel ou, dans certains cas, l’aire sous la courbe (AUC) en fonction du logarithme de la concentration d’agoniste de traçage. Comme il est facilement possible de microinject des concentrations différentes de plasmide et ratio dans le même lot d’ovocytes, ce système d’expression est particulièrement approprié pour une telle qualification. En outre, une comparaison de lot a révélé un degré élevé de stabilité des différents EC50s. L’influence de la composition de la sous-unité sur l’affinité apparente du récepteur est facilement visualisé à l’aide d’un complot de l’araignée, comme illustré à la Figure 10.
Les résultats de la pince de tension deux électrodes obtenus dans des ovocytes de Xenopus sont souvent comparés avec les enregistrements réalisés à l’aide d’électrodes de patch clamp. Considérant qu’il irait au-delà de la portée de ce travail d’entrer dans une comparaison détaillée entre ces deux systèmes, quelques points peuvent être examiné. Même si un patch clamp de cellules offre des avantages pour une caractérisation biophysique avec une demande de drogue rapide, ses exigences sont plus complexes que celles des enregistrements deux électrodes dans des ovocytes de Xenopus . Une difficulté première et non négligeable est l’expression d’une protéine donnée avec la nécessité d’une culture de cellules, une transitoire ou transfection stable et l’identification des cellules qui expriment la construction désirée. En outre, il est indispensable d’examiner la contribution possible de l’expression endogène dans la cellule considérée. En outre, un enregistrement de patch clamp exige qu’une personne qualifiée mener la micromanipulation sous un microscope à fort grossissement, alors que cette personne doit aussi effectuer une analyse adéquate pendant l’expérience pour évaluer, par exemple, la qualité du joint, la résistance d’accès etc. , en revanche, une pince de tension deux électrodes d’enregistrement, en particulier un à l’aide d’un système automatisé électrophysiologique, ne nécessite aucune compétence spécifique et peut être effectuée par des techniciens de laboratoire.
Lors de l’acquisition d’un set-up électrophysiologique, considération de coût est certainement un facteur important qui doit être soigneusement analysée. Par exemple, alors que le coût d’un système automatisé est relativement élevé, une comparaison plus étroite révèle que l’installation d’une plate-forme complète d’électrophysiologique comprend l’achat d’équipement tels que des micromanipulateurs bonnes, une lentille binoculaire, un amplificateur, une perfusion système et une table antivibratoire, tout en acquisition de données et en effectuant une analyse. Une comparaison des coûts entre un deux électrodes de voltage clamp Set-up contre un set-up de la pince patch révèle des écarts encore plus loin. En outre, le système automatisé offre l’avantage d’un équipement entièrement automatisé et fonctionne sans surveillance jour et nuit.
Les propriétés pharmacologiques d’un composé sont déterminées par son mode d’action au niveau du récepteur. Par exemple, des inhibiteurs compétitifs sont des molécules qui peuvent entrer dans la même poche de liaison, ou le site orthosteric, que l’agoniste elle-même provoque une compétition. Inhibiteurs non compétitifs sont des composés qui inhibent les récepteurs en interagissant sur un autre site et, dans le cas d’un canal de ligand-gated ion, qui peuvent entrer et bloquer le pore ionique, par exemple. Il irait au-delà de la portée de ce travail afin d’examiner les différents mécanismes d’interaction, mais des informations complémentaires peuvent être obtenues d’un manuel pharmacologique et/ou d’autres travaux tels que Bertrand et Bertrand22.
Dans le cas de MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES, le composé lie à un site qui se distingue de la site d’orthosteric, mais la présence de la molécule modifie la barrière d’énergie entre les États de l’actifs et d’autres. MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs (PAMs) sont des composés qui réduisent la barrière d’énergie de la mise au repos à l’état actif et, par conséquent, augmentent l’effet de l’agoniste. Afin de caractériser les effets possibles de PAM, il faut, par conséquent déterminer si une exposition à la substance améliore la réponse à l’agoniste et, si oui, à quelle concentration. Les expériences présentées dans la Figure 11 et Figure 14 illustrent les protocoles qui peuvent être utilisés avec succès pour la caractérisation des PAMs les récepteurs GABAA .
Dans certains cas, l’exposition à la PAM seule pourrait suffire à activer les récepteurs. Cette activité peut être déterminée par une légère modification du protocole expérimental présenté ici. À savoir, au lieu d’utiliser une application conjointe du modulateur lors de l’exposition à la GABA, le protocole peut être modifié pour l’application du premier composé seul, puis en présence de la GABA. Une caractérisation de l’activité agoniste direct se fera par la détermination de l’amplitude de la réponse évoquée par le camp lui-même et par rapport au courant induite par le GABA.
Des expériences réalisées dans des tranches de cerveau, comme illustré à la Figure 7, sont utilisés pour confirmer l’activité composée au niveau des récepteurs natifs dans un circuit inhibiteur définitif avant d’aller plus loin dans des modèles animaux et le long de la voie vers des essais cliniques. Le protocole d’enregistrement et d’analyse de données relativement simple permet le classement des composés multiples en évaluant leur effet modulatrice différentiel sur l’amplitude du PS. Effets non spécifiques des composés qui ne sont pas liées au système GABA peuvent également être détecté (par exemple, lorsqu’on observe des changements dans la forme de PS). Direct, neurotransmission GABAergique peut être évaluée dans ces cas en mesurant les effets des composés sur des courants postsynaptiques inhibitrices (CISP) à l’aide de la cellule entière patch clamp technique8.

Nous présentons ici les protocoles pour la découverte de composés actifs au niveau des récepteurs GABAA , de la liaison à la physiologie et de pharmacologie. Dans la recherche de nouvelles molécules spécifiques des récepteurs GABAA , il est crucial de définir, aussi précisément que possible, le sous-type d’intérêt et de l’évaluation de la spécificité des composés nouvellement identifiés (par exemple, pour un compte-rendu, voir Rudolph et Knoflach1ou Sieghart2). Chemin d’accès standard dans la découverte et les mesures qui doivent être atteints sont illustrées à la Figure 1.
Essais de liaison ont été et sont encore largement utilisés comme la première étape dans la découverte de médicaments. Dans le cas des récepteurs GABAA , ils sont optimisés afin d’identifier les composés qui se lient à l’accepteur benzodiazépine du récepteur où lient thérapeutiquement utiles et sécuritaire des médicaments. Autres techniques, utilisant fluorimétrique imagerie plaque lecteur (FLIPR) membrane potentiels des essais teintée rouge3, détectent des composés comme les barbituriques qui se lient à des sites supplémentaires qui sont moins souhaitables en raison de leur profil d’effets secondaires indésirable. En outre, les colorants utilisés peuvent activer directement les récepteurs GABAA , questionnant ainsi l’utilité de ces essais pour la drogue découverte4. Tests de liaison ne peut fournir la preuve qu’une substance donnée peut se lier à une classe de récepteurs spécifiques. In vitro essais avec les membranes cellulaires sont utilisés pour identifier les sélectifs humaines ligands des récepteurs GABAA α5β3γ2. Les cellules HEK293 transitoirement transfectées exprimant l’humain GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 et α3β3γ2 récepteurs servent à préparer des membranes de ces tests. L’effet des ligands est détectée en mesurant la scintillation de flumazénil [3H] lié aux récepteurs membranaires (une inhibition de la liaison de flumazénil [3H]). Le principal avantage de cette technique est qu’une décision rapide et efficace de l’affinité de liaison composé au récepteur d’intérêt est fournie au récepteur d’intérêt.
Des études fonctionnelles sont essentiels pour évaluer l’activité fonctionnelle des composés et de proposer une explication physiologique et pharmacologique des mécanismes causée par la liaison des composés aux récepteurs. Aujourd'hui, c’est bien connu que les récepteurs GABAA fonctionnels résultent de l’assemblage de cinq sous-unités autour d’un axe de pseudosymmetry formé par le pore ionique et le résultat de l’assemblage de cinq sous-unités identiques. La plupart des récepteurs GABAA est composée de deux ou plusieurs sous-unités différentes. Le récepteur GABAA majeur du cerveau, par exemple, se compose des sous-unités α1, β2 et γ2 dans une stoechiométrie de 2, 2 et 1 respectivement5,6. Une reconstitution dans un système hôte tels que les ovocytes de Xenopus laevis ou cellules HEK293 offre la possibilité de découvrir rapidement les propriétés pharmacologiques des récepteurs.
Les propriétés pharmacologiques des composés sont ensuite explorées avec des enregistrements extracellulaires de tranches de cerveau7. Cette méthode permet une exploration de l’effet des composés sur la neurotransmission et fournit un moyen efficace pour confirmer les effets fonctionnels des composés déterminés dans des systèmes d’expression hétérologue au niveau des récepteurs natifs dans l’ensemble environnement neuronal. Neurotransmission GABAergique peut aussi être évaluée au niveau moléculaire en mesurant les effets des composés courants postsynaptiques inhibitrice (CISP)8. Mais le protocole utilisé ici et basées sur des enregistrements de serrage patch germes entiers dans des tranches de cerveau est plus élaboré et conduit à un débit inférieur.
Enfin, les forces et les faiblesses de l' in vitro screening cascade utilisé pour l’identification de ligands sélectifs α5β3γ2 sont examinées dans la perspective des différentes techniques et leurs limites intrinsèques. Ce travail devrait fournir des experts et non experts dans le domaine des récepteurs GABAA un examen utile de l’ensemble des différentes in vitro des approches permettant de s’attaquer à la découverte de nouveaux modulateurs de ces canaux ligand-gated ion.

<table><tbody><tr><td>General equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well cell harvester -(Filtermate 196)&nbsp ;</td><td>Packard</td><td></td><td>Pour filtrer les membranes avec radioligand lié</td></tr><tr><td>Compteur à scintillation liquide à plaque de microtitration (Top Count NXT)</td><td>Compteur à scintillation et luminescence à microplaques</td> <td>Packard</td><td></td></tr><tr><td>Compteur à scintillation liquide (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Compteur à scintillation et luminescence</td> <td>Packard</td><td></td> Vial</tr><tr><td>Manipulateur de liquide (Biomek 2000)</td><td>Soc</td><td></td> <td>BeckmanPour préparer des dilutions de composés</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>Pour mélanger des solutions mères de composés</td></tr><tr><td>Homogénéisateur de tissus (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>Pour remettre en suspension les préparations membranaires</td></tr><tr><td>Logiciel XLfit5</td><td>Microsoft Excel &nbsp ; add-on par IDBS Logiciel d’ajustement</td><td></td> de <td>courbe</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix-Extracteur</td><td></td> <td>d’électrodes</td></tr><tr><td>RoboInject</td> Systèmes <td>multicanaux-Injection</td><td></td> <td>automatisée (ovocytes de xénope)</td></tr><tr><td>Systèmes multicanaux</td> <td>HiClamp-Pince</td> <td>de tension automatisée (Xenopus Ooocytes)</td><td></td></tr><tr><td>DataMining</td><td>MultiChannel Systems-Data</td><td></td><td> Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel</td> <td>Systems-Logiciel</td> <td>de traitement des données</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Dispositifs</td><td></td> moléculaires <td>Système d’acquisition de données à faible bruit</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 ou équivalent</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programmable Signal Conditioner</td></tr><tr><td>pClamp suite de programmes Dispositifs</td><td>moléculaires Logiciel</td><td></td><td>pour l’acquisition et l’analyse de données logiciel</td></tr><tr><td>Table antivibraton&nbsp ;</td><td>TMC</td><td></td><td>Pour éviter les vibrations des microélectrodes&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micromanipulateurs Patchstar</td><td>Scientifica</td><td></td><td>Pour positionner avec précision les microélectrodes dans les tranches de cerveau, Cage de</td></tr><tr><td>Faraday&nbsp ;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Pour isoler les enregistrements du bruit</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&nbsp ;</td><td></td><td>Pour préparer des tranches de cerveau</td></tr><tr><td>Micropipette en verre borosilicate&nbsp ;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>Pour enregistrer les potentiels extracellulaires dans les tranches de cerveau</td></tr><tr><td>Paire torsadée, fils de platine et d’iridium Électrode de stimulation</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Pour stimuler les tranches de cerveau avec du courant</td></tr><tr><td>Générateur de stimulus pour la stimulation entraînée par le courant et la tension</td><td>Systèmes multicanaux</td><td>STG4000</td><td>Fournit le courant à l’électrode de stimulation</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque de microtitration à fond rond</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>Utilisé pour le test de liaison</td></tr><tr><td>GF/C à fond de filtre en fibre de verre à 96 puits microplaque avec 1.2 &micro ; m poresize, pour des tests de prélèvement cellulaire à l’aide d’un collecteur sous vide.</td><td>Packard&nbsp ;</td><td>#6005174</td><td>utilisé pour le dosage de liaison</td></tr><tr><td>50 mL Tubes</td><td>Falcon&nbsp ;</td><td>#352070</td><td>utilisé pour le test de liaison</td></tr><tr><td>Tubes Safe-lock 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>utilisé pour le test de liaison</td></tr><tr><td>Tubes Safe-lock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>utilisé pour le test de liaison</td></tr><tr><td>Tubes d’expédition 180 mL&nbsp ;</td><td>Semadeni Europe AG&nbsp ;</td><td>#3722</td><td>utilisé pour le test de liaison</td></tr><tr><td>Flacon de poney Polyéthylène 6 mL&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer&nbsp ;</td><td>#6013329</td><td>utilisé pour le test de liaison</td></tr><tr><td>Top Seal&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer&nbsp ;</td><td>#60051859</td><td>utilisé pour le dosage de liaison</td></tr><tr><td>Fiole tournante</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Fiole tournante</td></tr><tr><td>96&nbsp ; Plaque de puits (conique)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Plaque d’injection pour les ovocytes</td></tr><tr><td>96&nbsp ; Plaque de puits (fond plat)</td><td>Corning (Vitaris Switzerland)</td><td>3364-cor</td><td>Plaque composée pour le capillaire en verre HiClamp</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Hilgenberg (Allemagne)</td><td>-</td><td>verre borosilicaté 1,2 D.E. 0,76 D.I. avec</td></tr> <tr><td>filament<fort>préparation de l’ARN</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>pour la synthèse in vitro</td></tr> Produits <tr><td>chimiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de dosage : KCl 5 mM ; CaCl2 1,25 mM ; MgCl2 1,25 mM ; NaCl 120 mM ; Tris 15 mM Ajustement du pH avec HCl à 7,4 ; conserver jusqu’à 3 mois à 4 °C.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage : Tris 50 mM -HCl pH 7,4 ; stocker à 4 &deg ;C.</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour l’essai de liaison</td></tr> Solution <tr><td>mère des composés d’essai 10 mM dans le DMSO</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour l’essai de liaison</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM dans le DMSO</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour l’essai de liaison</td></tr><tr><td>Diazépam 4 mM dans le DMSO</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour l’essai de liaison</td></tr><tr><td>[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol dans l’éthanol ; stocker à -20 &deg ; C</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour le test de liaison</td></tr><tr><td>Microscint 40&nbsp ;</td><td>Packard&nbsp ;</td><td>#6013641</td><td>Utilisé pour le dosage de liaison</td></tr><tr><td>Ultima Gold&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer&nbsp ;</td><td>#6013329</td><td>Utilisé pour le test</td></tr><tr><td>de liaison MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma Sigma</td><td># A5955</td><td>antibiotiques / antimycosiques</td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Sigma Sigma</td><td># C1030</td><td>Collagénase Type I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma Sigma</td><td># R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen Qiagen</td><td># 12362</td><td></td></tr><tr><td>Sels pour liquide céphalo-rachidien artificiel (NaCl, KCl, etc.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Préparations membranaires congelées à partir de HEK293 transitoires ou transfectés de manière stable surexprimant différents sous-types de récepteurs GABAA humains : &alpha ; 1&bêta ; 3&gamma ; 2, &alpha ; 2&bêta ; 3&gamma ; 2, &alpha ; 3&bêta ; 3&gamma ; 2, &alpha ; 5&bêta ; 3&gamma ;2. Voir Ballard et al. 2009 pour des méthodes détaillées.</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour le dosage de liaison</td></tr></tbody></table>

méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide gamma - aminobutyrique tapez une neurotransmission

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Cette présente manuscrit un protocole étape par étape pour le dépistage des composés à gamma-aminobutyrique acide type un récepteurs (GABA-A) et son utilisation vers l’identification de nouvelles molécules actives dans les essais précliniques d’une recombinaison in vitro récepteur à leurs effets pharmacologiques au niveau des récepteurs indigènes dans des tranches de cerveau de rongeurs. Pour les composés obligatoire sur le site de benzodiazépine du récepteur, la première étape consiste à mettre en place un écran primaire qui consiste à développer des radioligands essais de liaison sur les membranes cellulaires exprimant les principaux sous-types de GABAA . Puis, profitant de l’expression hétérologue des récepteurs de GABAA rongeurs et humains dans les ovocytes de Xenopus laevis ou cellules HEK 293, il est possible d’explorer, dans des tests électrophysiologiques, les propriétés physiologiques des différents récepteurs sous-types et les propriétés pharmacologiques des composés identifiés. Le système d’ovocytes Xenopus est présenté ici, commencer par isoler les ovocytes et leur microinjection avec différents ARNm, jusqu'à la caractérisation pharmacologique à l’aide de pinces de tension de deux électrodes. Enfin, enregistrements effectués dans des tranches de cerveau rongeurs seront décrites qui sont utilisés comme un test physiologique secondaire pour évaluer l’activité de molécules à leurs récepteurs natifs dans un circuit neuronal bien défini. Enregistrements extracellulaires en utilisant les réactions des populations de neurones multiples sont démontrés avec la demande de drogues.

Nous présentons ici les protocoles visant à découvrir des composés actifs au niveau des récepteurs GABAA , de la liaison à la physiologie et de pharmacologie.

Méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide Gamma - aminobutyrique tapez une Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

L’objectif général de cette vidéo est d’illustrer une cascade de criblage qui permet la découverte de nouveaux ligands du récepteur GABA-A. L’avantage d’utiliser la liaison aux radioligands, l’enregistrement électrophysiologique dans les ovocytes de xénope et dans les tranches de cerveau de rongeur de manière littérative est que le profil du composé peut être amélioré. En fin de compte, des sous-types puissants, des composés sélectifs et efficaces sont identifiés.Cette démonstration sera réalisée par Kumico Kambara et Jenna Tognaccini ainsi que par Sonia et Daniel Bertrand de HiQScreen et Marie Claire Pflimlin de Roche. Injecter 10 à 50 nanolitres de la solution contenant le plasmide à l’aide d’une aiguille de micro-injection en verre dont le diamètre de la pointe peut aller jusqu’à 100 micromètres montée sur un micromanipulateur équipé d’un système d’éjection par pression ou d’un système d’injection automatisé. Pour commencer cette procédure, maintenez les ovocytes à 17 degrés Celsius pour éviter l’expression de protéines de choc thermique.Stockez la microplaque dans une zone de stockage à température contrôlée. Ensuite, dissoudre les composés d’essai, qui ont été testés positifs dans le test de liaison dans OR2, à 0,1 et 1000 micromolaires pour les enregistrements électrophysiologiques et les disposer dans une plaque de polypropylène à fond plat de 96 puits. Pour effectuer l’enregistrement de la tension de deux électrodes, placez une plaque contenant les ovocytes sur le système automatisé.Programmez le système d’enregistrement automatisé à l’aide de l’interface basée sur des icônes avec ce schéma pour la détermination appropriée de la relation concentration-activité. Pour l’ajustement de courbe, à l’aide de la courbe d’activation de la concentration illustrée, tracez l’amplitude actuelle en fonction du logarithme de la concentration de l’agoniste. Pour l’enregistrement électrophysiologique, conservez le cerveau dans une solution dACSF remplie de carbogène à température ambiante.Ensuite, disséquez la formation de l’hippocampe gauche à l’aide d’une spatule fine. Par la suite, sectionnez des lames transversales de 400 micromètres d’épaisseur à partir de la partie médiane de l’hippocampe à l’aide d’un hachoir à tissus. À l’aide d’un pinceau, transférez les tranches dans la chambre d’enregistrement et maintenez-les à température ambiante pendant 45 minutes.Ensuite, perfuser les tranches avec du rACSF bouillonné avec du carbogen à 35 degrés Celsius et à un taux de 1,5 millilitre par minute. Pour enregistrer un pic de population unique, placez une tranche de cerveau dans la chambre montée sur le microscope. Perfuser la tranche avec rACSF à raison de trois millilitres par minute.À l’aide de l’extracteur de pipette, tirez une micropipette en verre borosilicate d’une résistance d’environ deux mégaohms. Remplissez la micropipette avec une solution contenant deux molaires de chlorure de sodium et placez-la dans le porte-pipette. Positionnez la micropipette enregistreuse dans la couche pyramidale dans la région CA1 de la tranche d’hippocampe à l’aide du micromanipulateur droit.Ensuite, placez une électrode bipolaire isolée en platine iridium dans le support du micromanipulateur gauche. Positionnez l’électrode de stimulation dans les collatéraux de Schaffer dans la région CA1 de la tranche d’hippocampe à l’aide du micromanipulateur gauche. À l’aide du générateur de stimulus, délivrez une impulsion de courant à l’électrode de stimulation toutes les 30 secondes et augmentez progressivement la force de stimulation jusqu’à ce qu’un pic de population apparaisse.Ajustez l’intensité du stimulus pour évoquer un pic de population correspondant à 45 % de l’amplitude maximale pouvant être obtenue. Pour effectuer une inhibition d’impulsion appariée, délivrez deux impulsions de courant à l’électrode de stimulation toutes les 30 secondes à l’aide du générateur de stimulus. Réglez l’intensité du stimulus pour qu’il évoque un pic de population correspondant à 45 % de l’amplitude maximale.Pour tester les composés, il faut procéder à des dilutions des composés à tester dans l’ACSF de manière à ce que la concentration finale de DMSO ne soit pas supérieure à 0,1 %. Ajoutez du DMSO à la solution témoin à la même concentration que celle contenue dans la solution composée. Enregistrez un pic de population d’impulsions unique ou apparié évoqué par les stimulations collatérales de Schaffer toutes les 30 secondes pendant au moins 30 minutes. La forme du pic de population devrait être stable au cours de cette période de référence.Ensuite, préparez un bécher avec du rACSF carbogéné contenant une concentration fixe du composé à tester et perfuser la tranche d’hippocampe avec la solution lors de l’enregistrement des pics de population d’impulsions simples ou appariées. Évaluez également la récupération de l’effet composé en perfusant la tranche avec du rACSF carbogéné sans le composé. Voici une représentation schématique d’une tranche d’hippocampe de rat, les collatéraux de Schaffer provenant des axones des cellules pyramidales CA3 se projetant sur l’arborisation dendritique des neurones pyramidaux CA1.Des micropipettes ont été placées dans la couche pyramidale pour enregistrer les pics de population et dans la couche radiale pour les enregistrements dendritiques des potentiels postsynaptiques excitateurs de champ. L’électrode de stimulation a été placée à l’intérieur des collatéraux de Schaffer. Cette figure montre les pics de population évoqués par les stimuli appariés appliqués à travers la même électrode de stimulation à un intervalle de 20 millisecondes.La réponse de la population au deuxième stimulus est de plus petite amplitude que celle de la réponse au premier stimulus. Des pics de population ont été enregistrés en l’absence et en présence de bêta CCM, un NAM non sélectif du récepteur GABA A. Beta CCM a augmenté l’amplitude du deuxième pic de population en bloquant partiellement toute inhibition gabaergique par anticipation.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la pharmacocinétique, l’occupation et l’efficacité des récepteurs in vivo et la pharmacologie de sécurité peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le potentiel de développement clinique des composés identifiés.

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Dans cet article, nous décrivons une méthode utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les neurones du cerveau tranches isolés de manière aiguë. Ce procédé implique l'utilisation d'une micropipette remplie de médicament pour application locale de médicaments à des neurones enregistrés à l'aide des techniques classiques de patch-clamp.

Application locale de médicaments pour l&#39;étude des fonctions récepteur de l&#39;acétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris

Ici, nous démontrons l'utilisation de colorant fluorescent Alexa couplé à α-bungarotoxine à mesurer récepteur GABA A de localisation à la surface et l'endocytose dans les neurones de l'hippocampe. Grâce à l'utilisation de constructions portant une étiquette extracellulaire qui se lie à court α-bungarotoxine, l'analyse de la membrane plasmique protéine endocytose trafic peut être atteint.

L&#39;utilisation d&#39;un α-bungarotoxine Reliure Tag du site à étudier récepteur GABA A membrane localisation et le trafic

Les mécanismes moléculaires qui coordonnent la formation des synapses GABAergiques inhibiteurs cours de l'ontogenèse sont largement inconnus. Pour étudier ces processus, nous avons développé un système de modèle de co-culture qui intègre les neurones GABAergiques épineux moyen embryonnaires cultivées avec transfectées de façon stable rein embryonnaire humain 293 (HEK293) des cellules exprimant des récepteurs GABA fonctionnels A.

Inhibiteur formation des synapses dans une co-culture modèle intégrant GABAergiques moyennes épineux neurones et les cellules HEK293 exprimant de façon stable GABA A Récepteurs

Le but du présent protocole est de faciliter l’étude des récepteurs NMDA (NMDAR) à grande échelle et de permettre l’examen des effets modulateurs de petites molécules et leurs applications thérapeutiques.

Un dosage de haut-débit-flux de Calcium pour l’étude des récepteurs NMDA avec sensibilité à la Glycine/D-sérine et Glutamate

La méthode d’autoradiographie est systématiquement utilisée pour étudier la liaison des radioligands sections de tissu pour la détermination de la pharmacologie qualitative ou quantitative.

Autoradiographie comme une méthode Simple et puissante pour la visualisation et la caractérisation des cibles pharmacologiques

Les interactions GPCR-MD-arrestin sont un domaine émergent dans la découverte de médicaments par gpCR. Des méthodes précises, précises et faciles à mettre en place sont nécessaires pour surveiller de telles interactions dans les systèmes vivants. Nous montrons un test de complémentarité structurelle pour surveiller les interactions GPCR-MD-arrestin dans les cellules vivantes en temps réel, et il peut être étendu à n'importe quel GPCR.

Surveillance des interactions GPCR-MD-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments

Cette méthode introduit une technique simple pour la détection de la libération endogène de monoamine à l’aide de tranches cérébrales aiguës. La configuration utilise une plaque de 48 puits contenant un support de tissu pour la libération de monoamine. La monoamine libérée est analysée par CLHP couplée à une détection électrochimique. De plus, cette technique fournit une méthode de dépistage pour la découverte de médicaments.

Un test sur plaque pour la mesure de la libération endogène de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës

Le protocole décrit la préparation de colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire (CMAC) avec des fragments de membrane cellulaire immobilisés contenant des protéines fonctionnelles du récepteur B de la tropomyosine kinase transmembranaire. L’utilisation des colonnes CMAC dans l’identification des métabolites végétaux spécialisés interagissant avec ces récepteurs et présents dans des mélanges naturels complexes est également expliquée.

Colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire pour identifier les métabolites végétaux spécialisés interagissant avec le récepteur B de la tropomyosine kinase immobilisée

Le protocole démontre qu’en effectuant une microtransplantation de membranes synaptiques en ovocytes Xenopus laevis , il est possible d’enregistrer des réponses cohérentes et fiables de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique et des récepteurs de l’acide γ-aminobutyrique.

Microtransplantation de membranes synaptiques pour réactiver les récepteurs synaptiques humains pour les études fonctionnelles

Le test de réticulation chimique BS3 révèle une réduction de l’expression du récepteur GABAA de surface cellulaire dans le cerveau de souris dans des conditions de stress psychosocial chronique.

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire Présentation du récepteur GABAA dans le cerveau des rongeurs

Nous décrivons ici un système de levure reconstituant la γ-sécrétase humaine. Ce système permet d’identifier et d’étudier les mutations affectant l’activité et de cribler les inhibiteurs de la γ-sécrétase (GSI). En utilisant les propriétés de perte de fonction des mutants familiaux de la maladie d’Alzheimer, il est possible de dépister les modulateurs de la γ-sécrétase (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modèles de la maladie d’Alzheimer pour cribler les gènes, les mutations et les produits chimiques affectant la production de bêta-amyloïde par la γ-sécrétase

Découvrez une cascade de criblage pour identifier de nouveaux ligands des récepteurs GABA-A utilisant des oocytes de Xenopus et des tranches de cerveau de rongeur. Cette méthode combine liaison de radioligands et enregistrements électrophysiologiques.

Méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide Gamma - aminobutyrique tapez une Neurotransmission (Vidéo) | JoVE Journal

Méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide Gamma - aminobutyrique tapez une Neurotransmission

Explorer plus de vidéos