Méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide Gamma - aminobutyrique tapez une Neurotransmission
16 août 2018
Nous présentons ici les protocoles visant à découvrir des composés actifs au niveau des récepteurs GABAA , de la liaison à la physiologie et de pharmacologie.
L’objectif général de cette vidéo est d’illustrer une cascade de criblage qui permet la découverte de nouveaux ligands du récepteur GABA-A. L’avantage d’utiliser la liaison aux radioligands, l’enregistrement électrophysiologique dans les ovocytes de xénope et dans les tranches de cerveau de rongeur de manière littérative est que le profil du composé peut être amélioré. En fin de compte, des sous-types puissants, des composés sélectifs et efficaces sont identifiés.
Cette démonstration sera réalisée par Kumico Kambara et Jenna Tognaccini ainsi que par Sonia et Daniel Bertrand de HiQScreen et Marie Claire Pflimlin de Roche. Injecter 10 à 50 nanolitres de la solution contenant le plasmide à l’aide d’une aiguille de micro-injection en verre dont le diamètre de la pointe peut aller jusqu’à 100 micromètres montée sur un micromanipulateur équipé d’un système d’éjection par pression ou d’un système d’injection automatisé. Pour commencer cette procédure, maintenez les ovocytes à 17 degrés Celsius pour éviter l’expression de protéines de choc thermique.
Stockez la microplaque dans une zone de stockage à température contrôlée. Ensuite, dissoudre les composés d’essai, qui ont été testés positifs dans le test de liaison dans OR2, à 0,1 et 1000 micromolaires pour les enregistrements électrophysiologiques et les disposer dans une plaque de polypropylène à fond plat de 96 puits. Pour effectuer l’enregistrement de la tension de deux électrodes, placez une plaque contenant les ovocytes sur le système automatisé.
Programmez le système d’enregistrement automatisé à l’aide de l’interface basée sur des icônes avec ce schéma pour la détermination appropriée de la relation concentration-activité. Pour l’ajustement de courbe, à l’aide de la courbe d’activation de la concentration illustrée, tracez l’amplitude actuelle en fonction du logarithme de la concentration de l’agoniste. Pour l’enregistrement électrophysiologique, conservez le cerveau dans une solution dACSF remplie de carbogène à température ambiante.
Ensuite, disséquez la formation de l’hippocampe gauche à l’aide d’une spatule fine. Par la suite, sectionnez des lames transversales de 400 micromètres d’épaisseur à partir de la partie médiane de l’hippocampe à l’aide d’un hachoir à tissus. À l’aide d’un pinceau, transférez les tranches dans la chambre d’enregistrement et maintenez-les à température ambiante pendant 45 minutes.
Ensuite, perfuser les tranches avec du rACSF bouillonné avec du carbogen à 35 degrés Celsius et à un taux de 1,5 millilitre par minute. Pour enregistrer un pic de population unique, placez une tranche de cerveau dans la chambre montée sur le microscope. Perfuser la tranche avec rACSF à raison de trois millilitres par minute.
À l’aide de l’extracteur de pipette, tirez une micropipette en verre borosilicate d’une résistance d’environ deux mégaohms. Remplissez la micropipette avec une solution contenant deux molaires de chlorure de sodium et placez-la dans le porte-pipette. Positionnez la micropipette enregistreuse dans la couche pyramidale dans la région CA1 de la tranche d’hippocampe à l’aide du micromanipulateur droit.
Ensuite, placez une électrode bipolaire isolée en platine iridium dans le support du micromanipulateur gauche. Positionnez l’électrode de stimulation dans les collatéraux de Schaffer dans la région CA1 de la tranche d’hippocampe à l’aide du micromanipulateur gauche. À l’aide du générateur de stimulus, délivrez une impulsion de courant à l’électrode de stimulation toutes les 30 secondes et augmentez progressivement la force de stimulation jusqu’à ce qu’un pic de population apparaisse.
Ajustez l’intensité du stimulus pour évoquer un pic de population correspondant à 45 % de l’amplitude maximale pouvant être obtenue. Pour effectuer une inhibition d’impulsion appariée, délivrez deux impulsions de courant à l’électrode de stimulation toutes les 30 secondes à l’aide du générateur de stimulus. Réglez l’intensité du stimulus pour qu’il évoque un pic de population correspondant à 45 % de l’amplitude maximale.
Pour tester les composés, il faut procéder à des dilutions des composés à tester dans l’ACSF de manière à ce que la concentration finale de DMSO ne soit pas supérieure à 0,1 %. Ajoutez du DMSO à la solution témoin à la même concentration que celle contenue dans la solution composée. Enregistrez un pic de population d’impulsions unique ou apparié évoqué par les stimulations collatérales de Schaffer toutes les 30 secondes pendant au moins 30 minutes. La forme du pic de population devrait être stable au cours de cette période de référence.
Ensuite, préparez un bécher avec du rACSF carbogéné contenant une concentration fixe du composé à tester et perfuser la tranche d’hippocampe avec la solution lors de l’enregistrement des pics de population d’impulsions simples ou appariées. Évaluez également la récupération de l’effet composé en perfusant la tranche avec du rACSF carbogéné sans le composé. Voici une représentation schématique d’une tranche d’hippocampe de rat, les collatéraux de Schaffer provenant des axones des cellules pyramidales CA3 se projetant sur l’arborisation dendritique des neurones pyramidaux CA1.
Des micropipettes ont été placées dans la couche pyramidale pour enregistrer les pics de population et dans la couche radiale pour les enregistrements dendritiques des potentiels postsynaptiques excitateurs de champ. L’électrode de stimulation a été placée à l’intérieur des collatéraux de Schaffer. Cette figure montre les pics de population évoqués par les stimuli appariés appliqués à travers la même électrode de stimulation à un intervalle de 20 millisecondes.
La réponse de la population au deuxième stimulus est de plus petite amplitude que celle de la réponse au premier stimulus. Des pics de population ont été enregistrés en l’absence et en présence de bêta CCM, un NAM non sélectif du récepteur GABA A. Beta CCM a augmenté l’amplitude du deuxième pic de population en bloquant partiellement toute inhibition gabaergique par anticipation.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la pharmacocinétique, l’occupation et l’efficacité des récepteurs in vivo et la pharmacologie de sécurité peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le potentiel de développement clinique des composés identifiés.
Aperçu
Cette étude présente des protocoles pour la découverte de composés interagissant avec les récepteurs GABA A, en utilisant une cascade de criblage combinant des techniques de liaison de radioligands et des méthodes électrophysiologiques. L'approche vise à identifier des composés sélectifs et efficaces par des tests itératifs sur des ovocytes de Xenopus et des tranches de cerveau de rongeur.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Pharmacologie
- Électrophysiologie
Contexte
- Comprendre l'activité des récepteurs GABA A est essentiel pour les applications pharmacologiques.
- Les composés interagissant avec ces récepteurs peuvent avoir des effets thérapeutiques sur les troubles neurologiques.
- Les enregistrements électrophysiologiques permettent d'obtenir des informations sur l'impact physiologique de ces composés.
- Le criblage itératif améliore l'optimisation du profil des composés.
Objectif de l'étude
- Développer une approche systématique pour découvrir de nouveaux ligands des récepteurs GABA A.
- Améliorer les capacités des tests de liaison et des analyses électrophysiologiques.
- Faciliter l'identification de composés présentant une signification clinique potentielle.
Méthodes utilisées
- La recherche utilise des préparations de tranches de cerveau ex vivo et des ovocytes de Xenopus pour les tests de composés.
- Des enregistrements électrophysiologiques sont effectués afin de mesurer les réponses dans les tranches de cerveau et les ovocytes, évaluant ainsi l'activité des ligands.
- L'étude décrit des chronologies spécifiques pour des procédures telles que l'entretien des ovocytes et la perfusion des composés.
- Des techniques détaillées d'injection pour la livraison de plasmides dans les ovocytes ainsi que des montages d'enregistrement pour les préparations de tranches sont décrites.
Résultats principaux
- L'étude décrit l'identification réussie de composés capables de moduler sélectivement l'activité des récepteurs GABA A.
- Des enregistrements électrophysiologiques ont révélé des modifications des amplitudes des potentiels de population en réponse à l'application de ligands.
- Des éclairages ont été obtenus concernant les rôles mécanistiques de l'inhibition des récepteurs GABA A et les effets liés à la dose des composés.
- Validation des résultats par des méthodes statistiques rigoureuses afin d'établir la fiabilité des découvertes.
Conclusions
- La présente étude permet d'identifier des ligands sélectifs des récepteurs GABA A possédant un potentiel thérapeutique.
- Elle souligne l'importance de combiner des tests de liaison avec des enregistrements physiologiques pour l'évaluation des composés.
- Les résultats contribuent à une meilleure compréhension des interactions ligand-récepteur et de leurs implications pour le développement de médicaments.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette cascade de criblage permet une évaluation itérative des ligands du récepteur GABAA dans des systèmes recombinants et natifs, soutenant la validation de la cible et l'optimisation des composés candidats dans la découverte de médicaments du système nerveux central. En intégrant le lien radiomarqué, l'électrophysiologie des ovocytes et les enregistrements sur tranches de cerveau, cette méthode renforce la fiabilité prédictive de la sélectivité et de l'efficacité des composés. Le flux de travail permet une réduction précoce des risques liés aux hypothèses mécanistiques et oriente la priorisation des projets pour les thérapeutiques ciblant les récepteurs GABAA.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en évaluant la liaison et l'activité fonctionnelle de composés sur différents sous-types de récepteurs GABAA.
- Valeur opérationnelle : Permet le profilage de la sélectivité par sous-type grâce à la liaison de radioligands sur des membranes recombinantes exprimant les principaux sous-types de GABAA.
- Valeur prédictive : Facilite l'identification de composés candidats en associant affinité de liaison et modulation fonctionnelle dans des systèmes d'expression hétérologue.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (par exemple, amplitude du courant, amplitude du pic de population) pour la caractérisation dose-réponse.
- Valeur opérationnelle : Standardise les conditions de test sur les ovocytes de Xenopus et les tranches de cerveau de rongeur afin d'évaluer les composés de manière reproductible.
- Extensibilité : Facilite la préparation au criblage grâce à des systèmes d'enregistrement automatisés et à des formats de plaques 96-puits pour le profilage électrophysiologique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les données sur les récepteurs recombinants et la physiologie des récepteurs natifs dans des tranches hippocampiques de rongeur, soutenant ainsi la validation du système dans un contexte pertinent pour la maladie.
- Réduction des risques mécanistiques : Précise les effets des composés sur l'excitabilité neuronale à l'aide de tests d'inhibition par double impulsion et de récupération du potentiel de population.
- Adéquation au modèle préclinique : Utilise des enregistrements extracellulaires dans des circuits neuronaux définis pour évaluer l'activité des composés dans un contexte physiologiquement pertinent.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode inscrit le criblage de composés dans la continuité de la découverte, allant de la validation de la cible à l'évaluation préclinique, permettant ainsi un affinement itératif des profils de ligands.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en isolant des variables (par exemple, sous-type de récepteur, concentration du composé) afin de clarifier les relations structure-activité.
- Triage : Assure la préparation des tests grâce à des protocoles standardisés de perfusion, d'enregistrement et d'application de composés sur des ovocytes et des tranches tissulaires.
- Analytique : Génère des courbes concentration-réponse et des paramètres de récupération permettant la comparaison entre différentes conditions et la modélisation des relations structure-activité.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats in vitro aux réponses observées dans les tissus natifs, soutenant ainsi des décisions d'orientation fondées sur l'évaluation des risques.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une cascade de triage réutilisable, adaptable à d'autres cibles canaux ioniques au-delà des récepteurs GABAA.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la cible en corrélant les données de liaison avec les résultats fonctionnels dans plusieurs systèmes expérimentaux.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à un contrôle de la conservation des ovocytes, des débits de perfusion et des paramètres de stimulation.
- Valeur stratégique : Affine les décisions de poursuite ou d'abandon en identifiant précocement des composés puissants, sélectifs des sous-types et efficaces dans la cascade.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en filtrant les composés selon leur affinité de liaison, leur puissance électrophysiologique et leur activité sur les récepteurs natifs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie moléculaire (isolement d'ARNm, microinjection), en électrophysiologie (clampage voltage à deux électrodes, enregistrements en champ) et en préparation de tissus (entretien de tranches hippocampiques).
- Dépend d'instruments tels que des micromanipulateurs, des systèmes d'enregistrement automatisés, des générateurs de stimuli et des dispositifs de perfusion pour ovocytes et tranches cérébrales.
- Exige une standardisation inter-équipes des dilutions de composés, des témoins au DMSO et des durées de perfusion afin d'assurer la cohérence des données entre laboratoires.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors du transfert des protocoles des ovocytes de Xenopus vers les cellules HEK 293 ou d'autres systèmes d'expression.
- Les limitations pratiques incluent les compétences techniques requises pour la microinjection, le maintien de la viabilité des tranches et l'obtention d'un enregistrement de ligne de base stable avant l'application du composé.
