Name: Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Apprenez à préparer des larves de Drosophila pour l'analyse métabolomique par GC-MS. Cette méthode permet de mesurer directement plus de 100 métabolites de manière sensible et reproductible.

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Merci aux membres de la Indiana University Mass Spectroscopy Facility et l’Université de l’Utah métabolomique Core Facility d’assistance dans l’optimisation de ce protocole. J.M.T. est pris en charge par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R35GM119557.

1. collecte des œufs
<ol><li>Recueillir des adultes mâles et femelles vierges des génotypes désirées. L’âge individuellement ces animaux dans un flacon de nourriture avec des supports de Bloomington standard pour 3 à 5 jours.</li>
	<li>Mettre en place les accouplements appropriés en transférant 50 femelles vierges et 25 hommes un nouveau flacon de nourriture. NOTE : Un minimum de six accouplements indépendants devrait être mis en place pour chaque génotype. On recueillera seulement un échantillon de chaque croisement (c.-à-d. six échantillons prélevés sur six des accouplements indépendants).</li>
	<li>
Préparer les casquettes de Ponte de mélasse.
	<ol>
<li>Mélangez 115 mL de mélasse et 29 g de gélose avec 700 mL H2O dans un flacon de 2 L.</li>
		<li>Faire bouillir la mélasse mélange agar sur une plaque chauffante.</li>
		<li>Laisser refroidir à 70 ° C.</li>
		<li>Ajouter 25 mL d’acide mix (20 mL d’acide phosphorique à 85 % et l’acide propionique 209 mL dans 1 L de H2O ; Entreposer dans une bouteille brune) et 10 mL d’ester méthylique de l’acide p-hydroxy-benzoïque 10 % dans l’éthanol à 95 %.</li>
		<li>Verser l’agar de mélasse en partie le couvercle et le fond d’un plat de vitroplants de2 35 x 10 mm. Remarque : Avant de verser de mélasse plaques d’agar, n’oubliez pas que les couvercles et/ou de la base de la plaque de2 35 x 10 mm ExacTen dans la bouche d’une solution concentrée de drosophile (décrite dans l’étape 1.6). Selon la marque de plaques utilisées, la base ne peut pas être utilisable.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire le pâte en ajoutant de l’eau distillée de levure fraîche active levure sèche (5 g levure/7 mL d’eau) jusqu'à ce que le mélange devient une pâte qui peut se propager facilement sur une surface solide (c.-à-d., la consistance du beurre d’arachide).</li>
	<li>Étaler environ 1,5 g de pâte de levure sur la surface d’une calotte de Ponte de mélasse.</li>
	<li>Introduisez les quatre trous d’air dans les côtés opposés d’un plastique 6 oz Drosophila solution concentrée à l’aide d’une aiguille de 22 G.</li>
	<li>Transférer les mouches accouplées nouvellement dans le flacon de nourriture dans les flacons de culture. Remarque : Les mouches peuvent être transférés en soit à l’aide de CO2 comme anesthésique temporaire ou en tenant le haut du flacon dans la bouche de la bouteille et en tapant fortement le fond de la bouteille contre un sur table.</li>
	<li>Placer rapidement une casquette de Ponte de mélasse avec la pâte de levure sur la surface dans la bouche d’une solution concentrée de drosophile . Bande de laboratoire permet de fixer le capuchon de ponte en place. Remarque : Si les mouches ont été anesthésié avant le transfert, la bouteille devrait figurer horizontalement sur la table jusqu'à ce que toutes les mouches sont rétablis. Une fois que les mouches sont entièrement mobiles, placer le flacon dans un incubateur avec le capuchon de Ponte de mélasse au bas de la culture.</li>
	<li>Replacer le capuchon de Ponte de mélasse au moins une fois par jour pour les deux premiers jours en inversant la solution concentrée, touchant le fond de la bouteille contre la paillasse, enlevant l’ancienne PAC oeuf et plaçant immédiatement un nouveau capuchon de l’oeuf dans la bouche de la bouteille. Jeter le vieux chapeau de ponte. Remarque : Cette étape garantit que les femmes ne tiennent pas leurs oeufs et autorise collection des populations synchronisées.</li>
	<li>Placer un nouveau capuchon de ponte dans la solution concentrée après day 3, remplacer après 2 h et le jeter. Enlever et reboucher la deuxième Ponte après quatre heures. L’étiquette au bas de cette casquette de ponte avec la date, l’heure et le génotype. Remarque : Les œufs récoltés au cours de cette fenêtre 4 h servira pour l’analyse. Cette étape de synchronisation est critique pour analyser des stades de développement spécifiques. Œufs peuvent être collectées de cette manière pendant plusieurs jours.</li>
	<li>Insérer les bouchons de ponte en un Pétri de 60 x 15 mm2 et les placer dans un incubateur à la température et l’humidité.</li>
	<li>Inspecter les capuchons des pontes tous les jours pour des problèmes avec la famine, de la densité de population ou de contamination. Remarque : Les larves doivent avoir accès à une nourriture suffisante pour assurer un développement continu. Si nécessaire, la pâte de levure fraîche peut se propager sur tous les bouchons de ponte qui seront utilisés dans l’expérience. En outre, si la densité de la population larvaire est trop élevée, les larves commencera à se promener hors de la plaque de culture. Ces échantillons ne doivent pas être utilisés pour l’analyse de la métabolomique, parce que la forte densité de population et les épisodes intermédiaires de famine expérimentés tout en errant seront traduira par des données incohérentes. Une densité d’environ 80 à 100 moyen deuxième stade larvaire (L2) par plaque ou 40 – 50 milieu troisième stade larvaire (L3) par plaque est recommandé. Les échantillons qui sont visiblement contaminés par des bactéries ou des champignons doivent être jetés.</li>
</ol>2. prélèvement de l’échantillon larvaire
<ol><li>Âge des larves jusqu’au stade désiré. Si collecte les larves L3, resynchroniser les échantillons à la mue de L2 – L3. Resynchronisation est couramment réalisée en utilisant une méthode décrite précédemment qui utilise les stigmates antérieures comme une étape importante du développement de15. Alternativement, mi-L3 larves peuvent être synchronisées à l’aide d’un de gène de journaliste sgs3 16. Remarque : À cet égard, nous trouvons mi-L2 larves (~ 60 h après la ponte) sont parfaitement adaptés pour la plupart des analyses parce qu’à ce stade, le développement larvaire est encore relativement synchrone, échantillons soigneusement recueillis ont une nourriture suffisante pour développer à ce validant, ainsi que la nombre d’animaux par exemple est gérable (voir ci-dessous). Une étape de synchronisation supplémentaire est nécessaire pour les larves L3 car les impulsions de l’ecdysone nombreux qui se produisent au cours du développement de L3 ont des effets dramatiques sur le métabolisme et généreront des artefacts dans les populations non synchronisées.</li>
	<li>Utiliser une aiguille dissection pour soulever doucement la pâte de levure au large de la gélose. Placer la levure sur un nouveau capuchon de gélose de mélasse. Remarque : La plupart des larves mangeront à l’interface entre l’agar de mélasse et de la pâte à levure.</li>
	<li>Utilisez un petit pinceau pour recueillir les larves de la surface nouvellement exposée de l’agar de mélasse. Placez les larves dans un tube à centrifuger 1,5 mL sur la glace. Remarque : Les tailles d’échantillon appropriée pour chaque stade de développement sont les suivants : 50 premier stade larvaire (L1) ; 25 mi-L2 larves ; larves L3 début 20 ; 15-L3 de milieu ou fin larves L3.</li>
	<li>Laver et congeler les échantillons (étapes 2,3 à 2,8) par petits lots (quatre à six échantillons) tout en rassemblant un ensemble de grands échantillons. Les échantillons doivent être congelés à 20 min de placer des larves dans les tubes. Remarque : Nous vous recommandons d’utiliser Eppendorf 1,5 mL Tubes Flex car les autres tubes risquent d’interférer avec le transfert de l’échantillon à l’étape 3. Échantillons doivent être prélevés dans des microtubes. Ne pas prélever des échantillons dans les tubes de perle décrits à l’étape 3.1. Perles en céramique conservent la solution de lavage de NaCl, qui se traduit par des mesures de masse inexactes et introduit des contaminants dans l’échantillon.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de glacee 0,9 % NaCl dans le tube, fermer le couvercle et verticalement flip le tube à fond pour laver les larves.</li>
	<li>Placer le tube de retour sur la glace pour ~ 30 s. Pendant ce temps, les larves vont couler au fond du tube, mais levure restera en suspension. Une fois que toutes les larves ont formé une boulette de lâche, enlever la solution de NaCl à l’aide d’une pipette de 1 mL.</li>
	<li>Répétez les étape 2.4 et 2.5 deux fois, ou jusqu'à ce que la solution de lavage final est clair. Remarque : Pas de lavage supplémentaire peuvent être nécessaires si l’échantillon contient une quantité excessive de la levure.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 2 000 × g pendant 1 min à 4 ° C.</li>
	<li>Enlever toute la solution résiduelle à l’aide d’une pipette de 200 µL.</li>
	<li>Congeler immédiatement l’échantillon dans l’azote liquide. Remarque : Le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillons peuvent être conservés jusqu'à 3 mois à-80 ° C.</li>
</ol>3. transférer les échantillons aux perles Tubes
<ol><li>Chaque échantillon de larve doit être transférée dans le tube de microtubes de 1,5 mL à un bouchage des tubes 2 mL contenant les billes en céramique de 1,4 mm. En préparation de cette étape de transfert, utilisez un marqueur de l’éthanol à l’épreuve pour marquer le côté d’un tube de perles de bouchage de 2 mL (marquage sur le couvercle sera détruit au cours de l’étape 4.4).</li>
	<li>Tarer la masse du tube perle étiquetés à l’aide d’une balance analytique permettant de mesurer avec précision 0,01 mg.</li>
	<li>Si les échantillons de larves ont été conservés à-80 ° C, placer les tubes échantillon en avant de l’azote liquide pour transférer.</li>
	<li>Pince longue permet de retirer le tube d’échantillon de 1,5 mL de l’azote liquide dewar.</li>
	<li>Porter des gants de nitrile, prenez la gelée tube, inverser, puis enfoncez fortement le couvercle du tube contre la paillasse pour déloger le culot congelé. Versez immédiatement le culot dans un tube de perles de bouchage préalablement taré 2 mL. Si la pastille ne parvient pas à déloger, retournez le tube à l’azote liquide et répétez. NOTE : Boulettes de larves ne seront pas déloger de toutes les microtubes. Si vous utilisez un tube autre que celle recommandée, déterminer si granulés larvaires peuvent se détacher avant le prélèvement d’échantillons pour analyse.</li>
	<li>Rapidement mesurer la masse totale du tube granule et perle larvaire. Placer immédiatement le tube échantillon dans l’azote liquide. Le culot de larve masse sera utilisé pour normaliser les données de la métabolomique. Remarque : Le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillons peuvent être conservés jusqu'à 3 mois à-80 ° C.</li>
</ol>4. Extraction de l’échantillon
<ol><li>Placer les tubes à échantillon dans un banc de-20 ° C plus froide.</li>
	<li>Ajouter 0,8 mL de méthanol à 90 % prérefroidies (-20 ° C) contenant 2 µg/mL d’acide succinique-d4 dans chaque tube. Retourner l’échantillon à la paillasse de-20 ° C plus frais. Remarque : L’acide succinique-d4 sert comme étalon interne. Utilisez uniquement la HPLC grade H2O et le méthanol. Étant donné que le méthanol et autres solvants organiques sont instables et difficiles à mesurer avec précision à l’aide de pipettes de déplacement d’air, nous recommandons d’utiliser des pipettes à déplacement positif pour cette étape et toutes les étapes suivantes.</li>
	<li>Mettre en place un contrôle négatif en ajoutant 0,8 mL de méthanol à 90 % prérefroidies (-20 ° C) contenant 2 µg/mL d’acide succinique-d4 dans un tube à vide perle.</li>
	<li>Homogénéiser les échantillons pendant 30 secondes à 6,45 m/s en utilisant un homogénéisateur de moulin de perle située dans une salle de contrôle de température de 4 ° C. NOTE : Échec d’homogénéiser les rapidement et complètement le culot larvaire est une source commune de variabilité dans l’analyse de la métabolomique. Utilisez uniquement les homogénéisateurs qui sont capables de détruire congelés tissus larvaires dans les 30 s.</li>
	<li>Retourner les tubes échantillons homogénéisés à-20 ° C applications refroidisseur et les incuber dans un congélateur à-20 ° C pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 20 000 × g ou maximum vitesse pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer le précipité obtenu.</li>
	<li>Transférer 600 µL du liquide surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Ne pas déranger le précipité. Si la pastille précipitée devient délogée lors de pipetage le surnageant, renvoyer tous les surnageant au tube et répétez l’étape 4.6.</li>
	<li>Placer les tubes échantillon dans une centrifugeuse sous vide. N’oubliez pas que tous les tubes sont ouverts avant de sceller la centrifugeuse. Sécher les échantillons à la température ambiante jusqu'à l’élimination de tous les solvants (cette étape prend habituellement environ 16 h pour terminer). Remarque : Si nécessaire, le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillon séché peut être conservé à-80 ° C.</li>
</ol>5. chimique dérivatisation
<ol><li>Si les échantillons séchés ont été conservés à-80 ° C, placer les tubes échantillon non ouverte dans une centrifugeuse vide et sécher pendant 30 min. Cette étape doit être exécutée avant l’ouverture du tube à essais. Remarque : Cette étape supprime la condensation qui recueille à l’extérieur du tube microtubes lorsque retirés du congélateur. Cette partie du protocole est extrêmement sensible aux H2O et précautions supplémentaires doivent être adoptées pour garder tous les réactifs aussi sèches que possible.</li>
	<li>
Préparer une solution de chlorhydrate de methoxylamine 40 mg/mL (MOX) dans la pyridine anhydre. N’utilisez que la pyridine anhydre. Stocker les MOX et la pyridine dans un dessicateur et préparez la solution de MOX de tous les jours. ATTENTION : MOX et la pyridine sont toxiques. Préparer cette solution sous la hotte.<ol>
<li>Utiliser un pistolet à air chaud pour sécher une seringue de verre de 1 mL.</li>
		<li>Insérer l’aiguille de la seringue dans le flacon de pyridine anhydre. Prélever 1 mL de pyridine et ajouter à un tube à centrifuger contenant 40 mg de MOX.</li>
		<li>Vider la bouteille de pyridine anhydre avec argon. Sceller la bouteille et retourner dans le dessiccateur.</li>
		<li>Dissoudre le MOX dans la pyridine en incubant le tube dans un mélangeur thermique à 35 ° C pendant 10 min à 600 tr/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 40 µL de MOX de 40 mg/mL dans une solution de pyridine anhydre à l’échantillon séché.</li>
	<li>Vortexer pendant 10 s et centrifuger brièvement (10 000 x g pendant 20 s).</li>
	<li>Incuber à 30 ° C pendant 1 h à 600 tr/min dans un mélangeur thermique.</li>
	<li>Centrifuger à vitesse maximale pendant 5 min retirer les particules de matière ou de 20 000 × g .</li>
	<li>Transférer 25 µL de liquide surnageant dans un flacon pour échantillonneur automatique avec un insert de microvolume verre 250 µL désactivé.</li>
	<li>Ajouter 40 µL de N- méthyl -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) contenant 1 % TMCS. ATTENTION : MSTFA est toxique. Effectuez cette étape sous la hotte. Remarque : S’il est disponible, cette étape peut être complétée par un échantillonneur automatique Gerstel.</li>
	<li>Placer un bouchon sur l’auto-échantillonneur et sceller à l’aide d’un outil de sertisseur.</li>
	<li>Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure avec agitation (250 tr/min).</li>
	<li>Préparer une solution d’acide gras méthyl ester standard (FAMES) comme précédemment desceribed3. Ajouter 3 µL de FAMES dans le flacon pour échantillonneur automatique à l’aide d’un échantillonneur robotique immédiatement avant l’injection. Remarque : Les FAMEs sont utilisés pour calibrer le décalage de temps de rétention et de vérifier les performances de l’instrument. Si aucun échantillonneur automatique robotique n’est disponible, les FAMEs peuvent être ajoutés au cours de l’étape 5.8.</li>
</ol>6. GC-MS détection
Remarque : Dans la plupart des cas, l’utilisateur effectuera cette étape avec l’assistance d’un laboratoire central de la spectroscopie de masse. Ce protocole est conçu pour être utilisé avec un 30 m, colonne GC avec une colonne de garde de 5 m.
<ol><li>Randomiser l’ordre de l’échantillon.</li>
	<li>
Préparer la GC-MS.
	<ol>
<li>Régler la vitesse d’écoulement de gaz hélium porteur à 1 mL/min.</li>
		<li>Régler la température d’entrée à 250 ° C.</li>
		<li>Programme de la GC à exécuter le gradient de température suivant :<ol>
<li>Température initiale à 95 ° C, avec une cale de 1 min.</li>
			<li>Augmenter la température à 110 ° C à raison de 40 ° C/min avec une cale de 2 min.</li>
			<li>Augmenter à 250 ° C en rampe de 5° C/min.</li>
			<li>Augmenter à 330 ° C à raison de 25 ° C/min avec un maintien finale de 4 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>La valeur délai solvant 3,5 min. Remarque : La durée peut être modifiée selon le système de la GC-MS. Cette étape vise à empêcher MSTFA et MOX d’endommager le détecteur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecter 1 µL de l’échantillon de dérivés dans la GC-MS (split ratio de 10:1). NOTE : Injecter 2 µL de l’échantillon, si l’intensité des pics est trop faible. L’ordre d’injection des échantillons devrait être randomisé.</li>
	<li>Exploiter le spectromètre de masse en mode balayage complet sur une gamme de masses de 50 à 500 m/z.</li>
</ol>7. analyse de données
<ol><li>Analyser les données de métabolomique en utilisant soit une approche ciblée ou non ciblée. Analyse ciblée est axée sur la mesure de l’abondance d’un ensemble défini de métabolites, comme les mesures de lactate que nous décrivons ci-dessous. En revanche, l’analyse non ciblée utilise une approche impartiale afin d’identifier toute caractéristique métabolique qui est significativement changée entre deux ensembles d’échantillons. NOTE : Notre laboratoire utilise principalement les programmes gratuits MetAlign17 MetaboAnalyst18,19 pour l’analyse des données. Comme une description adéquate de la contrôle de la qualité, normalisation et étapes de traitement des données sont au-delà de la portée de ce manuscrit, nous renvoyons l’utilisateur à des protocoles plus détaillés qui sont consacrées au traitement des données20,21, 22. En outre, un diagramme qui décrit les étapes requises pour cette analyse se trouvent ailleurs8.</li>
</ol>

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<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li>
<li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+%28pre-%29processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+inference+of+biological+patterns%2C+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li>
<li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Métabolomique fournit une occasion sans pareille d’arpenter les réactions métaboliques qui composent le métabolisme intermédiaire. La sensibilité de cette technologie, toutefois, restitue des données sensibles au bagage génétique, les indices du développement et une variété de contraintes environnementales, y compris la température, l’humidité, la densité de population et la disponibilité des nutriments. Par conséquent, une haute qualité et reproductibles métabolomique analyse exige que les échantillons soient recueillie...

La drosophile Drosophila melanogaster est apparu comme un système idéal pour étudier les mécanismes moléculaires qui régulent le métabolisme intermédiaire. Non seulement la plupart des voies métaboliques conservées entre la drosophile et les humains, mais capteurs en éléments nutritifs principaux et régulateurs de croissance, comme l’insuline, Tor et myc, sont également actifs dans la mouche1,2. En conséquence, drosophile peut servir à explorer la base métabolique de maladies allant du diabète et l’obésité neurodégénérescence et du cancer. À cet égard, le développement larvaire de Drosophila offre le cadre idéal étudier un programme métabolique appelé glycolyse aérobie, ou l’effet Warburg. A l’instar de plusieurs tumeurs utilisent glycolyse aérobie pour générer la biomasse provenant des glucides, donc pour faire Drosophila larves activent la glycolyse aérobie afin de promouvoir la croissance du développement3,4,5. Ces similitudes entre les larves et le métabolisme de tumeur établir la drosophile comme modèle clé pour comprendre comment aérobie glycolyse est réglementé en vivo.
Malgré le fait que la mouche s’est imposé comme un modèle populaire pour étudier le métabolisme, la plupart des études de drosophile s’appuient sur des méthodes qui sont conçus pour mesurer différents métabolites3, tels que le tréhalose, triglycérides ou ATP. Puisqu’un protocole spécifique est requise pour mesurer chaque métabolite, études sur le dosage sont fastidieux, coûteux et préjugé en faveur de ces composés qui peuvent être mesurés à l’aide de trousses commerciales. Une solution à ces limitations a émergé dans le domaine de la métabolomique, qui fournit un moyen plus efficace et impartial d’étudier le métabolisme de la drosophile . Contrairement à une étude axée sur l’analyse, une analyse unique métabolomique peut simultanément mesure des centaines de métabolites de petites molécules et fournit une compréhension globale de l’organisme un état métabolique6,7. Cette technique a considérablement élargi la portée des études métaboliques de drosophile et représente l’avenir de ce nouveau champ8.
Métabolomique sont principalement menées à l’aide de trois technologies : (i) résonance magnétique nucléaire (RMN), (ii) liquide chromatographie spectrométrie de masse (LC-MS) et (iii) chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)9. Chaque approche propose des inconvénients et des avantages distincts, et toutes ces technologies ont été utilisées pour étudier avec succès le métabolisme de drosophile . Étant donné que les recherches effectuées dans notre laboratoire se concentre sur les métabolites petits, polaires, nous utilisons principalement une méthode basée sur le GC-MS. GC-MS fournit à l’utilisateur avec un certain nombre d’avantages, notamment une grande reproductibilité, résolution maximale, la sensibilité, et de la disponibilité d’une bibliothèque spectrale standard electron impact (IE), qui permet l’identification rapide des découvertes métabolique caractéristiques10,11. La préparation des échantillons pour GC-MS, cependant, est quelque peu complexe et nécessite une attention minutieuse aux détails. Échantillons doivent être recueillies, lavés, pesés et congelés d’une manière qui apaise rapidement les réactions métaboliques. En outre, la carcasse mouche résiste aux protocoles standard de l’homogénéisation et nécessite un moulin à billes afin d’assurer l’extraction optimale de métabolite. Enfin, les échantillons analysés par GC-MS doivent subir dérivatisation chimique avant la détection12. Alors que les méthodes publiées antérieurement décrivent toutes ces étapes de13,3,14, un protocole visuel qui permettrait à l’utilisateur novice de façon reproductible générer des données de haute qualité est encore nécessaire. Nous démontrons comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS. Ce protocole permet à l’utilisateur de façon reproductible mesurer beaucoup des petits métabolites polaires qui composent le métabolisme carboné central.

<table><tbody><tr><td>Mélasse noire non soufrée</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Méthoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA avec 1 % de triméthylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann' s Levure sèche active</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille de 6 oz pour drosophile</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Mélange d’homogénéisation des tissus mous (tubes de 2 mL)&nbsp ;</td><td>Omni International</td><td>SKU :19-627</td><td></td></tr><tr><td>Insert de flacon, 250 & micro ; L verre désactivé avec pieds en polymère</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Acide succinique-2,2,3,3-d4</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&nbsp ;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Acide phosphorique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Acide propionique</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy benzoïque acide méthyle</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU :19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur MultiTherm avec un bloc de 24 X 12 mm</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm Boîte de culture tissulaire</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>colonne GC</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (gc-ms)-base de métabolomique

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Les progrès récents dans le domaine de la métabolomique ont établi la drosophile Drosophila melanogaster comme un puissant modèle génétique pour étudier le métabolisme des animaux. En combinant la vaste gamme d’outils génétiques drosophile avec la possibilité d’arpenter les grandes étendues du métabolisme intermédiaire, une approche métabolomique peut révéler des interactions complexes entre diet, génotype, événements démographiques et des signaux environnementaux. En outre, les études métabolomiques peuvent découvrir de nouveaux mécanismes enzymatiques et découvrir jusque-là inconnues des connexions entre les voies métaboliques apparemment disparates. Afin de faciliter une utilisation plus répandue de cette technologie auprès de la communauté de drosophile , ici, nous fournissons un protocole détaillé qui décrit comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)- base d’analyse de la métabolomique. Notre protocole inclut des descriptions de prélèvement d’échantillons de larves, d’extraction de métabolite, dérivatisation chimique et analyse par CPG-SM. La réussite de ce protocole permettra aux utilisateurs de mesurer l’abondance relative des petits métabolites polaires, y compris les acides aminés, sucres et acides organiques impliqués dans la glycolyse et les cycles TCA.

Lactate déshydrogénase (dLDH) des mutants qui n’ont pas d’activité dLDH4et témoins du même génétiquement ont été recueillis sous forme de larves de milieu-L2 et traitées selon le protocole décrit ci-dessus. Par rapport aux témoins, mutants larves présentent des changements significatifs en lactate et pyruvate L-2-hydroxyglutarate4. Les spectres ont été acquises avec un système d’Agilent GC6890-5973i MS. Un exemple des spectres GC-MS...

Ce protocole décrit comment préparer des larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS.

Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme, telles que la synthèse de l’oncométabolite L2-hydroxyglutarate dans les cellules saines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à l’utilisateur de mesurer directement plus de 100 métabolites de manière sensible et reproductible. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le protocole nécessite un traitement efficace des échantillons et est extrêmement sensible à la vapeur d’eau.Pour commencer le protocole, ajoutez un millilitre de chlorure de sodium glacé à 0,9 % dans un tube de 1,5 millilitre contenant des larves préalablement préparées. Fermez le couvercle, retournez verticalement le tube pour bien laver les larves et placez le tube sur de la glace pendant 30 secondes. Les larves couleront au fond du tube, mais la levure restera en suspension.Une fois que toutes les larves ont formé une pastille lâche, prélever la solution de chlorure de sodium à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Centrifuger les échantillons à 2 000 g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Retirez toute la solution résiduelle à l’aide d’une pipette de 200 microlitres et congelez immédiatement l’échantillon dans de l’azote liquide.Utilisez un marqueur résistant à l’éthanol pour étiqueter le côté d’un tube à billes à vis de deux millilitres. Ensuite, tarez la masse du tube à billes étiqueté à l’aide d’une balance analytique capable de mesurer avec précision 0,01 milligramme. À l’aide d’une longue pince, retirez le tube d’échantillon de 1,5 millilitre du dewar d’azote liquide.En portant des gants en nitrile, saisissez le tube congelé, retournez-le et martelez brusquement le couvercle du tube contre le dessus de la paillasse pour déloger la pastille congelée. Versez immédiatement le granulé dans un tube à billes à bouchon à vis de deux millilitres pré-taré. L’échantillon doit être traité rapidement pour s’assurer que les voies métaboliques endogènes ne sont pas réactivées.Mesurez rapidement la masse combinée de la pastille larvaire et du tube de perle. Placez immédiatement le tube d’échantillon dans de l’azote liquide. Placez les tubes d’échantillon dans une glacière de paillasse à moins 20 degrés Celsius.Ajoutez 0,8 millilitre de méthanol pré-refroidi à 90 % contenant deux microgrammes par millilitre d’acide succinique-D4 dans chaque tube. Remettez les échantillons dans la glacière de paillasse à moins 20 degrés Celsius. Mettez en place un contrôle négatif en ajoutant 0,8 millilitre de méthanol pré-refroidi à 90 % contenant deux microgrammes par millilitre d’acide succinique-D4 dans un tube à billes vide.Ensuite, homogénéisez les échantillons pendant 30 secondes à 6,45 mètres par seconde à l’aide d’un homogénéisateur de broyeur à billes situé dans une salle de contrôle de température de quatre degrés Celsius. Remettez les échantillons homogénéisés dans la glacière de paillasse à moins 20 degrés Celsius et transférez la glacière dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après l’incubation, centrifugez les tubes à 20 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer le précipité résultant.Transférez 600 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et ne dérangez pas le précipité. Ouvrez tous les tubes d’échantillon et placez-les dans une centrifugeuse à vide. Séchez les échantillons à température ambiante jusqu’à ce que tout le solvant soit éliminé.Si les échantillons séchés ont été conservés à moins 80 degrés Celsius, placez les tubes d’échantillon non ouverts dans une centrifugeuse sous vide et séchez-les pendant 30 minutes. Préparez une solution de 40 milligrammes par millilitre de chlorhydrate de méthoxylamine, ou MOX, dans de la pyridine anhydre. Stockez le MOX et la pyridine dans un dessiccateur.Ensuite, utilisez un pistolet thermique pour sécher une seringue en verre d’un millilitre pendant environ cinq secondes. Insérez l’aiguille de la seringue dans le flacon de pyridine anhydre. Prélevez un millilitre de pyridine et ajoutez-le dans un tube microfuge contenant 40 milligrammes de MOX.Cette partie du protocole est extrêmement sensible à l’eau. Tous les réactifs doivent être stockés dans un dessiccateur avant d’être utilisés. De plus, l’utilisateur doit s’assurer que l’échantillon est exposé au moins possible à la vapeur d’eau atmosphérique.Ensuite, rincez la bouteille de pyridine anhydre avec de l’argon. Fermez la bouteille et remettez-la dans le dessiccateur. Dissoudre le MOX dans la pyridine en incubant le tube dans un mélangeur thermique à 35 degrés Celsius pendant 10 minutes à 600 tr/min.Ensuite, ajoutez 40 microlitres de 40 milligrammes par millilitre de MOX dans une solution anhydre de pyridine à l’échantillon séché. Agitez l’échantillon pendant 10 secondes et centrifugez-le brièvement. Ensuite, incubez l’échantillon dans un mélangeur thermique.Centrifugez l’échantillon à 20 000 g ou à vitesse maximale pendant cinq minutes pour éliminer les particules. Transférez 25 microlitres de surnageant dans un flacon d’échantillonneur automatique avec un insert en verre désactivé de 250 microlitres. Ajouter 40 microlitres de MSTFA contenant 1 % de TMCS.Placez un capuchon sur le flacon de l’échantillonneur automatique et scellez-le à l’aide d’un outil de sertissage. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure en secouant à 250 tr/min. Enfin, ajoutez trois microlitres de solution d’ester méthylique d’acide gras préalablement préparée, ou FAMES, dans le flacon de l’échantillonneur automatique à l’aide d’un échantillonneur automatique robotisé immédiatement avant l’injection.La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse des larves mutantes de lactate déshydrogénase présente des changements significatifs de lactate, de pyruvate et de L2-hydroxyglutarate par rapport aux larves témoins. Les spectres GC-MS générés avec le protocole montrent de nombreuses caractéristiques visibles et un pic notable pour le tréhalose, qui représente normalement le plus grand pic dans un échantillon larvaire. L’analyse en composantes principales, ou ACP, montre clairement que les groupes knockout et de type wild se séparent l’un de l’autre et qu’il n’y a pas de valeur aberrante dans l’un ou l’autre groupe.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de conserver les échantillons congelés avant l’homogénéisation et de garder tous les réactifs secs tout au long de la procédure.

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Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique

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