Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme, telles que la synthèse de l’oncométabolite L2-hydroxyglutarate dans les cellules saines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à l’utilisateur de mesurer directement plus de 100 métabolites de manière sensible et reproductible. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le protocole nécessite un traitement efficace des échantillons et est extrêmement sensible à la vapeur d’eau.

Pour commencer le protocole, ajoutez un millilitre de chlorure de sodium glacé à 0,9 % dans un tube de 1,5 millilitre contenant des larves préalablement préparées. Fermez le couvercle, retournez verticalement le tube pour bien laver les larves et placez le tube sur de la glace pendant 30 secondes. Les larves couleront au fond du tube, mais la levure restera en suspension.

Une fois que toutes les larves ont formé une pastille lâche, prélever la solution de chlorure de sodium à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Centrifuger les échantillons à 2 000 g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Retirez toute la solution résiduelle à l’aide d’une pipette de 200 microlitres et congelez immédiatement l’échantillon dans de l’azote liquide.

Utilisez un marqueur résistant à l’éthanol pour étiqueter le côté d’un tube à billes à vis de deux millilitres. Ensuite, tarez la masse du tube à billes étiqueté à l’aide d’une balance analytique capable de mesurer avec précision 0,01 milligramme. À l’aide d’une longue pince, retirez le tube d’échantillon de 1,5 millilitre du dewar d’azote liquide.

En portant des gants en nitrile, saisissez le tube congelé, retournez-le et martelez brusquement le couvercle du tube contre le dessus de la paillasse pour déloger la pastille congelée. Versez immédiatement le granulé dans un tube à billes à bouchon à vis de deux millilitres pré-taré. L’échantillon doit être traité rapidement pour s’assurer que les voies métaboliques endogènes ne sont pas réactivées.

Mesurez rapidement la masse combinée de la pastille larvaire et du tube de perle. Placez immédiatement le tube d’échantillon dans de l’azote liquide. Placez les tubes d’échantillon dans une glacière de paillasse à moins 20 degrés Celsius.

Ajoutez 0,8 millilitre de méthanol pré-refroidi à 90 % contenant deux microgrammes par millilitre d’acide succinique-D4 dans chaque tube. Remettez les échantillons dans la glacière de paillasse à moins 20 degrés Celsius. Mettez en place un contrôle négatif en ajoutant 0,8 millilitre de méthanol pré-refroidi à 90 % contenant deux microgrammes par millilitre d’acide succinique-D4 dans un tube à billes vide.

Ensuite, homogénéisez les échantillons pendant 30 secondes à 6,45 mètres par seconde à l’aide d’un homogénéisateur de broyeur à billes situé dans une salle de contrôle de température de quatre degrés Celsius. Remettez les échantillons homogénéisés dans la glacière de paillasse à moins 20 degrés Celsius et transférez la glacière dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après l’incubation, centrifugez les tubes à 20 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer le précipité résultant.

Transférez 600 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et ne dérangez pas le précipité. Ouvrez tous les tubes d’échantillon et placez-les dans une centrifugeuse à vide. Séchez les échantillons à température ambiante jusqu’à ce que tout le solvant soit éliminé.

Si les échantillons séchés ont été conservés à moins 80 degrés Celsius, placez les tubes d’échantillon non ouverts dans une centrifugeuse sous vide et séchez-les pendant 30 minutes. Préparez une solution de 40 milligrammes par millilitre de chlorhydrate de méthoxylamine, ou MOX, dans de la pyridine anhydre. Stockez le MOX et la pyridine dans un dessiccateur.

Ensuite, utilisez un pistolet thermique pour sécher une seringue en verre d’un millilitre pendant environ cinq secondes. Insérez l’aiguille de la seringue dans le flacon de pyridine anhydre. Prélevez un millilitre de pyridine et ajoutez-le dans un tube microfuge contenant 40 milligrammes de MOX.

Cette partie du protocole est extrêmement sensible à l’eau. Tous les réactifs doivent être stockés dans un dessiccateur avant d’être utilisés. De plus, l’utilisateur doit s’assurer que l’échantillon est exposé au moins possible à la vapeur d’eau atmosphérique.

Ensuite, rincez la bouteille de pyridine anhydre avec de l’argon. Fermez la bouteille et remettez-la dans le dessiccateur. Dissoudre le MOX dans la pyridine en incubant le tube dans un mélangeur thermique à 35 degrés Celsius pendant 10 minutes à 600 tr/min.

Ensuite, ajoutez 40 microlitres de 40 milligrammes par millilitre de MOX dans une solution anhydre de pyridine à l’échantillon séché. Agitez l’échantillon pendant 10 secondes et centrifugez-le brièvement. Ensuite, incubez l’échantillon dans un mélangeur thermique.

Centrifugez l’échantillon à 20 000 g ou à vitesse maximale pendant cinq minutes pour éliminer les particules. Transférez 25 microlitres de surnageant dans un flacon d’échantillonneur automatique avec un insert en verre désactivé de 250 microlitres. Ajouter 40 microlitres de MSTFA contenant 1 % de TMCS.

Placez un capuchon sur le flacon de l’échantillonneur automatique et scellez-le à l’aide d’un outil de sertissage. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure en secouant à 250 tr/min. Enfin, ajoutez trois microlitres de solution d’ester méthylique d’acide gras préalablement préparée, ou FAMES, dans le flacon de l’échantillonneur automatique à l’aide d’un échantillonneur automatique robotisé immédiatement avant l’injection.

chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse des larves mutantes de lactate déshydrogénase présente des changements significatifs de lactate, de pyruvate et de L2-hydroxyglutarate par rapport aux larves témoins. Les spectres GC-MS générés avec le protocole montrent de nombreuses caractéristiques visibles et un pic notable pour le tréhalose, qui représente normalement le plus grand pic dans un échantillon larvaire. L’analyse en composantes principales, ou ACP, montre clairement que les groupes knockout et de type wild se séparent l’un de l’autre et qu’il n’y a pas de valeur aberrante dans l’un ou l’autre groupe.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de conserver les échantillons congelés avant l’homogénéisation et de garder tous les réactifs secs tout au long de la procédure.