Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay
7 septembre 2018
Dans cet article, nous décrivons un protocole afin de caractériser les T-dépendants et indépendants de T les réponses isotype immunoglobuline (Ig) chez la souris à l’aide d’ELISA. Cette méthode utilisée seule ou en combinaison avec écoulement cytometry permettra aux chercheurs d’identifier les différences dans les réponses d’isotype Ig médiée par les lymphocytes B chez les souris après vaccination antigène T-dépendants et indépendants de T.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie sur les réponses dépendantes et indépendantes des anticorps induites par l’immunisation antigénique, ainsi que sur l’activation des lymphocytes B et les réactions du centre germinal. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des mesures fiables et quantitatives de la réponse isotypique des Ig avec une comparaison directe de l’activation des lymphocytes B et de l’immunité humorale chez la souris. Pour l’immunisation TNP-polysaccharide, chargez une seringue d’insuline d’un millilitre par souris avec 100 microlitres de solution d’antigène fraîchement préparée et insérez l’aiguille dans le quadrant inférieur droit de chaque animal à un angle d’environ 30 degrés pour éviter l’injection dans l’organe inférieur.
Lorsque toutes les souris ont été injectées, retournez les animaux dans leurs cages pour les loger dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes. Aux points expérimentaux appropriés, prélever 150 à 200 microlitres de sang de chaque animal immunisé par saignement rétro-orbitaire et laisser les échantillons coaguler à température ambiante pendant une à deux heures. À la fin de l’incubation, centrifugez les échantillons de sang coagulé et transférez le sérum clair du haut de chaque caillot sanguin dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre.
Après une deuxième centrifugation pour éliminer tout caillot sanguin résiduel, transférez 50 microlitres de sérum dans des tubes à microcentrifuger stériles individuels de 1,5 millilitre pour un stockage à moins 80 degrés Celsius. Avant le placage, enrober les immunoplaques individuelles à 96 puits avec la concentration appropriée d’anticorps capturants spécifiques de l’isotype d’Ig de souris pour l’isotype d’Ig sérique total de l’antigène TNP-38BSA pour l’isotype d’Ig spécifique de TNP ou de l’antigène TNP-3BSA pour l’isotype d’Ig spécifique de TNP de haute affinité et incuber les plaques enrobées pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les plaques deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage par puits.
Jetez le tampon de lavage et séchez les assiettes en tapotant sur une pile de serviettes en papier après chaque lavage. Ensuite, bloquez les plaques avec 200 microlitres de tampon de blocage par puits pour une incubation d’une heure à température ambiante. Pendant que les plaques sont bloquées, préparez l’étalon approprié, les dilutions sériques et le tampon de blocage dans une plaque séparée non traitée à 96 puits à 150 microlitres par puits, comme indiqué.
Ensuite, lavez la plaque ELISA avec un tampon de lavage comme démontré et ajoutez 100 microlitres de chaque étalon d’isotype d’Ig dilué et échantillon de sérum dans les puits appropriés de la plaque ELISA. Après une nuit d’incubation à quatre degrés Celsius, laver les plaques comme démontré et ajouter 100 microlitres d’un anticorps spécifique isotype conjugué à la phosphatase alcaline appropriée dilué dans un tampon de blocage dans chaque puits pour une incubation d’une à deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les plaques et ajoutez 100 microlitres de solution de substrat fraîchement préparée dans chaque puits.
Surveiller la réaction au fur et à mesure qu’elle se développe au cours des prochaines minutes à température ambiante. Lorsque la réaction est suffisamment robuste pour être analysée, placez la plaque dans un lecteur de microplaques et cliquez sur les paramètres pour régler la longueur d’onde à 405 nanomètres. Cliquez sur OK puis sur le modèle pour attribuer les puits vierges, standard et inconnus appropriés selon la configuration de la plaque de 96 puits.
Ensuite, lorsque l’étalon le plus concentré atteint une densité optique d’environ un, 1,5, deux et 2,5, cliquez sur lire pour lire la plaque et enregistrer le fichier de données résultant après chaque analyse. En l’absence d’immunisation, une augmentation des taux sériques basaux d’IgM, d’IgG2a, d’IgG2b, d’IgG3 et d’IgA est observée chez les souris du facteur trois associé au récepteur du TNF spécifique des lymphocytes B ou chez les souris knock-out B-TRAF3, par rapport aux animaux témoins témoins de portée suffisante pour le récepteur B-TRAF3 appariés. Sept jours après l’administration par le polysaccharide TNP ou le TNP-KLH, comme cela vient d’être démontré, l’analyse des réponses isotypiques des Ig indépendantes du thymus à l’immunisation révèle des taux significativement plus élevés d’IgG3 spécifiques du TNP indépendants du thymus ainsi que des niveaux élevés d’IgG2b spécifiques du TNP dépendants du thymus chez les souris knock-out TRAF3 spécifiques aux cellules myéloïdes par rapport aux témoins de la portée.
De plus, l’évaluation des réponses primaires et de la mémoire des souris dépendantes du thymus à l’immunisation TNP-KLH indique la présence de réponses primaires IgM dépendantes du thymus partiellement diminuées et de réponses primaires et mémoires IgG1 défectueuses chez les souris knock-out TRAF3 spécifiques des lymphocytes T. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les ELISA ont des limites de détection qui sont généralement définies par la plage linéaire des courbes standard et que, par conséquent, plusieurs dilutions de votre échantillon peuvent être nécessaires. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes complémentaires telles que la cytométrie en flux ou le point L peuvent être effectuées pour obtenir une compréhension complète des réponses des anticorps dans un cadre expérimental donné.
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Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant de caractériser les réponses des isotopes d'immunoglobulines (Ig) dépendantes et indépendantes des lymphocytes T chez la souris à l'aide d'un ELISA. Cette méthode permet aux chercheurs d'identifier les différences dans les réponses des isotopes d'Ig médiées par les lymphocytes B après une immunisation par un antigène.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Réponses des anticorps
- Activation des lymphocytes B
Contexte
- Comprendre les réponses anticorpiques dépendantes et indépendantes des lymphocytes T est essentiel en immunologie.
- La caractérisation des réponses en isotopes d'Ig aide à l'étude de l'immunité humorale.
- La cytométrie en flux peut compléter le test ELISA pour une analyse détaillée.
- Des mesures fiables des réponses en isotopes d'Ig sont essentielles pour la recherche.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole pour mesurer les réponses en isotopes d'Ig chez les souris.
- Comparer l'activation des cellules B en réponse à différents antigènes.
- Approfondir la compréhension des réponses immunitaires dans divers contextes.
Méthodes utilisées
- ELISA pour quantifier les réponses en isotopes d'Ig.
- Cytométrie en flux pour analyser l'activation des cellules B.
- Injection d'une solution d'antigène chez des souris pour l'immunisation.
- Prélèvement d'échantillons sanguins pour l'analyse du sérum.
Résultats principaux
- Des mesures quantitatives des réponses en isotypes d'Ig ont été obtenues.
- Des différences dans l'activation des cellules B ont été observées selon le type d'antigène.
- La méthode s'est révélée fiable pour l'étude de l'immunité humorale.
- Des échantillons sériques clairs ont été obtenus pour des analyses supplémentaires.
Conclusions
- Le protocole est efficace pour caractériser les réponses anticorps.
- Il fournit des informations sur l'immunité médiée par les cellules B.
- Cette méthode peut être appliquée à diverses études immunologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet aux chercheurs en biopharmacie d'analyser quantitativement les réponses des isotopes des immunoglobulines dépendantes et indépendantes du thymus chez les modèles murins, offrant ainsi des informations mécanistiques sur l'activation des lymphocytes B et l'immunité humorale. En fournissant des mesures fiables par ELISA spécifiques aux isotopes, il soutient la validation des cibles et la réduction prédictive des risques dans le développement de vaccins et d'immunomodulateurs. La méthode améliore la continuité translationnelle lorsqu'elle est combinée à des tests complémentaires tels que la cytométrie en flux, aidant à prendre des décisions d'orientation (go/no-go) dans les phases précoces des pipelines de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant les réponses d'IgM spécifiques aux antigènes et d'IgG/IgA/IgE ayant subi un commutation d'isotype, en réponse à des stimuli dépendants et indépendants du thymus.
- Valeur opérationnelle : Fournit des mesures standardisées et reproductibles des anticorps sériques, permettant de préciser l'engagement fonctionnel de la cible et l'activité biologique de candidats immunomodulateurs.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en distinguant les classes mécanistiques d'immunogènes selon les profils de commutation d'isotype et la cinétique des réponses mémoires.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-utiliser pour les tests : Génère des systèmes biologiques validés (sérums de souris) produisant des isotopes d'Ig quantitatifs, adaptés aux flux de travail de criblage en aval.
- Reproductibilité : Propose des protocoles ELISA standardisés incluant des exigences de dilution définies et des contrôles de gamme linéaire, garantissant la cohérence du test entre les expériences.
- Extensibilité : Permet la réutilisation de la plateforme pour l'analyse comparative de formulations d'antigènes, d'adjuvants ou de modèles génétiques dans des campagnes de criblage d'immunogénicité.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Permet l'évaluation des réponses spécifiques aux antigènes dans des modèles reflétant l'immunité humorale humaine, soutenant l'alignement des biomarqueurs translationnels.
- Continuité préclinique : Relie le profilage des isotopes d'Ig en phase de découverte précoce à la validation préclinique par des prélèvements sériques longitudinaux avant et après immunisation.
- Décisions ajustées au risque : Éclaire les critères de progression en identifiant des défauts dans le commutation d'isotype (par exemple, IgG1) ou dans les réponses mémoires liées à des voies cellulaires spécifiques (par exemple, la protéine TRAF3 des cellules T).
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles à l'identification de composés actifs, jusqu'à l'évaluation préclinique, en particulier pour les immunomodulateurs et les vaccins, où le profilage d'isotype permet de prédire les résultats fonctionnels.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en associant l'exposition à l'antigène à des signatures définies d'isotypes d'Ig (par exemple, IgG3 indépendante du thymus vs. IgG2b dépendante du thymus).
- Dépistage : Fournit des résultats quantitatifs prêts à l'analyse, caractérisés par une haute spécificité et sensibilité, permettant une comparaison fiable du potentiel immunogène entre différents candidats.
- Analyse : Propose des mesures fondées sur la densité optique à 405 nm, interpolées à partir de courbes standards, permettant des comparaisons statistiques intergroupes des titres d'anticorps.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en permettant le suivi longitudinal des réponses primaires et mémoires, essentiel pour l'évaluation de candidats vaccins.
- Réutilisation à l'échelle organisationnelle : Met en place un outil reproductible de profilage immunologique applicable à plusieurs projets impliquant des réponses médiées par les lymphocytes B.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies d'activation des lymphocytes B.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité grâce à des protocoles définis de dilution du sérum et à des étapes d'optimisation de l'ELISA.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » en associant les profils d'isotypes à des résultats immunitaires fonctionnels, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats selon leur capacité à induire des réponses de commutation d'isotype et des réponses mémoires souhaitées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunologie murine, en manipulation de sérum et en optimisation de la technique ELISA afin de garantir une quantification précise dans la plage linéaire des courbes standards.
- Dépend de l'accès à des lecteurs de microplaques, des incubateurs, des centrifugeuses et des installations stériles de culture cellulaire pour le traitement des sérums et la réalisation des tests.
- Exige une standardisation inter-équipes concernant le moment de prélèvement des échantillons, les techniques de saignement (par exemple, rétro-orbitaire) et les conditions de stockage (−80 °C) afin de préserver l'intégrité des données.
- Implique des adaptations nécessaires lors de l'application à différentes souches de souris, à différents antigènes (par exemple, TNP-KLH par rapport au TNP-polysaccharide) ou à différents systèmes d'adjuvants (alumine par rapport au PBS).
- Limite pratique : une dilution sériée des échantillons est souvent nécessaire pour éviter la saturation du signal et assurer une interpolation précise à partir des courbes standards, ce qui augmente le temps de manipulation.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
0:43
2,4,6-Trinitrophenyl (TNP)-polysaccharide and TNP-keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Immunization and Serum Preparation
1:54
Enzyme-linked Immunosorbent Analysis (ELISA)
4:17
Results: Representative Thymus-independent (TI) and Thymus-dependent (TD) Ig Isotype responses to TNP-polysaccharide and TNP-KLH Immunization
5:36
Conclusion
