Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires
November 3rd, 2018
Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.
Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le diagnostic des maladies myéloïdes telles que les syndromes de myélodysplasie ou d’autres maladies hématologiques qui évoluent avec des anomalies de maturation dans les lignées cellulaires myéloïdes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit la subjectivité de l’investigateur dans cette analyse et interprétation. Cette méthode peut fournir un aperçu des paramètres les plus discriminatoires pour la myélodysplasie.
Il permet la quantification des différences des populations normales de cellules myéloïdes. Tiphanie Picot, boursier postdoctoral de notre laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par mélanger 600 microlitres de l’échantillon de cellules primaires avec 10 millilitres de tampon de lavage dans un tube conique de 15 millilitres pour deux centrifugations et 10 millilitres de tampon de lavage frais par lavage.
Après le deuxième lavage, suspendre à nouveau la pastille dans 400 microlitres de tampon de lavage frais, et transférer 350 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube FACS en polypropylène de cinq millilitres, contenant l’ensemble du panneau d’anticorps épine dorsale. Après avoir soigneusement mélangé les cellules, pipette égale volumes de la solution d’anticorps cellulaire en trois nouveaux tubes de polypropylène, et apporter le volume final dans chaque tube jusqu’à 200 microlitres avec tampon de lavage frais si nécessaire. Ensuite, ajoutez le volume approprié d’anticorps contre les marqueurs de surface cellulaire d’intérêt avec le mélange, pour une incubation de 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.
À la fin de l’incubation, ajouter deux millilitres de solution de lysing avec mélange, pour une incubation de 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Recueillir les cellules lysées par centrifugation, et jeter tous sauf les 50 derniers microlitres de supernatant dans chaque tube, sans déranger la pastille. Suspendre à nouveau les granulés dans le supernatant restant, avec un mélange doux, et ajouter deux millilitres de tampon de lavage frais à chaque échantillon.
Après le deuxième lavage, jeter le supernatant, en laissant environ 50 microlitres de volume résiduel dans chaque tube, sans déranger la pastille. Suspendre à nouveau la pastille dans 200 microlitres de PBS avec mélange, pour une analyse immédiate. Pour lire les échantillons sur un cytomètre d’écoulement, ouvrez d’abord une nouvelle expérience dans le logiciel de cytomètre de flux, et renommez l’expérience selon le nom, le type d’échantillon et la date.
Créez un nouveau spécimen pour trois tubes et spécifiez les anticorps utilisés dans chaque tube dans la disposition de l’expérience. Ouvrez les paramètres du cytomètre et sélectionnez les paramètres d’application pour appliquer les valeurs obtenues dans la configuration mensuelle. Ouvrez une nouvelle feuille de travail globale et créez les parcelles de points appropriées pour les cellules singlet, ainsi que pour les populations de granulocytes, de monocytes, de blastes et de lymphocytes.
Créez une nouvelle feuille de travail globale pour les contrôles de rémunération. Ensuite, acquérir 500.000 événements de chaque tube, à un taux d’acquisition moyen, l’exportation des données comme fcs 3.0 fichiers, après leur validation technique. Avant de commencer une nouvelle analyse, téléchargez les fichiers cyt contenant les données normales de moelle osseuse, pour les lignées rouges neutrophiles, monocytiques et nucléées, et les fichiers d’analyse en format inp.
Ensuite, enregistrez les données sur votre bureau. Afin d’enregistrer la maturation du neutrophile à la base de données, ouvrez d’abord le logiciel Infinicyt, puis ouvrez le fichier cyt correspondant aux données de maturation des neutrophiles. Dessinez la voie de maturation sur le graphique APS et enregistrez la voie de maturation du neutrophile vers la base de données.
Ouvrez le fichier fcs pour la maturation de la lignée neutrophile qui doit être analysée. Téléchargez le fichier inp de maturation neutrophile à partir de l’onglet profils. L’analyse de cette lignée est divisée en trois étapes.
Commencez par la sélection de souffles cd34 positifs et engagés dans la neutrophile. À cet effet, utiliser une intersection de sept portes, pour permettre la sélection des CD34 positifs, CD117 positifs, HLADR faible, CD10 négatif, CD13 positif, CD11 événements b-négatifs. Poursuivre l’analyse avec la sélection des précurseurs négatifs du neutrophile CD117 positif et CD34.
Poursuivre l’analyse avec la sélection de cellules neutrophiles plus matures. Ensuite, montrez l’analyse des cellules de lignée monocytique. Dessinez la voie de maturation sur le graphique APS.
Vérifiez que la flèche indiquant le sens de la maturation est orientée des cellules immatures et monocytiques, CD14 négatif, négatif IREM2, aux monocytes matures, CD14 positif, IREM2 positif. Enregistrez la voie de maturation de la lignée monocytique dans la base de données. Ouvrez le fichier fcs pour la maturation de lignée monocytique qui doit être analysée.
Téléchargez le profil pour l’analyse de la lignée monocytique. Pour identifier les cellules de lignée monocytique, utilisez une intersection de quatre portes qui permet la sélection de CD64 positif élevé, CD117 positif, CD117 négatif, HLADR événements positifs. Attribuez ces événements à l’onglet monocytique de l’arbre de hiérarchie de la population.
Ouvrez le fichier cyt du CNRC qui doit être enregistré dans la base de données du CNRC. Dessinez la voie de maturation sur le graphique APS et enregistrez la voie de maturation des globules rouges nucléés vers la base de données. Ouvrez le fichier fcs qui doit être analysé.
Téléchargez à partir des profils le modèle d’analyse des globules rouges nucléés. L’analyse de cette lignée est divisée en deux étapes. En commençant par la sélection du CD34 positif, érythroïde commis explosions.
Ici, utilisez une intersection de sept portes pour permettre la sélection du CD34 positif, CD117 positif, HLADR faible, CD105 positif, CD33 négatif, CD36 positif, CD71 événements positifs. Attribuez ces événements à l’onglet CNRC dans la hiérarchie de la population. Retirez les explosions d’érythroïdes positifs CD34 de la visibilité.
Pour identifier les cellules érythroïdes plus matures, utilisez une intersection de quatre portes qui permettent la discrimination des CD45 négatifs et CD45 positifs bas, côté scatter faible, CD36 positif élevé, et CD71 élevé positif. Ensuite, retirez les plaquettes basses de dispersion latérale élevée CD36 des globules rouges nucléés et attribuez cette population à l’onglet CNRC. Pour évaluer la maturation myéloïde dans le compartiment de moelle osseuse, ouvrez le fichier cyt correspondant à la lignée d’intérêt du cas qui doit être évalué.
Gardez visibles uniquement les événements attribués à l’onglet du neutrophile dans l’arbre de hiérarchie de la population. Dessinez la voie de maturation sur le graphique APS et chargez la base de données correspondant à la maturation du neutrophile dans la moelle osseuse normale, et comparez les données. Si les données sont au moins partiellement compatibles, le logiciel créera un diagramme normalisé des différences de maturation, et une bande de paramètres, pour visualiser les différences de maturation.
Pour comparer la maturation des monocytes dans le compartiment de moelle osseuse, pour un nouveau cas avec les données des moelles osseuses normales, y compris dans la base de données des monocytes, ouvrez le fichier cyt correspondant à la lignée cellulaire monocytique. Gardez visibles uniquement les événements attribués à l’onglet monocytes dans l’arbre de hiérarchie des populations et dessinez la voie de maturation sur le graphique APS. Chargez la base de données correspondant à la maturation des monocytes dans les moelles osseuses normales et comparez les données.
Pour comparer la maturation des globules rouges nucléés dans le compartiment de la moelle osseuse, pour un nouveau cas, avec les données des moelles osseuses normales, incluses dans la base de données du CNRC, ouvrez le fichier cyt correspondant à la lignée du CNRC. Gardez visibles uniquement les événements attribués à l’onglet CNRC dans l’arbre de hiérarchie de la population. Et dessiner la voie de maturation sur le graphique APS.
Chargez la base de données correspondant à la maturation du CNRC dans les moelles osseuses normales et comparez les données. Ensuite, pour visualiser l’importance des différences entre le nouveau fichier et les données incluses dans la base de données, cliquez sur les différences de maturation normalisées et zoomez. N’oubliez pas que les méthodes qui utilisent les algorithmes hiérarchiques de classification dans l’analyse des données cytométriques de flux sont hautement subjectives et intrinsèquement inexactes, parce qu’elles ne comptent pas pour le chevauchement de la population cellulaire.
L’évaluation de nouveaux cas de cytopédia, soupçonnés d’être MDS contre les bases de données normales myéloïdes de maturation, permettent l’identification des antigènes de maturation anormalement exprimés des lignées de neutrophile, de monocyte, et de NRC, même dans les cas sans anomalies cytologiques ou cytogéniques. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’acquérir les données cytométriques de flux, de manière normalisée, pour effectuer la configuration mensuelle de réglage de cytomètre, les contrôles quotidiens, pipette rigoureusement l’anticorps avant utilisation, et de respecter les temps de coloration. Après cette procédure, une autre méthode comme la boussole, peut être effectuée pour comparer les différents groupes de cas, et pour répondre à d’autres questions, telles que ce qui est l’empreinte typique finale pour un groupe particulier de cas.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs intéressés à explorer les modèles de maturation des cellules myéloïdes, dans les cas d’hématopoïèse clonale du potentiel indéterminé pour identifier les changements typiques finaux liés de manière fiable au processus dysplastique. Veuillez noter que la mise à jour de la base de données avec un nombre accru de données provenant de donneurs en bonne santé peut améliorer la robustesse de l’analyse.
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Aperçu
Cet article discute de l'utilisation de la cytométrie en flux multi-paramètres (CFM) pour améliorer le processus de diagnostic des syndromes myélodysplasiques (SMD). Il souligne l'importance de la spécificité et de la sensibilité dans l'analyse CFM pour les applications cliniques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Hématologie
- Maladies myéloïdes
- Techniques de diagnostic
Contexte
- Le diagnostic des SMD est difficile sans critères morphologiques.
- Les cytogénétiques non informatives compliquent le processus de diagnostic.
- La CFM peut potentiellement affiner le processus de diagnostic des SMD.
- La reproductibilité des données entre les opérateurs est cruciale.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'efficacité de la CFM dans le diagnostic des maladies myéloïdes.
- Identifier les paramètres les plus discriminants pour la myélodysplasie.
- Réduire la subjectivité dans l'analyse et l'interprétation.
Méthodes utilisées
- Mélange d'échantillons de cellules primaires avec un tampon de lavage.
- Réalisation de centrifugations pour la préparation des échantillons.
- Quantification des différences par rapport aux populations normales de cellules myéloïdes.
- Démonstration de la procédure par un chercheur postdoctoral.
Principaux résultats
- La CFM fournit des informations sur les différences de population de cellules myéloïdes.
- La technique réduit la subjectivité de l'enquêteur.
- Elle permet la quantification des paramètres discriminants.
- La reproductibilité des données est soulignée pour l'utilité clinique.
Conclusions
- La CFM peut améliorer la précision diagnostique des SMD.
- La spécificité et la sensibilité sont vitales pour l'application clinique.
- Une validation supplémentaire est nécessaire pour une utilisation clinique généralisée.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
