Combinant l’analyse de l’ADN dans une Extraction de Virion brut avec l’analyse de l’ARN des feuilles infectées pour découvrir de nouveaux génomes de Virus

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en virologie environnementale, comme l’émergence de nouvelles maladies. Le principal avantage de cette méthode réside dans la purification des variants en les séparant des composants cellulaires, puis dans l'utilisation de ces variants pour extraire l'ADN destiné au séquençage. J'ai eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons découvert que les plantes de nos serres étaient infectées par un ou plusieurs Badnavirus inconnus. Les personnes novices dans cette méthode rencontreront trois difficultés. Premièrement, l'homogénéisation est une étape cruciale pour garantir des rendements de qualité. Deuxièmement, la centrifugation différentielle peut produire plusieurs culots, et il est nécessaire de savoir les identifier et les séparer. Troisièmement, l'interprétation des résultats sur l'analyseur bioanalytique peut également s'avérer difficile.

Un tablier de laboratoire et des gants doivent être portés pendant toutes les étapes de cette procédure. Commencez par découper 80 à 100 grammes de feuilles provenant de plantes malades préalablement congelées à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, broyez les feuilles dans un mélangeur Waring en utilisant 200 millilitres de tampon de broyage et 0,5 % de sulfite de sodium. Transférez l'homogénat dans un bécher d'un litre.

Tout en portant toujours des équipements de protection individuelle appropriés, ajouter 18 grammes d'urée et 25 millilitres de détergent non ionique à 10 % au homogénat et couvrir le bécher avec du papier d'aluminium. Mélanger à l'aide d'un agitateur magnétique pendant la nuit. Le jour suivant, transférer l'homogénat dans des flacons de rotor de centrifugeuse de 250 millilitres et centrifuger dans un rotor à angle fixe à 4000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Récupérer le surnageant et filtrer à travers quatre couches de gaze. Mesurer le volume du homogénat liquide récupéré, puis répartir le homogénat dans des tubes de centrifugation en polypropylène de 38,5 millilitres. Centrifuger le homogénat à 40 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 2,5 heures. Une fois la centrifugation terminée, vérifier la présence d'un culot vert au fond du tube et d'un culot blanc le long de la paroi du tube. Verser délicatement le surnageant tout en conservant les deux culots, puis placer les échantillons sur de la glace.

La séparation du culot blanc et du culot vert est l'une des étapes les plus délicates de la procédure. Elle exige de la patience et de l'habileté.

En travaillant sous une hotte chimique, utilisez un racloir en caoutchouc pour séparer les pastilles. Grattez et transférez les pastilles dans des flacons de rotor différents. Placez les flacons de rotor contenant les pastilles blanches sur de la glace. Ajoutez un millilitre d'eau dans chaque flacon et pipetez plusieurs fois de haut en bas. Toutes les cinq minutes, pendant une à deux heures, pipetez le mélange de haut en bas afin de resuspendre la pastille. Une fois les pastilles blanches resuspendues, conservez les suspensions toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Le jour suivant, centrifuger la suspension à 6000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes afin d'éliminer les débris résiduels. Transférer les suspensions concentrées dans de nouveaux tubes et centrifuger à 136 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant deux heures afin de former un culot de virions. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans un millilitre de tampon.

Commencez cette procédure en rompant les virions. Ajoutez quarante microlitres d'une solution de protéinase K à deux microgrammes par microlitre aux suspensions de culot et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajoutez un volume de phénol-chloroforme-alcool isoamylique à chaque échantillon et agitez manuellement pendant 20 secondes.

Centrifuger à température ambiante à 16 000 ×g pendant cinq minutes. Retirer la phase aqueuse supérieure et la transférer dans un nouveau tube. Répéter cette extraction deux fois ou plus.

Concentrez l'ADN par précipitation à l'éthanol. Utilisez 0,3 molaire d'acétate de sodium à pH 5,2 et 2,5 volumes d'éthanol à 95 %. Placez les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, centrifugez à 13 000 ×g pendant 10 à 20 minutes pour former un culot d'ADN.

Sur un poste de travail de laboratoire, resuspendre le culot d'ADN dans un millilitre de tampon TE 0,1 millimolaire. Filtrer la suspension à l'aide d'une colonne de filtration sur gel commerciale par centrifugation. Analyser les échantillons par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % en utilisant une coloration par bromure d'éthidium afin d'évaluer la qualité des préparations et d'apprécier la qualité de l'ADN comme indiqué dans le texte.

Lorsqu'elles ont été examinées par microscopie électronique en transmission, des particules virales étaient présentes dans le culot blanc obtenu par fractionnement grossier de feuilles de canne infectées. L'électrophorèse sur gel d'agarose de l'ADN extrait des culots vert et blanc a révélé deux bandes d'ADN de haut poids moléculaire dans la fraction blanche, indiquées par les points rouge et jaune.

L'intégrité de l'ARN isolé à partir de feuilles infectées a également été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose. Ce graphique montre l'abondance et la répartition taxonomique des contigs assemblés à partir de la préparation brute de virus. Et ce graphique illustre les proportions de contigs viraux associés à la famille des Caulimoviridae, au genre Badnavirus et aux contigs associés à trois espèces étroitement apparentées.

Ces deux graphiques suivants montrent l'abondance de contigs dérivés du séquençage ARN en fonction de leur répartition taxonomique. Le graphique de droite illustre l'abondance de contigs au sein de la population de contigs viraux associés à la famille Caulimoviridae, au genre Badnavirus et à trois espèces étroitement apparentées. La comparaison des contigs de longueur du génome viral obtenus par séquençage ADN et ARN, utilisés comme échafaudage mutuel, confirme la présence de deux génomes viraux complets.

Enfin, une analyse de RT-PCR utilisant des ARN isolés de feuilles infectées par le virus a permis de détecter les deux génomes viraux.

Une fois maîtrisée, cette technique peut prendre deux jours, alors qu'un débutant peut en prendre trois. Lors de la première réalisation de cette procédure, il est important de consigner le volume d'homogénat dans chacun des surnageants afin, à la fin de la procédure, de pouvoir comparer le rendement final en ADN avec la matière initiale de départ.

Depuis sa découverte, cette méthode a ouvert la voie dans le domaine de la virologie végétale, permettant aux chercheurs d'identifier de nouveaux virus à ADN dans l'environnement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'homogénéiser le matériel végétal, de concentrer les variants et d'obtenir un bon rendement d'ADN pouvant être utilisé pour le séquençage de nouvelle génération. N'oubliez pas que le travail avec l'urée et le phénol-chloroforme est extrêmement dangereux, et qu'il est essentiel de prendre des précautions telles que le port de lunettes de protection, de gants, d'une blouse de laboratoire et d'un masque chaque fois que vous manipulez ces produits chimiques. Pour une ultracentrifugation sécuritaire, il est important d'équilibrer correctement les tubes ; vous devez donc les peser et les placer en position opposée dans le rotor, avec une différence de masse ne dépassant pas 0,01 entre eux.