Une méthode Invasive pour l’Activation du Gyrus denté souris par Stimulation haute fréquence

L’objectif général de cette expérience est d’observer l’effet de la stimulation à haute fréquence sur l’activité neuronale dans la neurogenèse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans un alignement des mécanismes cellulaires et moléculaires de la stimulation cérébrale profonde à haute fréquence, tels que l’induction de l’activité neuronale et la neurogenèse dans l’hippocampe. L’avantage de cette technique est qu’elle démontre l’effet puissant du TBS à haute fréquence sur l’activité neuronale et la neurogenèse dans le cerveau adulte.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des effets de la TBS à haute fréquence sur le gyrus denté de la souris, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les ganglions de la base et les régions sous-thalamiques pour les troubles cérébraux en clinique. Pour commencer cette procédure, placez une souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique. Alignez les bandes d’oreille avec sa tête et serrez-les doucement pour soutenir la tête centrée.

Saisissez la peau avant ses oreilles et retirez-en environ un centimètre carré sur le crâne. Retirez ensuite le muscle et les autres attaches recouvrant le crâne avec un coton-tige pour exposer la surface du crâne. Ensuite, appliquez une solution de peroxyde d’hydrogène pour sécher le crâne afin d’identifier les lignes de suture sagittale et lambda.

Ensuite, identifiez le bregma et le lambda. Le point bregma sera utilisé comme point d’origine pour définir la position du noyau. Après cela, nivelez le crâne sur le plan horizontal à l’aide de ces deux points.

Assurez-vous que la hauteur de ces deux points est presque la même dans le plan ventral dorsal. De plus, assurez-vous que le crâne est aligné dans le plan latéral médial. Ensuite, montez une micro-électrode en cuivre à deux canaux faite maison dans le porte-électrode rotatif sur le cadre chirurgical stéréotaxique.

Placez l’électrode directement au-dessus du bregma et réglez-la comme site d’origine. Ensuite, déplacez doucement l’électrode dans la bonne position au-dessus du crâne, sans la toucher. Utilisez l’affichage numérique sur le cadre chirurgical stéréotaxique pour indiquer les positions antérieure postérieure, médiale latérale et dorso-ventrale.

Lorsque le site souhaité pour l’insertion de l’électrode est identifié, marquez la position avec un marqueur noir. Ensuite, utilisez les ajustements stéréotaxiques dorso-ventraux pour soulever le porte-électrode. Ensuite, stérilisez le foret avec de l’éthanol à 70 %.

Utilisez une perceuse à main assistée par micromanipulateur, faites un trou de bavure précisément à la position marquée. Utilisez un coton-tige stérile pour arrêter tout saignement pendant l’opération. Continuez à percer jusqu’à ce que la dure-mère soit exposée.

Utilisez une aiguille pliée pour enlever tous les restes d’os générés pendant le forage et faites un trou d’épingle sur la dure-mère sans endommager le tissu cérébral mou sous-jacent. Pour confirmer que le trou de bavure est correctement fait à la position souhaitée, abaissez l’électrode pour vous assurer qu’elle s’insère doucement dans le trou de bavure sans toucher d’obstacle. Si aucune résistance n’est détectée, insérez lentement l’électrode à la profondeur cible à partir de la surface du crâne.

Ensuite, appliquez du ciment dentaire à l’aide d’une petite spatule pour maintenir l’électrode en place. Au fur et à mesure que le ciment s’épaissit, moulez-le autour de l’électrode insérée et d’autres vis à os pour former un joli capuchon lisse. Ensuite, dégagez l’électrode du porte-électrode.

Retirez la souris du cadre stéréotaxique et remettez-la dans une cage chaude. Laissez la souris se déplacer librement et laissez-la récupérer pendant deux jours dans la cage. Pour délivrer une stimulation, connectez l’électrode implantée à un stimulateur programmable via des fils.

Configurez l’interface du logiciel. Ensuite, définissez les paramètres HFS comme six séries de six trains de six impulsions à 400 Hertz et l’intensité de stimulation de 200 milliampères. Livrer HFS pour la période de temps souhaitée telle que configurée.

Pour le groupe témoin, implantez des électrodes dans les souris sans délivrer de stimulation. Pour la coloration CFAS, stimulez les souris expérimentales deux fois pendant une journée. Pour le marquage BrdU, appliquez des stimulations appropriées à la fois au groupe de stimulation aiguë et au groupe de stimulation chronique.

Au cours de la stimulation, assurez-vous que la souris est éveillée. N’oubliez pas de vous assurer que les fils ne sont pas tordus. Lorsque la stimulation est terminée, débranchez soigneusement la broche de l’électrode du porte-électrode dans le connecteur du système d’enregistrement.

Pour le CFAS et la coloration d’un encoche, environ trois heures après le dernier HFDBS, anesthésez les souris en injectant du pentobarbital pour obtenir un plan chirurgical d’anesthésie. Pour le marquage de BrdU, environ 12 heures après la dernière stimulation HFDBS, administrer six injections de BrdU aux souris témoins et aux souris stimulées à deux heures d’intervalle. 36 heures après la dernière injection, anesthésier profondément les souris avec du pentobarbital et les profuser par voie transcardiale avec 50 millilitres de PBS froid suivi de 50 millilitres de paraformaldéhyde froid à 4 %.

Retirez sa tête et faites une incision sur la peau pour exposer la compétence. À l’aide d’une pince, ébréchez légèrement le crâne et retirez soigneusement tout le cerveau. Ensuite, après la correction, le cerveau est à 4 % de paraformaldéhyde pendant deux jours supplémentaires, et transférez-le dans une solution à 30 % de saccharose à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

À l’aide d’un cryostat, coupez le cerveau en sections coronales de 20 microns. Transférez et montez les sections sur la lame de verre à l’aide d’un pinceau et rangez-les à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, transférez les lames dans du PBS normal ne contenant pas de fixateur.

Lavez les sections avec du PBS trois à quatre fois pendant cinq minutes chacune pour éliminer tout excès de fixateur. Pour le groupe marqué au BrdU, incubez les sections dans deux molaires de HCL pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et rincez-les dans un tampon de borate de 0,1 molaire. Après 10 minutes, lavez les sections deux fois dans PBS pendant cinq minutes à chaque fois.

Ensuite, incubez les sections dans une solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les sections avec un anticorps polyclonal anti-CFAS, un anticorps anti-cran un ou un anticorps anti-BrdU dans une solution bloquante à quatre degrés Celsius pendant la nuit. J’ai passé les sections trois fois dans du PBS pendant 10 minutes à chaque fois, puis incubez-les avec l’anticorps anti-rage conjugué Alexa Fluor 568, l’anticorps anti-chèvre conjugué Alexa Fluor 488 ou l’anticorps secondaire anti-rat conjugué Alexa Fluor 488 pendant une heure à température ambiante.

Les sections ont été diffusées trois fois dans PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Par la suite, couvrez les sections cérébrales immunomarquées à l’aide d’un milieu de montage de réactif anti-décoloration contenant du DAPI. Laissez les sections sécher à l’air libre et rangez-les à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius.

Voici un paradigme expérimental pour le traitement HFS dans la génération de neurones proliférants marqués BrdU dans le DG. Les animaux ont été divisés en un groupe aigu et un groupe chronique pour recevoir différents modèles de stimulations. Par la suite, les animaux des deux groupes ont reçu une injection de BrdU le sixième jour. Le huitième jour, les animaux ont été anesthésiés et profusés pour la préparation de coupes de cryostat.

Voici les images de la coloration immunofluorescente de BrdU post-HFDBS dans le DG. Une analyse quantitative de la production neuronale a indiqué que la stimulation aiguë dans la DG ne pouvait pas améliorer la neurogenèse. Alors que la stimulation chronique dans la DG régule significativement à la hausse la neurogenèse. Par rapport au groupe témoin, le nombre de cellules de marquage BrdU a augmenté de manière significative dans le groupe chronique, à la fois dans l’hémisphère ipsilatéral et controlatéral.

Voici les images de la coloration immunofluorescente de BrdU post-HFDBS dans la sous-région PP. Une analyse quantitative de la production neuronale a indiqué que la stimulation aiguë ou chronique dans la PP ne pouvait pas améliorer la neurogenèse de manière significative. Le nombre de cellules de marquage BrdU était relativement stable avec ou sans traitement HFS.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de localiser correctement l’électrode et de délivrer la stimulation avec succès. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la stimulation à haute fréquence en neurosciences inscrits dans les modèles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fournir une stimulation à haute fréquence au noyau cérébral profond.