Name: Un dosage de la Virulence bactérienne rapide basé sur une Image à l’aide d’amibe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Découvrez un dosage rapide de la virulence bactérienne basé sur l'imagerie utilisant l'amibe D. discoideum comme hôte. Cette méthode quantitative permet d'évaluer l'effet létal sur l'hôte en une heure.

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KP et AS a écrit et révisé le manuscrit. KP effectué les expériences et l’analyse. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) Bourse de Transition de carrière (K22AI112816) à As.

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées à l’Université de Californie, Irvine.
1. tampons et Solutions
<ol><li>Préparer, lysogénie bouillon (LB) dans un flacon de verre de 1 L en ajoutant 25 g de mélange de LB-Miller dans 1 L d’eau bidistillée (ddH2O). Pour boîtes de Pétri, ajouter une supplémentaire 20 g d’agar. Autoclave pour stériliser. Verser 25 mL de milieu gélosé fondu dans Pétri de 10 cm de diamètre et laisser pour solidifier à température ambiante. Stocker des milieux liquides à température ambiante et les boîtes de gélose à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer les assiettes de Glucose levure Peptone (GYP) dans un flacon de verre de 1 L en mélangeant 1 g de D-glucose, extrait de 2 g de peptone, 0,25 g de levure, 4,2 g de KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47 H2O et 25 g d’agar dans 1 L de ddH2 O. Autoclave pour stériliser. Verser 25 mL d’agar fondu dans Pétri de 10 cm de diamètre et laisser pour solidifier à température ambiante. Conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer des moyen de Peptone S (PS) dans un flacon de verre de 1 L en mélangeant 10 g de peptone, extrait de 7 g de levure, 15 g de D-glucose, 0,12 g de Na2HPO47 H2O, 1,4 g de KH2PO4, 40 µg de vitamine B12 , et 80 µg d’acide folique dans 800 mL de ddH2O. calibrer un pH-mètre électronique à l’aide de pH 4 et les normes de pH 7 si le pH-mètre n’a pas été utilisé en une journée.<ol>
<li>Mesurer le pH du milieu PS pH-mètre. Ajouter 5 M KOH ou 5 M H3PO4 pour ajuster le pH à 6,5. Ajuster le volume final de 1 L à l’aide de ddH2filtre O. stériliser à l’aide de filtres sous vide de 0,22 µm et conserver à 4 ° C. NOTE : Procéder avec prudence avec les ajustements de pH en portant des équipements de protection y compris les gants, vêtements de protection, protection des yeux et visage protection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 10 x premier tampon développement (DB') tampon non contrôlé dans une bouteille de verre de 1 L en ajoutant 3,4 g de KH2PO4, 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O et FD2O à un volume total de 800 mL. Calibrer un pH-mètre électronique à l’aide de pH 4 et les normes de pH 7 si le pH-mètre n’a pas été utilisé en une journée.<ol>
<li>Mesurer le pH de la mémoire tampon en utilisant le pH-mètre électronique. Ajuster le pH à 6,5 en ajoutant doucement 5 M KOH ou 5 M H3PO4 selon les besoins. Ajuster le volume final à 1 L avec les ddH2O et stériliser à l’autoclave. Conserver à température ambiante. NOTE : Procéder avec prudence avec les ajustements de pH en portant des équipements de protection y compris les gants, vêtements de protection, protection des yeux et visage protection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire 1 x tampon de développement (DB) en mélangeant 100 mL de 10 x DB' tampon avec 1 mL de stérilisé de MgCl 2 M2, et 1 mL de stérilisé 1 M CaCl2. Ajuster le volume final de 1 L dans un flacon de verre de 1 L en utilisant un autoclave ddH stérilisé2O. magasin à la température ambiante.</li>
	<li>Préparer PS:DB milieu dans un flacon de verre de 1 L en mélangeant 100 mL de milieu stérilisé de PS, 100 mL de stérilisé 10 x DB' tampon et stérilisé ddH2O pour un volume total de 1 L. supplément avec 1 mL de stérilisé de MgCl 2 M2 et 1 mL de stérilisé 1 M CaCl 2. conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer la solution mère de calcéine-AM en ajoutant 50 µL de DMSO à 50 µg de calcéine-AM dans le récipient en plastique fourni par le fabricant. Conserver à-20 ° C.</li>
</ol>2. croissance et le maintien des amibes
<ol><li>Cultiver la souche e. coli b/r17 comme source de nourriture pour les amibes pendant la période de croissance initiale. Strie Escherichia coli b/r d’un stock congelé conservés à-80 ° C sur une gélose LB et incuber à 37 ° C pendant la nuit pour obtenir des colonies individuelles.</li>
	<li>Ensemencer une seule colonie d' Escherichia coli b/r dans 2 mL de milieu LB et incuber dans un tambour de rouleau ou un shaker à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Porter la nuit culture d’e. coli à la température ambiante. À l’aide d’un bâton en bois, ensemencer les amibes provenant d’un stock de surgelés conservés à-80 ° C à 750 µL de la culture au jour le jour. Remarque : Utilisation d. discoideum la souche AX3, qui est capable de croissance axénique18. Cette étape ne nécessite pas de croissance axénique, mais les étapes suivantes auront son exigence.</li>
	<li>Immédiatement ajouter 700 µL du mélange amibes -e. coli sur une plaque de Glucose levure Peptone (GYP). Diffuser la culture uniformément sur la surface de la plaque en l’inclinant et-avant-arrière et gauche-droite au besoin. Éviter l’usage d’un épandeur.</li>
	<li>Placer la plaque GYP avec agar vers le haut dans une boîte qui maintient une humidité élevée. Utiliser deux contenants de plastique jetables (183 x 183 cm x 91 cm) empilés sur le dessus de l’autre. Remplir le réservoir de bas d’environ 25 mL d’eau et placer le récipient supérieur avec plusieurs 0,5 cm de diamètre trous percés dans le plancher du conteneur pour que l’humidité vers le réservoir d’eau le récipient supérieur.</li>
	<li>Incuber la plaque GYP et boîte à 22 ° C pendant 4 à 5 jours jusqu'à ce que les spores de l’amibe, on observe de plus en plus près de la surface de la plaque (Figure 2). Utiliser un incubateur réfrigéré pour Incuber les plaques plutôt que l’incubation à température ambiante. Remarque : Après que les spores ont augmenté, ils restent viables sur plaques pendant plusieurs semaines, lorsqu’il est conservé à 4 ° C. Ranger les plaques côté agar vers le haut. Après 3-4 jours d’incubation, les zones de compensation dans la pelouse bactérienne peuvent être observés, qui indiquent le début de la sporulation amibe.<ol>
<li>Observer les amibes petites spores au-dessus de la surface de la plaque après 4-5 jours d’incubation (Figure 2). Remarque : Ne poussent pas les amibes pendant plus d’une semaine, diminution de la qualité des spores au-delà de cette période de temps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir des spores d’amibes pour préparer la croissance axénique des amibes en balayant une pointe de pipette stérile de 1 mL parallèle à la surface de la plaque. Recueillir des spores de la moitié d’une boîte de Pétri de 10 cm. Remarque : Ne pas toucher l’extrémité de la surface de la gélose que cette proposition permettra de recueillir un grand nombre d’Escherichia coli.</li>
	<li>Remettre en suspension les amibes sur l’embout de la pipette en plongeant la pointe dans 1 mL de milieu de PS et doucement pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Transférer le mélange inoculé dans un flacon de 250 mL contenant 25 mL de milieu PS complété avec la solution antibiotique-antimycosiques à 0,25 x concentration. NOTE : Stocker la solution antibiotique-antimycosique comme 250 µL d’extraits à-20 ° C. Éviter les cycles répétés de dégel et le gel de cette solution, car cela peut diminuer son efficacité.</li>
	<li>Cultiver les amibes axéniques à 22 ° C dans un agitateur rotatif à 100 tr/min. Pour le test de virulence à l’étape 5, la croissance de cellules à une densité optique mesurée à 600 nm (OD600) de 0,2 à 0,5. Remarque : Cette étape nécessite 3-4 jours de croissance entre le moment de l’inoculation (étape 2.7). Si les cellules ont atteint une densité plus élevée, diluer la culture en milieu de PS à une OD600 ou inférieure à 0,05 et poussent à une OD600 de 0,2 à 0,5.</li>
</ol>3. la croissance de P. aeruginosa
<ol><li>Prélever une colonie unique de P. aeruginosa sur un plat de livre, il ensemencer une culture PS:DB de 2 mL et poussent en une nuit à 37 ° C à saturation. Remarque : Ne pas ajouter la solution antibiotique-antimycosiques aux médias PS:DB.</li>
	<li>Diluer la nuit culture au 1/100 ou 1 : 1 000 dans une boîte de Pétri 6 cm de diamètre à l’aide de PS:DB. Si la virulence des cellules planctoniques est uniquement être dosée, poussent les cultures à l’aide de tubes de culture conventionnelle à la place. Secouez la culture sur un rotateur de benchtop fixé à 100 tr/min à 37 ° C.</li>
	<li>Récolter les cultures à des moments spécifiques pour assurer la reproductibilité. À 30 min à 1 h avant d’évaluer la virulence, préparer un tampon agar comme décrit dans la section 4. Remarque : La Virulence chez P. aeruginosa est induite par environ 8 h de croissance sur les surfaces.</li>
	<li>Pour isoler les cellules attachées à la surface, retirer le milieu liquide de la boîte de Pétri, se laver immédiatement avec 1 mL de tampon de DB pour éliminer les cellules planctoniques et passez immédiatement à l’étape 5.1. ATTENTION : Ne pas laver à plus de 30 s comme cela va perturber et détacher les non-inscrits sur la surface des cellules et peuvent influer sur la mesure de la virulence.</li>
	<li>Pour isoler les cellules planctoniques, transférer 10 µL de la culture de la boîte de Pétri dans une boîte de Petri propre et passez immédiatement à l’étape 5.1.</li>
</ol>4. microscopie - préparation de la garniture de Agar
<ol><li>Préparer les coussinets agar environ 30 min à 1 h avant amibes sont prêts à être mélangés avec P. aeruginosa.</li>
	<li>Cuire au four 50 mL de gélose de 1 % (p/v) dans le tampon de la DB dans un ballon jaugé de 250 mL. Mélanger toutes les 20 s jusqu’en touffes d’agar disparaissent.</li>
	<li>Refroidir l’agar fondu en le plaçant dans le bain-marie préchauffé à 55 ° C pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 15 µL de la solution mère de calcéine-AM à 15 mL de l’agar fondu dans un tube à fond conique. Mélanger en retournant doucement le tube le 4 - 5 fois et passer immédiatement à l’étape suivante. Remarque : Exécutez cette étape dans un tube à centrifuger en polypropylène 15 mL. Ne pas utiliser un récipient en verre épais car cela provoquerait l’agar pour solidifier trop rapidement.</li>
	<li>Verser le mélange agar fondu sur le dessus une plaque de verre de 12 cm x 10 cm et laisser l’agar pour solidifier pendant 10 minutes à température ambiante. Couper le bloc de gélose solidifiée en plus petites sections de 1,5 x 1,5 cm en plaçant la plaque de verre sur une grille imprimée et coupe le long de la grille à l’aide d’une règle métallique.</li>
	<li>Garder le gel hydraté dans une boîte humide jusqu'à ce qu’il est prêt à l’emploi.</li>
</ol>5. microscopie - préparation de l’échantillon de bactéries-amibe pour l’imagerie
<ol><li>Pour doser la virulence des non-inscrits sur la surface des cellules bactériennes, ajouter 10 µL de cellules amibe de l’étape 2.10 à bactéries attachées à la surface de l’étape 3.4. Remarque : Cette étape décrit le mélange des amibes par des bactéries.</li>
	<li>Pour doser la virulence des cellules planctoniques, mélanger 10 µL de cellules amibe de l’étape 2.10 avec 10 µL de bactéries planctoniques de l’étape 3.5. Remarque : Ne pas laver les cellules cultivées axéniques amibe (à une OD600 de 0,2 à 0,5) avant de les mélanger avec les bactéries. Aucune croissance d’e. coli ne sera observée dans la culture de l’amibe en raison de l’utilisation de la solution antibiotique-antimycosiques.</li>
	<li>Placer immédiatement le tampon d’agar calcéine-AM 1,5 x 1,5 cm de l’étape 4.5 sur le mélange de bactéries-amibe sur la surface de la boîte de Pétri. Remarque : Placez agar sur le mélange à l’aide d’un rapide mouvement souple. N’abaissez pas le coussinet lentement sur le mélange que ce mouvement tend à pousser les cellules vers la périphérie et loin sous le coussin. Cette étape fera en sorte que les bactéries et les amibes sont uniformément mélangés, immobilisé et que les deux types de cellules sont confinés à un même plan.</li>
	<li>Retirer le liquide en excès par pipetage doucement sur n’importe quel liquide restant entourant le bloc de gélose. Laissez la boîte de Pétri sécher pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Couvrir avec la boîte de Pétri avec un couvercle et laisser incuber le mélange de bactéries-amibe immobilisé à température ambiante pendant une supplémentaire 40 min. passez à l’étape 6.1. Remarque : Il est important d’Incuber tous les échantillons pendant le même laps de temps, comme les augmentations de fluorescence de fond au fil du temps. Une durée d’incubation de 1 h est recommandée. Incubation pendant plus de 1 h est moins reproductible que les cellules amibes peuvent commencent à éclater.</li>
</ol>6. microscopie - Acquisition d’images
<ol><li>Amibes d’image à l’aide d’un microscope à fluorescence capable d’acquérir des images de fluorescence de fond clair et vert. Pour la fluorescence verte, utiliser des filtres de protéine (GFP) de fluorescence verte avec 474/27 nm et 525/45 nm pour l’excitation et d’émission, respectivement. Utilisez un objectif de (ouverture numérique ≥0.3) X 10 afin d’imager les amibes. Remarque : La calcéine-AM dans la gélose entraînera amibes mourants à fluorescence dans le chenal de fluorescence verte. Amibes sains sont par ailleurs pas fluorescents.</li>
	<li>Ajuster le temps d’acquisition pour le contraste de phase, canaux GFP pour limiter la phototoxicité et optimiser la plage dynamique de l’intensité de l’image. Remplacez par le contraste de phase (DIC) de contraste interférentiel différentiel si nécessaire. Remarque : Utilisez les expositions de 100 à 200 ms pour contraste de phase et fluorescence GFP si possible. Garder les paramètres d’exposition et instrument inchangés tout au long de l’expérience entière. Cela est essentiel pour le calcul de l’index de mise à mort d’hôte.</li>
	<li>Acquisition d’images au moins 100 cellules d’amibe afin d’obtenir de bonnes statistiques pour le calcul de l’hôte index de mise à mort.</li>
</ol>7. analyse et hôte Index de mise à mort de l’image
<ol><li>Effectuer l’analyse d’images à l’aide de ImageJ.</li>
	<li>Ouvrez le fichier d’image de contraste phase dans ImageJ en cliquant sur fichier | Ouvrir et en sélectionnant l’image. Régler le seuil en cliquant sur Image | Analyse | Seuil de. Ajustez le seuil inférieur et supérieur pour sélectionner uniquement le pic d’intensité (Figure 3A).</li>
	<li>Convertir l’image binaire en cliquant sur processus | Binaire | Rendre le binaire. Remplissez les trous en sélectionnant processus | Binaire | Remplir les trous. Remarque : L’utilisation de l’image dans la Figure 1 comme source, étapes 7,1 à 7,2 produira une image dans laquelle les amibes et les non-inscrits sur la surface des bactéries apparaissent comme des régions sombres (Figure 3B).</li>
	<li>Vérifiez que les cases zone et gris valeur moyenne sont cochées dans Analyze | Définir des mesures. Mesurer la taille approximative des amibes en sélectionnant l’outil ovale sur la barre d’outils principale. Cliquez analyser | Mesure et notez la zone d’amibes représentatifs.</li>
	<li>Créer des masques pour les amibes en cliquant Analyze | Analyser les particules. Dans la zone taille, entrer dans la zone qui inclura les amibes sans exclure les bactéries. Sélectionner des masques dans la barre de menu déroulant pour l' option de montrer. Assurez-vous que la case Ajouter au Manager est cochée.</li>
	<li>Cliquez sur OK et une image montrant seulement les amibes et un gestionnaire de ROI, boîte de dialogue apparaîtra (Figure 3C).</li>
	<li>Ouvrez l’image de fluorescence à l’aide de fichier | Ouvrir et en sélectionnant le fichier approprié. Sélectionnez toutes les régions dans le Gestionnaire de ROI en maintenant la touche Maj enfoncée et en cliquant sur chaque région dans la liste (Figure 3D).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton de mesure dans le Gestionnaire de ROI. Cela ouvrira une fenêtre de résultats affiche la valeur de la densité moyenne de chaque amibe.</li>
	<li>Copier les valeurs de fluorescence pour chaque amibe dans un tableur et calculer l’hôte tuant indice en calculant la moyenne de toutes les valeurs de fluorescence.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode rapide et quantitative pour doser la virulence chez P. aeruginosa. Ce protocole peut être testé avec d’autres bactéries. Toutefois, il est important de garder à l’esprit que le milieu de croissance doit être compatible avec les conditions de croissance d’amibe. En particulier, nous avons optimisé le protocole en utilisant PS:DB comme le milieu de croissance bactérienne. Si les autres médias sont utilisés, il peut être nécessaire d’effectuer un contrôle de croissance de médias uniq...

Infection bactérienne est l’une des principales causes de mortalité chez l’homme et les animaux1,2. La capacité de mesurer la virulence des bactéries dans des cultures ou des biofilms est importante dans les milieux de soins de santé et de la recherche. Nous décrivons ici une méthode relativement simple, rapide et polyvalent pour quantifier la virulence bactérienne. L’organisme eucaryote Dictyostelium discoideum (amibes) est utilisé comme organisme modèle hôte. D. discoideum a été utilisé comme un hôte pour identifier les facteurs de virulence Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 et autres bactéries6,7 ,8 et est susceptibles d’être en grande partie les mêmes facteurs de virulence qui tuent les cellules mammifères, y compris le type III sécrétion9,10. Précédents essais de virulence à l’aide de d. discoideum ont impliqué une exposition prolongée des bactéries aux cellules de d. discoideum au cours des heures3,4,5. Le protocole, ici, présente une méthode rapide de détermination de virulence à l’aide de cette amibe. Ce protocole (Figure 1) décrit comment faire pour : (1) poussent les amibes axéniques (en l’absence de bactéries), (2) développer des bactéries pour le dosage, (3) préparer des bactéries et cellules de l’hôte pour la microscopie, (4) effectuent la microscopie à épifluorescence et (5) analysent amibe fluorescence.
Amibes sont initialement striées sur des stocks congelés et cultivés sur une pelouse d' Escherichia coli (e. coli), où les amibes produisent des spores. Ces spores sont cueillies et inoculés dans un milieu enrichi de croissance axénique. Les amibes sont maintenues grâce à une croissance axénique dans des conditions nutritives jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être mélangés avec les bactéries pour l’évaluation de la virulence bactérienne. La survie ou la mort des amibes est quantifiée par la mesure de la fluorescence de calcéine-acétoxyméthyl (calcéine-AM), qui est clivé par les estérases intracellulaires et, ainsi, activé pour fluorescence11,12. Direct amibes présentent peu ou pas de fluorescence qu’a souligné et cellules mourantes réagissent en intensément. Ce résultat est dû à l’incorporation de petite ou pas de calcéine-AM dans les amibes sains et l’incorporation et le clivage du substrat dans les amibes stressé13. Ce comportement diffère notamment de fluorescence de calcéine-AM dans les cellules de mammifères11,14,15,16.
Les bactéries qui seront évaluées pour la virulence sont cultivés séparément. Ici, nous décrivons comment mesurer la virulence de l’agent pathogène opportuniste de P. aeruginosa et détailler comment quantifier la virulence des planctonique (natation) et attaché à la surface de certaines sous-populations. Ce protocole peut être adapté pour tester la virulence d’autres bactéries. Dans la section résultats de représentant, nous montrons que la virulence est activé dans les cellules attachées à la surface et est faible dans les cellules planctoniques, qui a été rapporté précédemment13. Activé par virulence rattaché au surface P. aeruginosa tue amibes alors que non virulentes cellules planctoniques sont consommés par les amibes. Si la virulence des bactéries planctoniques est uniquement être analysée, les bactéries peuvent être cultivées dans des tubes à culture ordinaire plutôt que d’utiliser des boîtes de Pétri comme décrit dans le protocole.
La croissance des amibes et P. aeruginosa cultures doit être coordonnée, tel que les cultures P. aeruginosa atteint la phase de croissance prévue, tandis que les amibes sont de plus en plus à l’état stable dans des conditions de nutriments. Cette condition nécessite généralement des cultures d’amibes à diluer au moins 1 jour avant lorsqu’ils sont mélangés avec des bactéries. Les amibes et bactéries sont immobilisées à l’aide de tampons de gélose, sont conjointement mis en incubation pendant 1 h et imagés à l’aide d’une faible résolution (10 X, ouverture numérique 0,3) filtres de protéine de fluorescence objective, verte (GFP) et une caméra d’imagerie. Analyse peut être effectuée à l’aide disponible gratuitement logiciel ImageJ ou personnalisées logiciel analyse d’images. Notre analyse a été réalisée à l’aide de nos propres logiciels écrits à l’aide d’une analyse scientifique paquet13. Le logiciel devrait créer un masque à l’aide de l’image de contraste de phase et extraire des valeurs de fluorescence des zones masquées à l’image de fluorescence. Valeurs de fluorescence sont en moyenne sur au moins 100 cellules, ayant pour résultat un index de mise à mort d’hôte numérique.

<table><tbody><tr><td><Réactifs forts></forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gélose Bacto, déshydratée</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquote < 1 mL et conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Ester de calcéine-acétoxyméthyle (calcéine-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Acétoxyméthyle de calcéine (AM)</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Acide folique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Peptone spécial</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Hyroxyde de potassium</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamine B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td><fortes>souches</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn</td><td>souche AX318</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Souche B/r17</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 souche19</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &Delta ; lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>Dérivé du PA14 souche20</td></tr><tr><td>Fournitures</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro ; Filtre M&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>Pour la stérilisation par filtre</td></tr><tr><td>Tube conique, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles de stockage en verre</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, 6 cm de diamètre</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm Plaques de polystyrène</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, 10 cm de diamètre</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm Plaques de polystyrène</td></tr><tr><td>Récipients en plastique avec couvercle</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Récipients carrés de 3 tasses</td></tr><tr><td>Plaques en verre</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>Pour la préparation de tampons de gélose. D’autres plaques de verre peuvent être utilisées avec des dimensions similaires.</td></tr><tr><td>Bâtons en bois</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td><Équipement></td><td></td><td></td><td></td>/</tr><tr><td>Microscope Eclipse Ti-Efort&nbsp ;</td><td>Configuration</td><td>du microscope</td><td>MEA53100</td></tr><tr><td>Nikon 10X Plan Fluor Ph1 objectif&nbsp ; 0.3 NA</td> Configuration du <td>microscope</td><td>MRH20101</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Source d’excitation de fluorescence</td><td>Moteur de lumière Lumencor Sola</td><td>Configuration du microscope</td><td></td></tr><tr><td>Jeu de filtres de fluorescence</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&nbsp ;</td><td>Configuration du microscope</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Caméra</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Configuration du microscope</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Logiciel pour l’analyse d’images</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Logiciel pour l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Incubateur à agitateur orbital</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Pour la croissance des bactéries à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Agitateur à plate-forme</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>Pour la croissance des amibes à 22 &deg ; C</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur réfrigéré sous comptoir</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>Pour la croissance des amibes à 22 &deg ; C</td></tr><tr><td>Bain-marie Isotemp&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Pour refroidir les fluides à 55 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

un dosage de la virulence bactérienne rapide basé sur une image à l’aide d’amibe

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Les dosages traditionnels de la virulence bactérienne impliquent une exposition prolongée des bactéries au cours de plusieurs heures pour les cellules de l’hôte. Pendant ce temps, bactéries peuvent subir des changements dans la physiologie en raison de l’exposition à l’environnement de croissance d’hôte et la présence de cellules hôtes. Nous avons mis au point un test permettant de mesurer rapidement l’état de la virulence des bactéries qui réduisent au minimum l’étendue à laquelle les bactéries se développent en présence de cellules de l’hôte. Les bactéries et les amibes sont mélangés et immobilisés sur un seul plan d’imagerie à l’aide d’un tampon d’agar. La procédure utilise imagerie de fluorescence monocellulaires avec calcéine-acétoxyméthyl ester (calcéine-AM) comme indicateur de la santé de cellule hôte. La fluorescence des cellules de l’hôte est analysée après 1 h d’exposition des cellules hôtes aux bactéries à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Logiciel d’analyse image est utilisée pour calculer un index de mise à mort d’hôte. Cette méthode a été utilisée pour mesurer la virulence dans planctoniques et attaché à la surface Pseudomonas aeruginosa sous-populations durant le stade initial de la formation de biofilm et peuvent être adaptées à d’autres bactéries et autres stades de croissance de biofilm. Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable de mesurer la virulence et évite beaucoup des complexités liées à la croissance et le maintien des lignées cellulaires de mammifères. Phénotypes de résistance mesurées ici à l’aide d’amibes ont également été validés à l’aide de macrophages de souris. En particulier, ce test a été utilisé pour établir cette virulence augmente de surface pièce jointe chez P. aeruginosa.

Nous avons grandi sauvage souche de P. aeruginosa PA1419 ou un ΔlasR souche20 dans le même contexte de PA14 en Pétri de 6 cm de diamètre et dosé la virulence des cellules planctoniques et attaché à la surface. Les cultures ont été inoculés de single-colonies à PS:DB cultures, du jour au lendemain en tubes de culture dans un fût de rouleau à 37 ° C à saturation, dilué au 1/100 en PS:DB, cultivés pendant 8 h en 6 cm de diamèt...

Nous présentons ici un protocole visant à mesurer la virulence de bactéries planctoniques ou attaché à la surface à l’aide de d. discoideum (amibes) en tant qu’hôte. Virulence est mesurée sur une période de 1 h et hôte tuant est quantifiée à l’aide de fluorescence microscopie et analyse d’images. Nous démontrons ce protocole à l’aide de la bactérie P. aeruginosa.

Un dosage de la Virulence bactérienne rapide basé sur une Image à l’aide d’amibe

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogenèse bactérienne, telles que : quand les effecteurs de virulence tueurs de l’hôte sont-ils exprimés dans les cellules bactériennes, et quels sont les états de virulence des cellules implantoniques attachées à la surface ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, quantitative et que les cellules hôtes sont relativement faciles à manipuler. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que la sous-population implantonique de Pseudomonas attachée à la surface a différents phénotypes de destruction de l’hôte.Pour commencer, cultivez la souche BR d’E.coli pendant la nuit, comme indiqué dans le protocole de texte. Amenez ensuite la culture d’E. coli à température ambiante. À l’aide d’un bâtonnet en bois, inoculez l’amibe dans 750 l de la culture.Ajouter immédiatement 700 l du mélange d’amibes E.coli dans une assiette GYP. Inclinez la plaque pour répartir la culture uniformément sur la surface de la plaque. Placez ensuite l’assiette dans une boîte qui maintient une humidité élevée.Incuber l’assiette à l’intérieur de la boîte à 22 °C pendan

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Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

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Essai d’essaimage pour la visualisation de la motilité de surface bactérienne

Source : Chen, Y., et al. Évaluation de la virulence et de la pathogenèse de l’infection par Aeromonas dans un modèle de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo présente le test de toxicité liquide de C. elegans avec Aeromonas, une méthode utilisée pour évaluer la virulence bactérienne en mesurant la survie des vers dans un environnement liquide limité en nutriments. Le test révèle une pathogénicité spécifique à la souche basée sur l’étendue des dommages et de la mortalité...

Évaluation de la virulence bactérienne à l’aide du test de toxicité liquide de C. elegans

Source : Perinbam, K., et Siryaporn, A. Un test rapide de virulence bactérienne basé sur l’image, utilisant des amibes. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre une méthode rapide basée sur l’image pour évaluer la virulence bactérienne en incubant des amibes avec des bactéries attachées à la surface ou planctoniques, en appliquant un coussinet d’agarose calcéine-acétoxyméthyl (calcein-AM), et en imageant la fluorescence pour détecter les dommages aux cellules hôtes.

Un test rapide basé sur l’image pour le dépistage de la virulence bactérienne induite par la surface

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

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Cette technique fournit une méthode pour récolter, normaliser et quantifier la croissance intracellulaire des bactéries pathogènes qui sont pré-cultivées dans les cellules hôtes naturels protozoaires avant infections de cellules de mammifères. Cette méthode peut être modifiée pour accueillir une grande variété de cellules hôtes pour la phase d'amorçage, ainsi que les types de cellules cibles.

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Coculture amibienne est un système de culture cellulaire en utilisant des amibes adhérente à croître sélectivement les pathogènes intracellulaires capables de résister à des cellules phagocytaires telles que les amibes et les macrophages. Il représente donc un outil essentiel pour découvrir de nouveaux agents infectieux. Enrichissement amibienne permet de découvrir de nouvelles espèces amibienne et de leurs bactéries intracellulaires spécifiques.

Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement

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Une stratégie rapide pour l&#39;isolement des nouveaux Faustoviruses d&#39;échantillons environnementaux Utilisation<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

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Quantification d’Acanthamoeba spp. Motilité

Découvrez un dosage rapide de la virulence bactérienne basé sur l'imagerie utilisant l'amibe D. discoideum comme hôte. Cette méthode quantitative permet d'évaluer l'effet létal sur l'hôte en une heure.

Un dosage de la Virulence bactérienne rapide basé sur une Image à l’aide d’amibe

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