Un dosage de la Virulence bactérienne rapide basé sur une Image à l’aide d’amibe

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogenèse bactérienne, telles que : quand les effecteurs de virulence tueurs de l’hôte sont-ils exprimés dans les cellules bactériennes, et quels sont les états de virulence des cellules implantoniques attachées à la surface ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, quantitative et que les cellules hôtes sont relativement faciles à manipuler. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que la sous-population implantonique de Pseudomonas attachée à la surface a différents phénotypes de destruction de l’hôte.

Pour commencer, cultivez la souche BR d’E.coli pendant la nuit, comme indiqué dans le protocole de texte. Amenez ensuite la culture d’E. coli à température ambiante. À l’aide d’un bâtonnet en bois, inoculez l’amibe dans 750 l de la culture.

Ajouter immédiatement 700 l du mélange d’amibes E.coli dans une assiette GYP. Inclinez la plaque pour répartir la culture uniformément sur la surface de la plaque. Placez ensuite l’assiette dans une boîte qui maintient une humidité élevée.

Incuber l’assiette à l’intérieur de la boîte à 22 °C pendant quatre à cinq jours. Une fois la période d’incubation terminée, utilisez une pointe de pipette stérile pour recueillir des spores d’amibes sur la moitié de la plaque. Ensuite, pipetez de haut en bas pour remettre l’amibe en suspension sur la pointe de la pipette dans 1 ml de milieu PS.

Transférez le mélange d’inoculat dans une fiole de 250 mL avec 25 mL de milieu PS complété par une solution antimicotique antibiotique. Cultivez l’amibe à 22 °C dans un agitateur rotatif à 100 tr/min. Après avoir cultivé Pseudomonas aeruginosa pendant la nuit, diluez la culture avec un milieu PSB dans une boîte de Pétri de 6 cm.

Ensuite, agitez la culture sur un rotateur de paillasse réglé à 100 tr/min à 37 °C.Passez d’abord au micro-ondes 50 ml de gélose à 1 % dans un tampon DB dans une fiole de 250 ml. Ajoutez 15 L de calcium AM aux 15 ml de gélose fondue et mélangez délicatement. Versez le mélange de gélose fondue dans une plaque de verre de 12 x 10 cm et laissez la gélose se solidifier pendant dix minutes à température ambiante.

Ensuite, utilisez une règle en métal et une grille imprimée pour couper le tampon gélosé solidifié en petites sections de 1,5 x 1,5 cm. Assurez-vous que le gel reste hydraté jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Ensuite, pour isoler les cellules attachées à la surface, retirez le milieu liquide de la boîte de Pétri.

Lavez ensuite la parabole avec 1 mL de tampon de développement pour éliminer les cellules planctoniques. Pour mesurer la virulence des cellules bactériennes attachées en surface, ajoutez 10 L de cellules d’amibes à partir des cellules bactériennes attachées en surface précédemment obtenues. Pour isoler les cellules planctoniques, transférez 10 L de la culture dans une boîte de Pétri fraîche.

Ensuite, testez la virulence des cellules planctoniques en mélangeant 10 L de cellules d’amibes avec les bactéries planctoniques précédemment obtenues. Placez immédiatement le petit tampon de gélose sur le mélange d’amibes bactériennes approprié sur la surface de la boîte de Pétri. Ensuite, retirez l’excès de liquide en pipetant doucement tout excès de liquide et laissez sécher le plat pendant 20 minutes.

Couvrez le plat avec le couvercle et incubez-le à température ambiante pendant 40 minutes supplémentaires. Enfin, utilisez un microscope à fluorescence pour acquérir des images d’au moins 100 cellules d’amibes. Dans ce protocole, la virulence des cellules planctoniques et de Pseudomonas aeruginosa attachées à la surface a été mesurée.

Pseudomonas aeruginosa de type sauvage attaché à la surface, indiqué par une forme de cellule d’amibe ronde et la présence d’une fluorescence de calcéine. Par rapport aux cellules planctoniques, le type sauvage attaché à la surface, Pseudomonas aeruginosa, avait un indice de destruction de l’hôte élevé. Les cellules planctoniques ont été consommées par l’amibe, comme l’indiquent les formes amorphes des cellules de l’amibe et la fluorescence relativement faible de la calcéine.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser un stock frais de calcéine AM et de cellules amibes et de surveiller de près la densité optique des amibes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage de transcription peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : Quels gènes sont activés dans les sous-populations planctoniques et attachées à la surface ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser le test de virulence rapide basé sur l’image.