Name: Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Apprenez à caractériser les réponses d'isotypes d'immunoglobulines dépendantes et indépendantes du thymus chez la souris par ELISA. Cette technique permet de mesurer quantitativement l'activation des cellules B et l'immunité humorale.

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Cette étude a été financée par les instituts nationaux de santé subventions R01 CA158402 (P. xxx) et R21 AI128264 (P. Xie), le Department of Defense accorder W81XWH-13-1-0242 (P. xxx), une bourse de pilote depuis le Cancer Institute du New Jersey par Grant nombre P30CA072720 de l’Institut National du Cancer (P. xxx), une subvention de recherche biomédicale de Busch (P. xxx), une bourse Stollar Victor (a. Lalani) et une Anne B. et bourse de James B. Leathem (S. Zhu).

Ce protocole suit les directives du Comité d’éthique institutionnel de recherche animale de l’Université Rutgers. Toutes les souris sont utilisés conformément aux lignes directrices des NIH et sous un animal protocole approuvé par le Comité de l’emploi et d’institutionnels animalier.
1. préparation des souris et des Collection de sérums de souris naïves
<ol><li>Gardez toutes les souris pour des expériences de vaccination à l’animalerie exempts d’agents pathogènes spécifiques.</li>
	<li>Knockout de même sexe, les jeunes adultes (âgés de 8 à 12 semaines) utilisation et même portée contrôle souris qui partagent les mêmes parents et cages pour les études de la vaccination.</li>
	<li>Plan de l’immunisation et les horaires de collecte du sérum tel que représenté dans la Figure 1.</li>
	<li>Récolter sérum naïf de chaque souris à 7 jours (-7 jours) avant la vaccination. Suivez les procédures rétro-orbitaire hémorragie et sérum préparation tel que décrit ci-après à l’étape 4.</li>
</ol>2. préparation du TNP-polysaccharide (un antigène de TI) et PNT-KLH (un antigène de TD)
<ol><li>Dissoudre les poudres d’antigène dans du PBS stérile (pH 7,4) bien faire 0,5 mg/mL de stock PNT-polysaccharide et 1 mg/mL de solution mère PNT-KLH. Aliquote chaque antigène solution mère dans des microtubes stériles à 0,5 mL/tube et garder les aliquotes à-80 ° C pour le stockage à long terme. Évitez les multiples de gel et de dégel des aliquotes de l’antigène.</li>
	<li>Le jour de l’injection, calculer le volume du TNP-polysaccharide (50 µg/100 µL/souris) ou PNT-KLH (100 µg/100 µL/souris) nécessaires selon le nombre de souris à doser. Décongeler le nombre approprié de PNT-polysaccharide ou PNT-KLH aliquotes à température ambiante (RT).</li>
	<li>Pour injection de PNT-KLH, tout d’abord diluer l’adjuvant d’alun (40 mg/mL) et 3 volumes de PBS stérile à une concentration finale de 10 mg/mL. Assurez-vous que le mélange d’adjuvant d’alun est bien suspendu avant dilution.</li>
	<li>Combiner un volume égal de 10 mg/mL alun adjuvant lisier à l’étape 2.3 et la solution de PNT-KLH décongelée (1 mg/mL) dans un tube en polypropylène 5 mL, bien mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 30 min. Préparez ce PNT-KLH/alun mélanger fraîchement avant l’injection.</li>
</ol>3. immunisation de souris
<ol><li>Effectuer l’injection intrapéritonéale (i.p.) de PNT-polysaccharide ou PNT-KLH/alun d’immuniser les souris avec des seringues à insuline 1 mL dans une enceinte de sécurité biologique. Insérer l’aiguille à angle d’environ 30° de préférence dans le quadrant inférieur droit de chaque souris pour empêcher l’injection dans les organes internes.</li>
	<li>Injecter i.p. 100 µL du TNP-polysaccharide par souris le jour 0 de vaccination TI Ag (Figure 1A).</li>
	<li>Injecter i.p. 200 µL du mélange PNT-KLH/alun (fraîchement préparé à l’étape 2.4) par souris au jour 0 pour la vaccination de l’Ag de la TD. Renouveler l’injection même sur 21 jours comme une vaccination de rappel pour les études (Figure 1B) de la mémoire.</li>
	<li>Après l’injection, retourner chaque souris à sa cage et garder toutes les souris injectées dans un État exempt d’agents pathogènes spécifique.</li>
</ol>4. rétro-orbitaire hémorragie et préparation de sérum
<ol><li>Récolter les sérums de souris à des moments différents : pour la vaccination de PNT-polysaccharide, recueillir les sérums de souris jour -7 et 7 (Figure 1A) ; pour la vaccination de PNT-KLH/alun, recueillir des sérums de souris jour -7, 7, 14 et 28 (Figure 1B).</li>
	<li>Pour rétro-orbitaire hémorragie, anesthésier chaque souris avec 5 % isoflurane pendant 1 à 2 min dans une armoire de biosécurité25. Effectuer la pédale réflexe afin d’assurer une anesthésie adéquate de chaque souris.</li>
	<li>Maintenez la souris anesthésiée dans une main avec l’index et le pouce en tirant la peau autour du globe oculaire arrière de façon que le globe oculaire fait saillie hors de la prise de25. Insérez le tube capillaire ou sans héparine de pipette Pasteur à un angle de 45° dans le coin interne de l’orbite sous le globe oculaire25.</li>
	<li>Appliquez une légère pression vers le bas et faites tourner la pipette ou le tube doucement pour percer dans la veine et recueillir 150 – 200 µL de sang dans la pipette ou le tube. Immédiatement transférer le sang dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL et regagner sa cage pour récupérer de la souris.</li>
	<li>Couler le sang échantillons s’asseoir à la droite pendant 1 à 2 h à coaguler.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons de sang coagulé à 13 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le sérum clair sur le dessus le caillot de sang dans un nouveau tube de microtubes stériles de 1,5 mL.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.6 une fois de plus pour retirer le caillot de sang résiduel et recueillir le sérum clair.</li>
	<li>Aliquote du sérum dans des microtubes stériles de 1,5 mL à 50 µL/tube et stocker les sérums à-80 ° C.</li>
	<li>Remplaçant le œil pour saignement à différents moments afin que chacun des deux yeux sont saigné au plus deux fois pour l’expérience entière. Au terminal de saignement, recueillir à 1 mL de sang de chaque souris avant l’euthanasie. Euthanasier la souris avec 5 % de CO2 suivi par dislocation cervicale. Remarque : Les cellules spléniques de B peuvent être récoltées pour analyses de cytométrie en flux et études de la culture in vitro . Nous préparons également l’ADN génomique de splénocytes pour vérifier le génotype de chaque souris.</li>
</ol>5. souris Ig Isotype-spécifiques ELISA
<ol><li>
Préparer les mémoires tampons et solutions avant d’ELISA.
	<ol>
<li>Préparer 500 mL de tampon de couplage (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Préparer 500 mL de Solution de lavage (PBS-T (0,05 % Tween 20), pH 7,4).</li>
		<li>Préparer 100 mL de tampon de blocage (1 % BSA dans du PBS, pH 7,4, stocké à 4 ° C).</li>
		<li>Préparer 1 L de tampon de substrat (diéthanolamine 1 M, pH 9,8 (97 mL de diéthanolamine dans 1 L de H2O, pH ajusté à l’aide de 10 M HCl) et 0,5 mM MgCl2). Protéger la mémoire tampon de substrat de la lumière en enveloppant la bouteille avec du papier aluminium. Conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer 100 mL de solution d’arrêt (3 M NaOH).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enduire les plaques ELISA :
	<ol>
<li>Pour l’isotype d’Ig sériques totales ELISA, enduire plaques immuno 96 puits 10 µg/ml d’isotype-spécifiques, capture de chèvre polyclonaux anti-souris Ig (M, G2a, G2b, G1, G3, A ou E) Abs au tampon de couplage (PBS) à 100 µL/puits.</li>
		<li>Pour l’isotype Ig spécifiques PNT ELISA, enduire plaques d’immuno 96 puits 10 µg/ml de TNP(38)-BSA dans du PBS à 100 µL/puits.</li>
		<li>Pour l’isotype Ig PNT spécifiques de haute affinité ELISA, enduire plaques d’immuno 96 puits avec 10 µg/mL de PNT(3)-BSA dans du PBS à 100 µL/puits26. Incuber les plaques à 4 ° C jusqu’au lendemain.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après incubation de revêtement, laver les plaques 2 fois avec 200 µL/puits de PBS-T. Jeter le tampon de lavage et la tache sécher les plaques (tapez chaque plaque à l’envers sur une pile de serviettes en papier) après chaque lavage.</li>
	<li>Bloquer les plaques : ajouter 200 µL/puits de blocage du Buffer (1 % de BSA dans du PBS) dans les plaques revêtues et incuber les boîtes pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>
Alors que les plaques sont bloquent, préparer des dilutions de normes isotype Ig et des échantillons de sérum dans un tampon bloquant dans une plaque à 96 puits distincte et non traitée à 150 µL/puits.
	<ol>
<li>Préparer des 250 ng/mL Ig isotype normes comme la concentration initiale standard (St01) et faire 7 à 10 de 1:2 dilutions successives des normes Ig (St02 St07 ou St10, Figure 2A).</li>
		<li>Préparer le sérum de souris échantillons à une dilution au 1/100 ou 1/500 facteur comme la dilution de départ et faire 3 ou 4 du 01:10 dilutions en série pour total isotype Ig ou des dilutions 1:5 pour l’isotype Ig PNT spécifiques de chaque échantillon de sérum (Figure 2A). Pour ELISA IgE, préparer des échantillons de sérum de souris à un facteur de dilution de 1:2 que la dilution de départ et faire 3 de dilutions en série 1:5 de chaque échantillon de sérum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après le blocage, laver les plaques de l’étape 5.4 trois fois avec 200 µL/puits de PBS-T et la tache sécher les plaques après chaque lavage.</li>
	<li>Transférer 100 µL/puits de dilué normes d’isotype Ig (appropriées pour la capture et la détection Abs) et des échantillons de sérum dilué de l’étape 5.5 aux plaques préparées à l’étape 5,6. Incuber les plaques avec les normes et les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.</li>
	<li>Laver les plaques 3 fois avec 200 µL/puits de PBS-T et la tache sécher les plaques après chaque lavage.</li>
	<li>Dans chaque assiette, ajouter 100 µL/puits de 10 µg/mL d’une phosphatase alcaline appropriée (AP)-conjugués isotype-spécifiques au chèvre anti-souris Ig (M, G2a, G2b, G1, G3, A ou E) Abs dilué dans un tampon bloquant.</li>
	<li>Incuber les boîtes avec AP-conjugué Abs pendant 1-2 h à température ambiante. Pour la détection de l’IgE, incuber les boîtes pendant 1 à 2 h à 37 ° C.</li>
	<li>Préparer 1 mg/mL de Solution de substrat en dissolvant deux comprimés de substrat de phosphatase de 5 mg dans 10 mL de tampon de substrat.</li>
	<li>Lavez chaque plaque 5 fois avec 200 µL/puits de PBS-T et la tache sécher les plaques après chaque lavage.</li>
	<li>Ajouter 100 µL/puits de la Solution de substrat dans chaque boîte. Permettre la réaction se développer au RT, qui prend généralement que quelques minutes.</li>
	<li>
Lire chaque plaque à 405 nm en utilisant un lecteur de microplaques avec son logiciel associé.
	<ol>
<li>Cliquez sur «paramètres» pour régler la longueur d’onde «Lm1» à "405 nm» et cliquez sur «OK».</li>
		<li>Cliquez sur le «modèle» pour affecter les puits «vide», de puits de «normes» et de «inconnu» puits selon le paramétrage de la plaque à 96 puits.</li>
		<li>Pour les puits de «normes», cliquez sur «série» pour définir le «Premier échantillon« sous »St01», sélectionnez «Démarrer de» au «Top» et «réplique» «2». Vérifiez «Échantillon Descriptor » et saisissez «Valeur Standard» : sélectionnez «unités« sous »ng/mL», «valeur de départ» que «250», définir «étape de» «2». Cliquez sur «OK».</li>
		<li>Cliquez sur « Lire » pour lire la plaque quand la plupart concentrées standard atteint une densité optique (do) de ~ 1.</li>
		<li>Cliquez sur le menu «fichier» et cliquez sur «Enregistrer» pour enregistrer le fichier.</li>
		<li>Cliquez sur «lire» pour relire la plaque quand la norme plus concentrée approche OD405 de ~ 1,5, 2 et 2.5, respectivement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arrêter la réaction en ajoutant 25 µL/puits de 3 M NaOH. Toutes les étapes 5.12 à 5.15 pour une plaque à la fois.</li>
	<li>
Analyser les données d’ELISA en utilisant le logiciel associé au lecteur de microplaque :
	<ol>
<li>Vérifiez les valeurs de OD405 des normes de fichiers lus isotype Ig et sélectionnez une lecture appropriée avec bonne gamme linéaire des normes pour l’analyse des données détaillées.</li>
		<li>Sélectionnez le programme de montage de 4 paramètres pour tracer des courbes d’étalonnage. Vérifier le coefficient de la courbe d’étalonnage (R2), qui doit être > 0,98 pour assurer la bonne qualité.</li>
		<li>Vérifiez si les valeurs OD405 de chaque échantillon diminuent avec l’augmentation des facteurs de dilution. Récupérer la concentration de tous les puits de l’échantillon dilué en cliquant sur « Inconnues ».</li>
		<li>Sélectionnez un puits correspondant de chaque échantillon avec OD405 dans la gamme linéaire de la courbe d’étalonnage isotype Ig pour le calcul de la concentration.</li>
		<li>Calculer la concentration isotype Ig de chaque échantillon à l’aide de la formule du sérum : sérum concentration Ig = concentration du bien sélectionnée x facteur de dilution.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tracer les graphes et effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel approprié9,10,11. Faire des diagrammes de dispersion verticale de sérum niveaux isotype Ig pour comparer les réponses de Ig à l’instant même. Pour les études de réponse mémoire TD, faire les courbes de réponse de temps pour examiner les réponses d’isotype Ig avant et après la vaccination de rappel. Barres d’erreur permet d’afficher l’écart-type (SD) de chaque groupe d’échantillons. Pour comparer les réponses isotype Ig entre deux génotypes de souris, utiliser le test de non-appariés t pour données bilatéral afin de déterminer la signification statistique. Définissez la valeur de p < 0,05 sensiblement différents.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Nous décrivons ici le protocole pour la caractérisation des réponses d’isotype TD et TI Ig chez la souris à l’aide d’ELISA. Mise en œuvre réussie de ce protocole nécessite l’emploi de matériaux spécifiés dans le tableau 1, y compris les plaques de dosage ELISA, vaccination Ags, anticorps de souris Ig isotype-spécifiques et standards. Il faut éviter d’utiliser des plaques de culture de tissus traitée pour ELISA. Les dilutions des normes et des échantillons de sérum devraient être faites en plaques non tra...

Les lymphocytes B sont le principal acteur dans l’immunité humorale et le seul type de cellules chez les mammifères qui sont capables de produire des anticorps, appelés également immunoglobulines (Ig)1,2. Les anticorps sécrétés par les lymphocytes B fournissent une formidable défense contre l’invasion des agents pathogènes par l’intermédiaire de divers mécanismes, y compris la neutralisation, opsonisation et activation du complément, conduisant à l’immunité protectrice3. Sécrétion d’anticorps par les lymphocytes B n’est possible qu’après la pleine activation des cellules B spécifiques, qui nécessite, en principe que deux distincts des signaux3. Signal 1 est relayé par une liaison directe de l’antigène (Ag) pour le récepteur des cellules B (BCR) exprimé à la surface de cellules naïves spécifiques B3. Selon la source de Signal 2, activation des lymphocytes B se divisent en dépendant du thymus (TD) ou de thymus-indépendants (TI)3,4. Une réaction antigène de TD, 2 Signal est fourni par apparenté CD4 helper (TH) les lymphocytes T activés, qui expriment CD154, le ligand pour le récepteur de costimulation CD40 exprimé sur les cellules de B1,2,3. Une réaction antigène de TI, Signal 2 vient de l’engagement des récepteurs Toll-like (TLR dans le cas type 1 TI Ag) ou réticulation étendue des RCO (dans le cas type 2 TI Ag) sur le B cellules3,4. Antigènes de TI (TI-1) de type 1 sont des ligands microbiennes du TLR, y compris bactériens lipopolysaccharides (LPS), l’ARN viral et microbienne ADN CpG4,5. Antigènes de TI (TI-2) de type 2 ont une structure très répétitive et sont en mesure de livrer prolongée et persistante de signalisation à la cellule de B par réticulation multiples de la RCO4,6. TI-2 antigènes sont les polysaccharides antipneumococciques et polysaccharidiques conjugués haptène6,7. Les TD et TI antigènes peuvent obtenir des réponses de IgM spécifiques de l’antigène robustes et peuvent également induire la production d’isotype commutation anticorps (IgG, IgA et IgE) avec l’aide apportée par l’antigène présentant des cellules (CPA) telles que les cellules dendritiques (CD)1 ,2,3. En outre, antigènes TD et de TI sont capables d’induire des réponses de la mémoire à l’aide de TTB, mais TD antigènes sont plus efficaces pour induire la mémoire cellulaire B génération3,8.
Dans le présent protocole, les réponses TD et TI Ig sont provoquées chez les souris par voie intrapéritonéale (i.p.) immunisation avec hémocyanine de patelle de 2,4,6-phényl-serrure d’antigènes conjugués haptène modèle (TNP-KLH) et PNT-polysaccharide (neutre, très ramifié et de masse élevée), respectivement9,10,11. Antigènes TD sont habituellement utilisés avec un adjuvant pour améliorer la production d’anticorps12. Ici, dans notre protocole, PNT-KLH est injecté à l’alun, un adjuvant couramment utilisé dans la vaccination études12. Autres exemples d’adjuvants qui peuvent être utilisés, complet ou incomplet de Freund (CFA ou IFA), monophosphoryl lipide A / dicorynomycolate de tréhalose (« Ribi » adjuvant) et CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. après l’immunisation, les sérums de souris sont récoltées à différents moments et anticorps PNT-spécifiques dans le sérum sont quantifiés à l’aide de Ig isotype-spécifiques enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.
ELISA est un axée sur la plaque qui est largement utilisé comme un outil de diagnostic en médecine et aussi comme outil d’analyse en recherche biomédicale15,16. Il est utilisé pour la détection et la quantification des analytes, y compris les anticorps, hormones, cytokines, chimiokines et divers antigènes, etc.. ELISA peut être effectuée dans différents formats, y compris direct, indirect, sandwich et concurrentiel ELISA15,16. En général, il s’agit de l’immobilisation de l’antigène sur une surface solide, habituellement, une plaque de Microplaque 96 puits, qui est incubée avec l’anticorps primaire. Après incubation, l’anticorps non lié est éliminé. Dans un ELISA direct, l’anticorps primaire est directement conjugué à une enzyme (généralement la peroxydase de raifort ou phosphatase alcaline), qui peut fendre un substrat chromogène pour produire un changement de couleur visible détecté par un instrument de détection de signal comme une spectrophotomètre15,16. En revanche, si un anticorps secondaire lié à l’enzyme est utilisé pour lier les anticorps primaire, alors cela est considéré comme un de15,ELISA indirect16. ELISA direct est plus rapide tandis que le test ELISA indirect est plus sensible15,16. Dans un "sandwich" ELISA, les plaques sont recouverts d’un anticorps de « capture » utilisé pour immobiliser l’antigène d’intérêt dans les échantillons, et puis l’antigène capturé peut être détectée par un autre anticorps « détection » dans une manière directe ou indirecte de15, 16. ELISA Sandwich offre une spécificité élevée étant donné que l’antigène est détecté par deux types d’anticorps de l’antigène. Dans un ELISA concurrent, la compétition s’établit entre l’antigène d’échantillon et l’antigène de la plaque de liaison pour la liaison à l’anticorps primaire, et puis la concentration de l’antigène dans l’échantillon est quantifiée par la mesure de la réduction du signal du substrat 15 , 16. ELISA concurrent peut être effectuée en utilisant le format direct ou indirect mentionné ci-dessus et est utile pour la détection des antigènes petits avec qu’un seul épitope15,16.
Des techniques alternatives pour la mesure des anticorps incluent radio-immunoessai (RIA),17de dosage par électrochimiluminescence (ECL) dosage et surface résonance plasmon (SPR). RIA a été le premier immuno-essai développé qui mesure la présence d’un antigène (ou anticorps) avec grande spécificité et une sensibilité à l’aide de réactifs radiomarquées18,19. Toutefois, en raison des préoccupations de toxicité radioactive, de coûts d’élimination, de conservation et de licences spéciales pour travailler avec des matériaux radioactifs, ELISA est un meilleur et plus pratique technique commun utilise20,21. ECL est un dosage très sensible dans lequel les réactions chimiluminescentes commencent à utiliser de l’électricité pour générer des espèces très réactives de précurseurs stables sur la surface d’une électrode et peuvent être utilisées pour mesurer la quantité d’analytes (tels que les antigènes ou les anticorps)22. Cependant, ECL nécessite un instrument spécial et est donc pas aussi largement utilisé comme ELISA23. SPR est un dosage direct qui peut être utilisé pour mesurer la fixation des ligands (e.g., anticorps) à immobilisé molécules (e.g., antigènes) sur un capteur à puce surface24. SPR détecte les interactions en temps réel très particulier et ne nécessite pas l’utilisation de réactifs marqués comme ELISA. Cependant, SPR nécessite un équipement spécial et a une sensibilité plus faible que ELISA17. Compte tenu des limites des méthodes alternatives, ELISA est la technique plus pratique et le plus appropriée pour notre but dans ce protocole. Nous décrivons ici l’utilisation du sandwich ELISA pour l’analyse des niveaux d’isotype Ig totales et les procédures de test ELISA indirect pour l’analyse des isotypes Ig spécifiques de l’antigène.

<table><tbody><tr><td>VersaMax Accordable Lecteur de microplaques</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>VERSAMAX</td><td>Équipement pour la lecture des plaques</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>Logiciel pour le lecteur de plaques</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>Logiciel pour la représentation graphique et les statistiques</td></tr><tr><td>TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL)</td><td>Biosearch Technologies</td><td>F-1300-10</td><td>A TI Ag pour l’immunisation</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5060-5</td><td>A TD Ag pour l’immunisation</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (rapport de conjugaison : 38)</td><td>Coating Ag pour ELISA spécifique</td></tr><tr><td>au TNP TNP(3)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (rapport de conjugaison : 3)</td><td>Coating Ag pour l’alun Ig Imject spécifique au TNP de haute affinité</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>PI-77161</td><td>Adjuvant à l’alun pour l’immunisation</td></tr><tr><td>Falcon Tubes en polypropylène</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-959-11A</td><td>Pour l’incubation de la seringue à insuline TNP-KLH/alun</td></tr><tr><td>BD</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-829-1B</td><td>Pour l’injection intraveineuse de souris</td></tr><tr><td>Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-245-61</td> Pour microplaques <td>non traitées ELISA</td></tr><tr><td>à 96 puits, fond rond</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>Pour les dilutions en série d’étalons et d’échantillons</td></tr><tr><td>Substrat de phosphatase, 5 mg Comprimés</td><td>Sigma</td><td>S0942-200TAB</td><td>Substrat AP</td></tr><tr><td>Diéthanolamine</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>Un composant du tampon de substrat AP</td></tr><tr><td>IgM anti-souris de</td><td>chèvre SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>Capture Ab pour souris IgM</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>Capture Ab pour souris IgG1</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>Capture Ab pour souris IgG2a</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>Capture Ab pour souris IgG2b</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>Capture Ab pour souris IgG3</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>Capture Ab pour souris IgA</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris</td><td>IgE SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>Capture Ab pour souris IgE</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-souris IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>Détection Ab pour souris IgM</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-souris IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>Détection Ab pour souris IgG1</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-souris IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>Détection Ab pour souris IgG2a</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-souris IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>Détection Ab pour souris IgG2b</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-souris IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>Détection Ab pour souris IgG3</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-souris</td><td>IgA SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>Détection Ab pour souris IgA</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-souris IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>Détection Ab pour souris IgE</td></tr><tr><td>de souris IgM standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>IgM spécifique au TNP, Clone&nbsp ; G155-228</td></tr><tr><td>IgG1 de souris standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>IgG1 spécifiques au TNP, clonenbsp ; 107.3</td></tr><tr><td>IgG2a de souris standard</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>IgG2a spécifiques au TNP, clone&nbsp ; G155-178</td></tr><tr><td>IgG2b de souris standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>IgG2b spécifiques au TNP, clones&nbsp ; 49.2</td></tr><tr><td>IgG3 de souris standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>IgG3 spécifiques à KLH, clone&nbsp ; A112-3</td></tr><tr><td>IgA de souris standard</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>IgA induites par l’huile minérale, clone MOPC-320</td></tr><tr><td>IgE de souris standard</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>IgE spécifiques au TNP, clone&nbsp ; C38-2</td></tr></tbody></table>

caractérisation des thymus-dépendants et indépendants de thymus immunoglobuline isotype réponses chez la souris à l’aide d’enzyme-linked immunosorbent assay

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Anticorps, appelés également comme différencient d’immunoglobulines (Ig), sécrétées par les lymphocytes B, plasmablasts/plasmocytes, immunité humorale fournissent une formidable défense contre l’invasion des agents pathogènes par l’intermédiaire de divers mécanismes. Un objectif majeur de la vaccination est d’induire des anticorps spécifiques de l’antigène protecteurs pour prévenir les infections mortelles. Les antigènes de thymus-indépendants (TI) et dépendant du thymus (TD) peuvent obtenir des réponses de IgM spécifiques de l’antigène robustes et peuvent également induire la production d’isotype commutation anticorps (IgG, IgA et IgE) ainsi que la production de cellules B mémoire à l’aide fourni par antigène présentant des cellules (CPA). Nous décrivons ici un protocole afin de caractériser les réponses d’isotype TD et TI Ig chez la souris à l’aide de dosage immuno-enzymatique (ELISA). Dans le présent protocole, les réponses de TD et TI Ig sont provoquées chez les souris par voie intrapéritonéale (i.p.) immunisation avec des antigènes conjugués haptène modèle PNT-KLH (dans l’alun) et PNT-polysaccharide (PBS), respectivement. Pour induire la réponse mémoire TD, une vaccination de rappel du TNP-KLH dans l’alun est donnée 3 semaines après la première vaccination avec le même antigène/adjuvant. Sérums de souris sont récoltées à des moments différents avant et après la vaccination. Total sérique Ig et anticorps spécifiques PNT sont ensuite quantifiées à l’aide "sandwich" de Ig isotype-spécifiques et test ELISA indirect, respectivement. Afin de correctement quantifier la concentration sérique de chaque isotype Ig, les échantillons doivent être convenablement diluée pour s’adapter au sein de la gamme de linéarité des courbes standards. Utilisant ce protocole, nous avons toujours obtenu des résultats fiables avec sensibilité et une spécificité élevée. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec d’autres méthodes complémentaires tels que la cytométrie en flux, in vitro culture spléniques des cellules B et immunohistochemical souillant (IHC), ce protocole permettra aux chercheurs d’acquérir une compréhension globale des anticorps réponses dans un cadre expérimental donné.

Nous avons utilisé ce protocole pour enquêter sur le rôle d’un régulateur essentiel du système immunitaire, TRAF3, TI et TD Ig isotype réponses9,10,11. TRAF3 directement ou indirectement réglemente la transduction des signaux d’un certain nombre de récepteurs immunitaires innées et adaptatives, y compris de la superfamille des récepteurs TNF, récepteurs Toll-like et T cell receptor/CD28, entre au...

Dans cet article, nous décrivons un protocole afin de caractériser les T-dépendants et indépendants de T les réponses isotype immunoglobuline (Ig) chez la souris à l’aide d’ELISA. Cette méthode utilisée seule ou en combinaison avec écoulement cytometry permettra aux chercheurs d’identifier les différences dans les réponses d’isotype Ig médiée par les lymphocytes B chez les souris après vaccination antigène T-dépendants et indépendants de T.

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie sur les réponses dépendantes et indépendantes des anticorps induites par l’immunisation antigénique, ainsi que sur l’activation des lymphocytes B et les réactions du centre germinal. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des mesures fiables et quantitatives de la réponse isotypique des Ig avec une comparaison directe de l’activation des lymphocytes B et de l’immunité humorale chez la souris. Pour l’immunisation TNP-polysaccharide, chargez une seringue d’insuline d’un millilitre par souris avec 100 microlitres de solution d’antigène fraîchement préparée et insérez l’aiguille dans le quadrant inférieur droit de chaque animal à un angle d’environ 30 degrés pour éviter l’injection dans l’organe inférieur.Lorsque toutes les souris ont été injectées, retournez les animaux dans leurs cages pour les loger dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes. Aux points expérimentaux appropriés, prélever 150 à 200 microlitres de sang de chaque animal immunisé par saignement rétro-orbitaire et laisser les échantillons coaguler à température ambiante pendant une à deux heures. À la fin de l’incubation, centrifugez les échantillons de sang coagulé et transférez le sérum clair du haut de chaque caillot sanguin dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre.Après une deuxième centrifugation pour éliminer tout caillot sanguin résiduel, transférez 50 microlitres de sérum dans des tubes à microcentrifuger stériles individuels de 1,5 millilitre pour un stockage à moins 80 degrés Celsius. Avant le placage, enrober les immunoplaques individuelles à 96 puits avec la concentration appropriée d’anticorps capturants spécifiques de l’isotype d’Ig de souris pour l’isotype d’Ig sérique total de l’antigène TNP-38BSA pour l’isotype d’Ig spécifique de TNP ou de l’antigène TNP-3BSA pour l’isotype d’Ig spécifique de TNP de haute affinité et incuber les plaques enrobées pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les plaques deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage par puits.Jetez le tampon de lavage et séchez les assiettes en tapotant sur une pile de serviettes en papier après chaque lavage. Ensuite, bloquez les plaques avec 200 microlitres de tampon de blocage par puits pour une incubation d’une heure à température ambiante. Pendant que les plaques sont bloquées, préparez l’étalon approprié, les dilutions sériques et le tampon de blocage dans une plaque séparée non traitée à 96 puits à 150 microlitres par puits, comme indiqué.Ensuite, lavez la plaque ELISA avec un tampon de lavage comme démontré et ajoutez 100 microlitres de chaque étalon d’isotype d’Ig dilué et échantillon de sérum dans les puits appropriés de la plaque ELISA. Après une nuit d’incubation à quatre degrés Celsius, laver les plaques comme démontré et ajouter 100 microlitres d’un anticorps spécifique isotype conjugué à la phosphatase alcaline appropriée dilué dans un tampon de blocage dans chaque puits pour une incubation d’une à deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les plaques et ajoutez 100 microlitres de solution de substrat fraîchement préparée dans chaque puits.Surveiller la réaction au fur et à mesure qu’elle se développe au cours des prochaines minutes à température ambiante. Lorsque la réaction est suffisamment robuste pour être analysée, placez la plaque dans un lecteur de microplaques et cliquez sur les paramètres pour régler la longueur d’onde à 405 nanomètres. Cliquez sur OK puis sur le modèle pour attribuer les puits vierges, standard et inconnus appropriés selon la configuration de la plaque de 96 puits.Ensuite, lorsque l’étalon le plus concentré atteint une densité optique d’environ un, 1,5, deux et 2,5, cliquez sur lire pour lire la plaque et enregistrer le fichier de données résultant après chaque analyse. En l’absence d’immunisation, une augmentation des taux sériques basaux d’IgM, d’IgG2a, d’IgG2b, d’IgG3 et d’IgA est observée chez les souris du facteur trois associé au récepteur du TNF spécifique des lymphocytes B ou chez les souris knock-out B-TRAF3, par rapport aux animaux témoins témoins de portée suffisante pour le récepteur B-TRAF3 appariés. Sept jours après l’administration par le polysaccharide TNP ou le TNP-KLH, comme cela vient d’être démontré, l’analyse des réponses isotypiques des Ig indépendantes du thymus à l’immunisation révèle des taux significativement plus élevés d’IgG3 spécifiques du TNP indépendants du thymus ainsi que des niveaux élevés d’IgG2b spécifiques du TNP dépendants du thymus chez les souris knock-out TRAF3 spécifiques aux cellules myéloïdes par rapport aux témoins de la portée.De plus, l’évaluation des réponses primaires et de la mémoire des souris dépendantes du thymus à l’immunisation TNP-KLH indique la présence de réponses primaires IgM dépendantes du thymus partiellement diminuées et de réponses primaires et mémoires IgG1 défectueuses chez les souris knock-out TRAF3 spécifiques des lymphocytes T. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les ELISA ont des limites de détection qui sont généralement définies par la plage linéaire des courbes standard et que, par conséquent, plusieurs dilutions de votre échantillon peuvent être nécessaires. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes complémentaires telles que la cytométrie en flux ou le point L peuvent être effectuées pour obtenir une compréhension complète des réponses des anticorps dans un cadre expérimental donné.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Mesure des taux d’immunoglobulines G par rapport à un vaccin test dans un sérum de souris

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Ce rapport fournit une description détaillée de la transplantation de thymi murin de souris donneuses de différents âges sous la capsule rénale de receveurs de souris immunodéficientes. L’objectif de cette approche est de modéliser le développement des lymphocytes T et les événements de sélection thymique in vivo.

L&#39;isolement et la transplantation de différents âgées murins thymiques greffes.

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Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Cet article décrit une méthodologie in vivo et in vitro pour caractériser les progéniteurs de sédimentation thymique par l’analyse de la cinétique de génération, du phénotype et du nombre de leur descendance de lymphocytes T.

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

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Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

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Identification de lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans des poumons de souris avec un peptide : tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité

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Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Vidéo) | JoVE Journal

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