Méthodes pour la découverte de nouveaux composés modulant un récepteur de l’acide Gamma - aminobutyrique tapez une Neurotransmission

L’objectif général de cette vidéo est d’illustrer une cascade de criblage qui permet la découverte de nouveaux ligands du récepteur GABA-A. L’avantage d’utiliser la liaison aux radioligands, l’enregistrement électrophysiologique dans les ovocytes de xénope et dans les tranches de cerveau de rongeur de manière littérative est que le profil du composé peut être amélioré. En fin de compte, des sous-types puissants, des composés sélectifs et efficaces sont identifiés.

Cette démonstration sera réalisée par Kumico Kambara et Jenna Tognaccini ainsi que par Sonia et Daniel Bertrand de HiQScreen et Marie Claire Pflimlin de Roche. Injecter 10 à 50 nanolitres de la solution contenant le plasmide à l’aide d’une aiguille de micro-injection en verre dont le diamètre de la pointe peut aller jusqu’à 100 micromètres montée sur un micromanipulateur équipé d’un système d’éjection par pression ou d’un système d’injection automatisé. Pour commencer cette procédure, maintenez les ovocytes à 17 degrés Celsius pour éviter l’expression de protéines de choc thermique.

Stockez la microplaque dans une zone de stockage à température contrôlée. Ensuite, dissoudre les composés d’essai, qui ont été testés positifs dans le test de liaison dans OR2, à 0,1 et 1000 micromolaires pour les enregistrements électrophysiologiques et les disposer dans une plaque de polypropylène à fond plat de 96 puits. Pour effectuer l’enregistrement de la tension de deux électrodes, placez une plaque contenant les ovocytes sur le système automatisé.

Programmez le système d’enregistrement automatisé à l’aide de l’interface basée sur des icônes avec ce schéma pour la détermination appropriée de la relation concentration-activité. Pour l’ajustement de courbe, à l’aide de la courbe d’activation de la concentration illustrée, tracez l’amplitude actuelle en fonction du logarithme de la concentration de l’agoniste. Pour l’enregistrement électrophysiologique, conservez le cerveau dans une solution dACSF remplie de carbogène à température ambiante.

Ensuite, disséquez la formation de l’hippocampe gauche à l’aide d’une spatule fine. Par la suite, sectionnez des lames transversales de 400 micromètres d’épaisseur à partir de la partie médiane de l’hippocampe à l’aide d’un hachoir à tissus. À l’aide d’un pinceau, transférez les tranches dans la chambre d’enregistrement et maintenez-les à température ambiante pendant 45 minutes.

Ensuite, perfuser les tranches avec du rACSF bouillonné avec du carbogen à 35 degrés Celsius et à un taux de 1,5 millilitre par minute. Pour enregistrer un pic de population unique, placez une tranche de cerveau dans la chambre montée sur le microscope. Perfuser la tranche avec rACSF à raison de trois millilitres par minute.

À l’aide de l’extracteur de pipette, tirez une micropipette en verre borosilicate d’une résistance d’environ deux mégaohms. Remplissez la micropipette avec une solution contenant deux molaires de chlorure de sodium et placez-la dans le porte-pipette. Positionnez la micropipette enregistreuse dans la couche pyramidale dans la région CA1 de la tranche d’hippocampe à l’aide du micromanipulateur droit.

Ensuite, placez une électrode bipolaire isolée en platine iridium dans le support du micromanipulateur gauche. Positionnez l’électrode de stimulation dans les collatéraux de Schaffer dans la région CA1 de la tranche d’hippocampe à l’aide du micromanipulateur gauche. À l’aide du générateur de stimulus, délivrez une impulsion de courant à l’électrode de stimulation toutes les 30 secondes et augmentez progressivement la force de stimulation jusqu’à ce qu’un pic de population apparaisse.

Ajustez l’intensité du stimulus pour évoquer un pic de population correspondant à 45 % de l’amplitude maximale pouvant être obtenue. Pour effectuer une inhibition d’impulsion appariée, délivrez deux impulsions de courant à l’électrode de stimulation toutes les 30 secondes à l’aide du générateur de stimulus. Réglez l’intensité du stimulus pour qu’il évoque un pic de population correspondant à 45 % de l’amplitude maximale.

Pour tester les composés, il faut procéder à des dilutions des composés à tester dans l’ACSF de manière à ce que la concentration finale de DMSO ne soit pas supérieure à 0,1 %. Ajoutez du DMSO à la solution témoin à la même concentration que celle contenue dans la solution composée. Enregistrez un pic de population d’impulsions unique ou apparié évoqué par les stimulations collatérales de Schaffer toutes les 30 secondes pendant au moins 30 minutes. La forme du pic de population devrait être stable au cours de cette période de référence.

Ensuite, préparez un bécher avec du rACSF carbogéné contenant une concentration fixe du composé à tester et perfuser la tranche d’hippocampe avec la solution lors de l’enregistrement des pics de population d’impulsions simples ou appariées. Évaluez également la récupération de l’effet composé en perfusant la tranche avec du rACSF carbogéné sans le composé. Voici une représentation schématique d’une tranche d’hippocampe de rat, les collatéraux de Schaffer provenant des axones des cellules pyramidales CA3 se projetant sur l’arborisation dendritique des neurones pyramidaux CA1.

Des micropipettes ont été placées dans la couche pyramidale pour enregistrer les pics de population et dans la couche radiale pour les enregistrements dendritiques des potentiels postsynaptiques excitateurs de champ. L’électrode de stimulation a été placée à l’intérieur des collatéraux de Schaffer. Cette figure montre les pics de population évoqués par les stimuli appariés appliqués à travers la même électrode de stimulation à un intervalle de 20 millisecondes.

La réponse de la population au deuxième stimulus est de plus petite amplitude que celle de la réponse au premier stimulus. Des pics de population ont été enregistrés en l’absence et en présence de bêta CCM, un NAM non sélectif du récepteur GABA A. Beta CCM a augmenté l’amplitude du deuxième pic de population en bloquant partiellement toute inhibition gabaergique par anticipation.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la pharmacocinétique, l’occupation et l’efficacité des récepteurs in vivo et la pharmacologie de sécurité peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le potentiel de développement clinique des composés identifiés.