Name: Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Découvrez la cytométrie en flux multiparamétrique pour diagnostiquer les syndromes myélodysplasiques. Cette méthode réduit la subjectivité et quantifie les différences des populations cellulaires myéloïdes normales.

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Les anticorps utilisés dans cette étude ont été fournies par BD Biosciences. Les auteurs tiennent à remercier leur collègue, Dr Pascale Flandrin-Gresta, du département de biologie moléculaire, laboratoire d’hématologie, University Hospital de Saint-Etienne, France, qui a fourni l’expertise pour l’interprétation des données d’end pendant la seconde Cas MDS. Les auteurs sont reconnaissants pour les hématologues clinicien pour leur intérêt et leur participation à cette étude et pour les patients et les donneurs sains pour leur accord pour participer à cette étude. Les auteurs tiens également à remercier la Fondation « Les Amis de Rémi » aide financière pour la publication.

<ol><li>Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li>
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<li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AutoGate%3A+automating+analysis+of+flow+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li>
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<li><a target="_blank" href="NULL">EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1</a>. , (2015).</li>
<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li>
<li>http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx">http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx</a> (2018).</li>
<li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal%2C+reactive+and+malignant+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li>
<li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li>
<li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group%29%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes. La cytométrie en flux-département, laboratoire d’hématologie à l’hôpital de l’Université de Saint-Etienne est membre du EuroFlow Consortium.

La qualité de l’aspiration de la BM pourrait avoir une incidence sur le résultat final. L’hémodilution de l’aspiration de la BM pourrait fausser la distribution des cellules dans les différents stades de maturation en raison de l’absence de cellules souches ou cellules précurseurs. Probablement employant un vrac lyse méthode peut-être contribuer à la normalisation de la ponction de la BM pour l’hémodilution dans les analyses de cytométrie en flux. En outre, les étapes essentielles pour l’évaluation de dysplasie myéloïde ...

En l’absence de marqueurs phénotypiques spécifiques aux changements dysplasiques se produisant dans les cellules myéloïdes pendant l’initiation MDS et la progression, une nouvelle approche a été proposée ces dernières années, basée sur l’évaluation des voies de maturation (expression altérée de les antigènes myéloïdes durant la production de cellules myéloïdes matures) ou de la distribution anormale des différents types de cellules dans la moelle osseuse (BM) cellule compartiments1,2.
Cet article présente une nouvelle méthode d’application normalisée des MFC afin de détecter les changements dysplasiques dans les compartiments de la cellule myéloïde BM associés à des syndromes myélodysplasiques (SMD) ou d’autres maladies hématologiques myéloïdes. Cette étude montre également l’utilité d’utiliser des bases de données de maturation pour l’analyse de données MFC.
Normalisation de la procédure de préparation d’échantillon, d’acquisition de données et analyse en utilisant les bases de données permettrait l’identification des anomalies phénotypiques plus pertinentes liées aux changements dysplasiques dans les cellules myéloïdes BM. Par conséquent, les sous-ensembles statistiquement sélectionnés selon des formats bien étiquetés et reconnus (séparateur de Population automatique (APS) diagrammes, histogrammes et parcelles de dot) sont requis pour développer une stratégie d’analyse qui peut être utilisée dans une analyse ultérieure arrondit. La découverte d’anomalies phénotypiques robustes MDS faciliterait le diagnostic dans les cas avec ou sans dysplasie morphologique minime et sans aberrancies cytogénétiques. Identification des paramètres discriminatoires permettant la réduction des panneaux immunophénotypiques peut simplifier l’actuel scores2, permettant leur applicabilité dans les laboratoires de pathologie clinique.
Cette méthode limite les interprétations subjectives de cytométrie de flux de données, comme ont été signalé en MDS diagnostic3. Cette étape est un préalable à l’élaboration d’outils automatisés pour le traitement et l’analyse des flux de données4.
MDS comprend un groupe hétérogène d’affections clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dont les mutations du splicéosome coopèrent avec des modificateurs spécifiques épigénétiques de céder le phénotype MDS. On sait maintenant que, ainsi que des mutations de HSC, autres mécanismes sont impliqués dans la physiopathologie MDS, telles que l’inflammation d’origine immunitaire aberrante et interactions entre autorenouveler maligne et le micro-environnement stromal de la BM. Toutefois, ces mécanismes restent mal compris. L’hétérogénéité large clinique et biologique de MDS rend le diagnostic et le choix de la pharmacothérapie optimale par un défi. Au cours de la dernière décennie, plusieurs études ont montré que les MFC est souvent plus sensible dans la détection de la dysplasie2 que la morphologie, mais les contraintes techniques et économiques rendent cette technique difficile à normaliser, avec des résultats souvent selon le le expérience de l' interprète3. En outre, on ne sait pas comment MFC peut faire pencher la balance vers MDS dans les cas avec ou sans dysplasie morphologique minime et en l’absence d’anomalies cytogénétiques ou dans des cas limites telles que hypocellular MDS, avec un nombre faible souffle, d’autre non clonale BM des troubles tels que l’insuffisance médullaire (i.e., anémie aplasique). Aussi, il reste difficile de différencier les cas limites de MDS avec un excès de blastes de leucémie myéloïde aiguë (LMA). Pour toutes ces raisons, le Guide de pratique clinique ne s’intègrent pas MFC testing dans le diagnostic final de MDS. En 2011, l’US National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recommandé MFC permettant d’estimer le pourcentage de cellules CD34 +, détection des clones de l’hémoglobinurie paroxystique nocturne et la présence de clones de lymphocytes T cytotoxiques dans hypocellular MDS5. Ces deux derniers cas impliquent également un objectif thérapeutique parce que les données cliniques ont montré une bonne réponse de ces patients à un traitement immunosuppresseur6. Les lignes directrices NCCN 2017, citant les recommandations du groupe de travail International (GTI), énumérés immunophénotypage aberrant de détection par MFC parmi les critères Co pour MDS diagnostic, mais sans faire aucune fiche6. En outre, la classification de l’OMS publiée récemment stipule que les constatations MFC seules ne suffisent pas établir un diagnostic primaire de MDS en l’absence de données morphologiques et/ou cytogénétique concluantes7. Toutefois, les MFC peut servir comme un essai supplémentaire montrant le dérèglement des cellules myéloïdes patrons de maturation et de quantifier la « distance de la normale » pour un patient à un moment précis de l’évolution de la maladie.
Cette méthode est applicable aux laboratoires cliniques intéressés par l’évaluation de dysplasie dans les cellules myéloïdes BM à l’aide de MFC immunophénotypage, afin d’affiner le diagnostic en MDS ou d’autres troubles myéloïdes avec anomalies dysplasiques.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences, CA, USA SN</td><td> :</td> V33896301336 <td>configuration 3-laser, 4-2-2, Détails des filtres et miroirs : https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td></tr><tr><td>Awel C48-R Centrifugeuse</td><td>AWEL Industries, FR</td><td>SN : 910120016 ; Modèle : 320002001</td><td>centrifugeuses à basse vitesse ; capacité 60 tubes FACS</td></tr><tr><td>Pipettes de 10&micro ; L et 200&micro ; </td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>Pipettes</td><td></td><td></td><td></td>Pasteur</tr><tr><td>15 mL Tubes</td><td></td><td></td><td></td>Falcon</tr><tr><td>tube en polypropylène pour souris FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human HLA-DR</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>655874</td><td>clone L243 Souris BALB/c IgG2a, &kappa ; Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD45</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>560777</td><td>clone HI30 souris IgG1, &kappa ; Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)</td></tr><tr><td>Souris Anti-Humaine CD16</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656146</td><td>clone CLB/fcGran1 Souris BALB/c IgG2a, &kappa ; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD13</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>347406</td><td>clone L138 Souris BALB/c X C57BL/6 IgG1, &kappa ; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD34</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>347222</td><td>clone 8G12 Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD117</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>339217</td><td>clone 104D2 Souris BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD11b</td><td>BD Biosciences, CA, États-Unis</td><td>333143</td><td>clone D12 souris BALB/c IgG2a, &kappa ; D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm</td></tr><tr><td>Souris Anti-Human CD10</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>646783</td><td>clone HI10A Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Souris Anti-Human CD35</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>555452</td><td>clone E11 Souris IgG1, &kappa ; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD64</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>644385</td><td>clone 10.1 Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD300e</td><td>Immunostep</td><td>IREM2A-T100</td><td>clone UP-H2 Souris BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD14</td><td>BD Biosciences, CA, États-Unis</td><td>641394</td><td>clone MoP9 Souris BALB/c IgG2b, &kappa ; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD36</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656151</td><td>clone CLB-IVC7 Souris IgG1, &kappa ; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Souris Anti-Human CD105</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>560839</td><td>clone 266 Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Souris Anti-Humaine CD33</td><td></td><td>345800</td><td>clone P67.6 Souris BALB/c IgG1, &kappa ; Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD71</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>655408</td><td>clone M-A712 Souris BALB/c IgG2a, &kappa ; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Solution de lyse 10x Concentré (IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, États-Unis</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow Gaine</td><td>fluide BD Biosciences, CA, États-Unis</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva CS& T Perles IVD</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656046</td><td></td></tr><tr><td>PARTICULES D’ÉTALONNAGE ARC-EN-CIEL, 8 PICS</td><td>Cytognos, Salamanque, Espagne</td><td>SPH-RCP-30-5A</td><td>lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td></tr><tr><td>Particules de compensation Multicolore CompAds(CE/IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>réf. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Diva versions 6.1.2 et 6.1.3</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comprimés salins tamponnés au phosphate</td><td>R& D Systems, Minneapolis, États-Unis</td><td>5564</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;( BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium 99 %</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>199931</td><td></td></tr><tr><td>logiciel Infinicyt version 1.8.0.e</td><td>Cytognos, Salamanque, Espagne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la maturation des cellules myéloïdes médullaires

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Un groupe de travail initié au sein de l’Association Français de cytométrie en flux (AFC) a été développé afin d’harmoniser l’application de la cytométrie multiparamétrique (MFC) pour le diagnostic myéloïde en France. Le protocole présenté ici a été convenue et appliquée entre septembre 2013 et 2015 de novembre dans six laboratoires diagnostiques Français (centres hospitaliers universitaires de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice et Lille et Institut Paoli-Calmettes dans Marseille) et a permis la normalisation de la moelle osseuse échantillon préparation et acquisition de données. Trois bases de données de maturation ont été développées pour les neutrophiles, monocytes et lignées érythroïde avec la moelle osseuse d’individus donateurs « sain » (individus sans aucune preuve d’une maladie hématopoïétique). Une solide méthode d’analyse pour chaque lignée myéloïde devrait être applicable pour le diagnostic systématique. De nouveaux cas peuvent être analysés de la même façon et comparés à des bases de données habituelles. Ainsi, des anomalies quantitatives et qualitatives phénotypiques peuvent être identifiés et ceux au-dessus de 2SD comparés aux données des échantillons de moelle osseuse normale devraient considérer comme révélateur de la pathologie. La limitation majeure est la variabilité plus élevée entre les données obtenues en utilisant les anticorps monoclonaux obtenus avec les méthodes basées sur les technologies d’hybridomes et actuellement utilisés dans le diagnostic clinique. Établissant des critères de validation technique des données acquises peut contribuer à améliorer l’utilité de MFC pour les diagnostics MDS. La mise en place de ces critères exige l’analyse contre une base de données. La réduction de la subjectivité du chercheur en analyse de données est un important avantage de cette méthode.

Les 54 échantillons BM récoltés en anticoagulant K-EDTA ont été inclus dans l’étude. Le MFC ont été analysées en l’absence de toute information sur les patients. Étude rétrospective a montré que les échantillons de BM étaient de 7 donneurs sains (5 mâles et 2 femelles avec un âge médian de 47,4 [35-48], 11 personnes sans aucun signe d’une maladie hématopoïétique (8 mâles et 3 femelles avec un âge médian de 57,9 [35-72]) et 36 cas avec divers certaines pathologies : 1 cas avec anémie et c...

Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.

Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le diagnostic des maladies myéloïdes telles que les syndromes de myélodysplasie ou d’autres maladies hématologiques qui évoluent avec des anomalies de maturation dans les lignées cellulaires myéloïdes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit la subjectivité de l’investigateur dans cette analyse et interprétation. Cette méthode peut fournir un aperçu des paramètres les plus discriminatoires pour la myélodysplasie.Il permet la quantification des différences des populations normales de cellules myéloïdes. Tiphanie Picot, boursier postdoctoral de notre laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par mélanger 600 microlitres de l’échantillon de cellules primaires avec 10 millilitres de tampon de lavage dans un tube conique de 15 millilitres pour deux centrifugations et 10 millilitres de tampon de lavage frais par lavage.Après le deuxième lavage, suspendre à nouveau la pastille dans 400 microlitres de tampon de lavage frais, et transférer 350 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube FACS en polypropylène de cinq millilitres, contenant l’ensemble du panneau d’anticorps épine dorsale. Après avoi

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Présenté ici est une technique basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer simultanément le nombre de divisions cellulaires, le phénotype des cellules de surface et la parenté cellulaire. Ces propriétés peuvent être testées statistiquement à l’aide d’un framework basé sur la permutation.

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