Name: In Vivo Sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez la microdialyse in vivo avec des sondes à seuil de poids moléculaire élevé pour échantillonner de grosses protéines extracellulaires dans le liquide interstitiel cérébral de souris éveillées. Cette technique permet d'étudier la signalisation neuronale et l'élimination des déchets.

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Ce travail a été soutenu par '' subvention pour la recherche scientifique sur des domaines novateurs (protéine de Brain Aging et démence Control)(15H01552) du MEXT et subventions pour jeunes chercheurs (B) (16K 20969). L’auteur remercie le Dr. David M. Holtzman et Dr. John R. Cirrito pour les conseils techniques au cours du développement de cette méthode.

Toutes les études animales ont été examinées et approuvées par le Comité de l’utilisation de la Graduate School of Medicine de l’Université de Tokyo et d’institutionnels animalier.
1. pré chirurgicale
<ol><li>Avant de commencer la chirurgie, essuyez tout avec l’éthanol à 70 % pour maintenir des conditions stériles. Support thermique à l’aide d’un coussin chauffant est recommandé.</li>
	<li>Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de l’hydrate de chloral (400 mg/kg). Confirmer anesthetization en effectuant une pincée d’orteil. Utilisation du meloxicam SR à induction et de la buprénorphine lors de la restauration offre pendant au moins 24 heures est recommandée.</li>
	<li>Se raser les cheveux avec une tondeuse chirurgicale. Fixer une souris chez la souris et l’adaptateur de rat nouveau-né à l’aide de barres d’oreilles et une pince nez. Remarque : Il est essentiel de s’assurer que la tête de souris est fixée à ce stade et ne bouge pas-by-side.</li>
	<li>Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.</li>
</ol>2. stéréotaxique chirurgie d’Implantation de canule Guide
<ol><li>Mettre la souris et l’adaptateur de rat nouveau-né sur l’appareil stéréotaxique. Faire une incision de sagittally sur la peau sur le crâne à l’aide d’un scalpel.　Essuyez les sang et les tissus conjonctifs sur le crâne à l’aide d’un coton-tige humide.</li>
	<li>Déterminer les coordonnées pour la région du cerveau d’intérêt à l’aide d’atlas du cerveau. Avant de commencer les mesures, assurez-vous que la ligne médiane est droite afin que la mèche peut être déplacé A-P et rester sur la suture médiane tout le temps. Remarque : Cet article utilise la coordonnée (A / p :-3,10 mm, taille M/L:-2,50 mm, D/v :-1,20 mm, 12 degrés) pour cibler l’hippocampe postérieure.</li>
	<li>Crâne de niveau A-P<ol>
<li>Attacher une perceuse sur un manipulateur du cadre stéréotaxique. Abaissez le foret jusqu'à ce qu’il touche doucement lambda et enregistrer ses coordonnées ventrale. Répétez cette procédure pour bregma. Remarque : Lorsque le crâne est rasée, la mesure verticale de bregma est égale à celle de lambda. Sinon, ajuster la hauteur de la pince nez en conséquence. Après que le crâne obtient nivelé, enregistrer la coordonnée antérieur/postérieur, latérale du bregma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Niveau skull gauche-droite<ol>
<li>Déplacer la perceuse de bregma à la coordonnée (A / p :-3,10 mm, taille M/L: +2,0 mm), d’abaisser la perceuse sur le crâne et enregistrer la coordonnée verticale. Puis répétez cette procédure pour la coordonnée (A / p :-3,10 mm, taille M/L:-2,00 mm). Remarque : Si le crâne est nivelé, ces cotes verticales de deux points équidistants de la ligne médiane sont égaux. Si ce n’est pas le cas, ajustez la hauteur des barres oreille.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Percer un trou de trépan soigneusement à la coordonnée de la cible (A / p :-3,10 mm, taille M/L:-2,50 mm) pour implanter une canule guide. Si le diamètre d’un trou de trépan n’est pas assez grand pour une implantation de canule guide, percer un autre trou qui chevauche avec le premier. Percer un autre trou dans l’os pariétal droit (côté controlatéral) et insérer une vis osseuse, ce qui contribue à garantir un ciment dentaire 1.10 (voir Figure 1 b).</li>
	<li>Couper une pièce circulaire de verrouillage de l’arrière du couvercle d’un tube à centrifuger 1,5 mL par une lame de rasoir et faire une '' Couronne ''. Cette couronne est utilisée pour empêcher la propagation à la peau de ciment dentaire. Placez-le sur le crâne afin que les trous de burr effectuées à l’étape 2.5 restent au sein du cercle (voir Figure 1).</li>
	<li>Mettre en place une Assemblée stéréotaxique en mettant une canule guide sur le bras court d’un adaptateur stéréotaxique et fixez-le à l’aide d’un écrou borgne. Mettre le bras le plus long de l’adaptateur stéréotaxique sur la bride de l’électrode. Fixez-le sur le manipulateur de l’appareil stéréotaxique (voir Figure 1 a).</li>
	<li>Tournez l’ensemble de stereotax D-V sur le bras manipulateur de 12 degrés (voir Figure 1 b). Déplacer la canule guide vers le trou de trépan en 1.6. Insérer la canule guide lentement dans le cerveau en l’abaissant de 1,2 mm. Remarque : L’angle de la sonde est spécifique à l’hippocampe ; autres régions peuvent exiger aucun angle ou autres angles du tout. Consulter un atlas du cerveau pour les coordonnées précises. Sécher la surface du crâne, car si pas le ciment ne collera pas et bouchon de ciment peut se déplacer</li>
	<li>Ajouter le ciment dentaire au sein de la Couronne pour couvrir entièrement les deux la partie métallique de la canule guide et la vis suffisamment pour les immobiliser. Appliquer le ciment dentaire supplémentaire s’il y a une partie de crâne exposé.</li>
	<li>Attendez que le ciment dentaire est complètement sec (~ 12-20 min). Retirez l’adaptateur stéréotaxique de la pince de l’électrode. Enlever l’écrou borgne, remplacer l’adaptateur stéréotaxique avec une sonde fictive et serrer l’écrou borgne.</li>
	<li>Relâchez le bouton de la souris de l’appareil stéréotaxique et abritent la souris seule dans une cage individuelle. Remarque : La souris ne doit pas être laissée sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Vérifier la souris tous les jours jusqu’au jour de la microdialyse. La souris reçoit des AINS tels que carprofène s’il lui semble être dans la douleur. Attendu 2 semaines est nécessaire pour les études de veille-sommeil, donc la souris habituates au nouvel environnement10, mais d’autres types d’études peuvent exiger des périodes de récupération plus courtes (par exemple, 1-2 jours).</li>
</ol>3. microdialyse Setup
<ol><li>Contrôle de la qualité des sondes : Remplissez une seringue jetable 1ml avec glacées distillée Connectez-le à la sortie (port plus court) d’une sonde à l’aide d’un tube de byton. Recouvrir les orifices avec les doigts et enfoncer le piston de la seringue doucement pour infuser l’eau à la sonde. Vérifiez que l’eau ressort de l’entrée de la sonde, et il n’y a pas de fuite sur la surface d’une membrane microdialyse.<ol>
<li>Activation des sondes : immerger les membranes d’une sonde dans l’éthanol (70-100 %) pendant deux secondes. Puis, infuser l’eau distillée dans la sonde à nouveau avec une seringue à nouveau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation du tampon de perfusion : afin d’éviter l’adhérence des molécules cibles pour les tubes, ajouter BSA de diluer la solution de BSA de 30 % à 4 % avec le CSF artificiel (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0. 4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 , 122 mM NaCl, pH = 7,35), qui correspond étroitement à concentration d’électrolytes dans le LCR, immédiatement avant leur utilisation. Le tampon de perfusion par une unité de filtre de seringue avec 0,1 µm taille des pores du filtre. NOTE : 4 % de BSA améliore la récupération pour le collage des protéines mais peut limiter considérablement la livraison des composés, en particulier pour les composés qui ont élevé BSA-liaison. Il s’agit d’un avantage d’utiliser la plus faible concentration de BSA (tels que 0,15 %) dans certains cas3. Notez que les BSA peut agréger très facilement lorsque agitées par plaque de vortex ou de remuer. Ces agrégats peuvent obstruer les sondes ou les pores de la membrane. Soyez prudent lors de la préparation d’une solution de BSA pour limiter cette agrégation</li>
	<li>Préparer deux lignes séparées pour l’entrée et la sortie (voir Figure 1) et relier les deux lignes avec une aiguille de connexion. Remplissez une seringue jetable 3 mL remplie avec le tampon de perfusion et connectez-le à la fin de l’entrée du tube à l’aide d’une aiguille émoussé-fin. Remplir le tube entier avec le tampon de perfusion en exécutant le pousse-seringue.</li>
	<li>Arrêter la pompe de seringue et remplacer l’aiguille de connexion entre entrée et sortie ligne avec une sonde de microdialyse activés à l’étape 3.3 (voir Figure 1). Avant ce remplacement, mettre l’écrou sur la sonde.</li>
	<li>Monter le tube dans le tube de sortie de la pompe à rouleaux. Démarrer la pompe seringue à 10 µL/min, puis la pompe à rouleaux au débit un peu plus lent (9,5 à 9,8 µL/min). Assurez-vous d’enlever toutes les bulles d’air dans le tube entier, qui peut-être influencer la récupération lorsqu’ils entrent dans la sonde.</li>
	<li>Anesthésier la souris de l’étape 1.12 de la même manière qu’à l’étape 1.2. Mettre le collier de souris autour de son cou. Enlever l’écrou et la sonde factice, lentement insérer une sonde de microdialyse de 3,4 à travers la canule guide et serrer l’écrou borgne.</li>
	<li>Place la souris dans la cage relié à un système de mouvement libre et une attache la souris avec le collier. Continuer à courir les pousse-seringue et pompe à rouleaux au débit indiqué dans l’étape 3.5 pendant au moins 1 h. Remarque : Pour obtenir la collection ISF des animaux éveillés, cet article utilise un système de mouvement libre, où la cage elle-même répond au mouvement de l’animal pour empêcher la torsion des tubes. Alternativement, émerillons liquides disponible provenant de diverses entreprises peuvent être également utilisés.</li>
	<li>Arrêter le rouleau pompe tout d’abord, puis le pousse-seringue. Régler le débit souhaité. Exécutez la seringue pompe 20 % plus rapide que la pompe à rouleaux. NOTE : par exemple, si vous exécutez à 1 µL/min, fonctionnent le pousse-seringue à 1.2 µL/min. débit optimale doit être déterminée empiriquement pour chaque molécule.</li>
	<li>Le prélèvement d’échantillons de l’ISF : Placez l’extrémité libre du tube de sortie sur le collecteur de fraction réfrigérés. NOTE : Volume de l’échantillon approprié varie en fonction des essais utilisés pour l’analyse.</li>
	<li>À l’issue de l’expérience, retirer la sonde. (Anesthésier la souris selon les besoins.)  Gérer la souris récupération la même manière qu’à l’étape 2.11. Analyser l’ISF collecté par des méthodes comme la CLHP ou ELISA.</li>
	<li>Pour laver le tube entier après la microdialyse, brancher l’entrée et tubes de sortie à nouveau en remplaçant la sonde avec la connexion d’aiguille et courir l’eau de Javel diluée dans le tube entier et puis de le rincer à l’eau. Sécher et stocker pour une utilisation répétée. Remarque : Autres types de tubes sont acceptables, cependant, BSA dans le tampon de perfusion peut boucher les tubes de petit diamètre, donc ces tubes sont considérés comme jetables. Les tubes peuvent être portés vers le bas ou bouché après plusieurs utilisations, alors assurez-vous que le débit est conforme à chaque fois avant de l’utiliser.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
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<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

L’auteur n’a rien à divulguer.

Microdialyse à haut poids moléculaire, couper des membranes doit être exploité par un mode push pull, donc il est essentiel que le débit soit fidèle et constante. L’inexactitude dans les débits peut être la cause de la génération de bulles d’air et l’incohérence de la concentration de l’échantillon. Si le flux est incohérent, vérifiez toutes les connexions des fuites. Si le problème persiste, il peut être nécessaire de re-commencer avec tubes et nouvelles sondes.
Microdilaysis sondes sont perf...

ISF est composé de 15 à 20 % du volume total cérébral et offre un micro-environnement critique pour la transduction du signal, transport du substrat et dégagement des déchets1. Donc, la capacité de collecte ISF auprès des animaux vivants offrira une plus grande implications pour les différents processus biologiques ainsi que le mécanisme de la maladie. In vivo la microdialyse est l’une des rares méthodes cet échantillon et quantifier les molécules extracellulaires d’ISF d’éveillé, se déplaçant librement les animaux et ce qui constitue un outil utile en neurosciences recherche champ2,3. Dans cette méthode, microdialyse sondes avec les membranes semi-perméables sont insérés dans le cerveau et perfusés avec du tampon de perfusion au débit relativement lente (0,1 à 5 µL/min). Au cours de cette perfusion, molécules extracellulaires dans ISF passivement diffusent dans la sonde selon le gradient de concentration et de recueillent un dialysat. Bien que cet article se concentre sur la méthode d’échantillonnage ISF dans le cerveau, tant le principe que la méthode peuvent être appliquées à d’autres organes par des modifications appropriées si nécessaire.
Microdialyse fut d’abord employé dans les années 1960 et depuis, puis il a été largement utilisé pour recueillir les petites molécules, y compris les acides aminés ou des neurotransmetteurs dans le cerveau. Cependant, la récente disponibilité commerciale de microdialyse sondes à poids moléculaire élevé, coupée de membranes (100 kDa-3 MDa) a élargi son application aux protéines relativement plus importantes dans l’ISF ainsi que4,5,6 ,7. Les études à l’aide de ces sondes a conduit à la conclusion que les protéines telles que tau ou α-synucléine qui ont été longtemps considérés comme exclusive cytoplasmique sont physiologiquement présents dans ISF4,5,8.
Une des difficultés à l’aide de sondes microdialyse avec grande coupure de membranes (en général plus 1 000 kDa) est qu’ils sont plus sensibles aux pertes de fluides ultrafiltration en raison de la pression intérieure accumulée dans les sondes. Microdialyse sondes utilisées ici ont une structure unique pour éviter ce problème. La pression ne sera pas construite vers le haut en raison de cette structure, ainsi la microdialyse avec ces sondes peuvent être exploitées dans un mode « Push-Pull » à l’aide d’un pousse-seringue à perfuse les sondes (= push) et une pompe péristaltique/rouleau pour recueillir le dialysat venant de la prise de la sonde (= tirer) 9 (même si elle a besoin de pompes de pousser et de tirer, en raison de la pression annulant les orifices de ventilation dans les sondes, le système est techniquement seulement piloté par la pompe d’extraction). Cet article commence par la chirurgie stéréotaxique d’une implantation de canule guide et décrit comment configurer la microdialyse lignes afin de recueillir l’ISF par microdialyse sondes avec des membranes de coupure 1 000 kDa.

<table><tbody><tr><td>Le microéchantillonneur Univentor 820</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>Collecteur de fractions réfrigéré</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à rouleaux</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>ERP-10</td> Raturn Système autonome BASi MD-1409 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Système à mouvement libre</td></tr><tr><td>Kit de cage bi-espèces</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sonde de microdialyse AtmosLM (longueur de l’arbre 8 mm, longueur de la membrane 2 mm)</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>PEP-8-02</td><td>La longueur de l’arbre d’une sonde, d’un guide, d’une sonde de modulation et d’un adaptateur stéréotaxique doit être identique.</td></tr><tr><td>Guide de microdialyse (longueur de la tige 8 mm)</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>Sonde factice de microdialyse (longueur de la tige 8 mm)</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>Vis à os</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super bond C& B set</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>Ciment dentaire</td></tr><tr><td>Petit animal Instrument stéréotaxique avec console d’affichage numérique</td><td>Kopf</td><td>Modèle 940</td><td>Appareil stéréotaxique</td></tr><tr><td>Adaptateur pour souris et rat nouveau-né</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Barres d’oreille standard et embouts en caoutchouc pour souris</td><td>Stoelting stéréotaxique</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’albumine de sérum bovin</td><td>Sigma</td><td>A7284-50ML</td><td>30 % BSA solution</td></tr><tr><td>FEP tube (70 cm)</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>JF-10-70</td><td>Volume interne = 0,5 &micro ; L/cm</td></tr><tr><td>Tube en téflon (50 cm)</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>JT-10-50</td><td>Volume interne = 0,08 & micro ; L/cm</td></tr><tr><td>Tube Byton</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur Luer stab Intramedic 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>Aiguille à extrémité arrondie</td></tr><tr><td>Tube à rouleau</td><td>Microdialyse</td><td>Eicom RT-5S</td><td>Volume interne = 4 &micro ; </td></tr><tr><td>Écrou borgne</td> en L <td>Microdialyse</td><td>Eicom AC-5</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 0,25 mL avec capuchon</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>Tubes pour collecteur de fractions</td></tr><tr><td>Adaptateur stérotaxique (longueur de l’arbre 8 mm)</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de raccordement</td><td>Microdialyse Eicom</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>Collier animal souris</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>Kit de micromoteur rotatif à grande vitesse</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Perceuse</td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Tournevis pour vis</td><td></td><td></td><td></td>à os</tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coton-tige</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse</td><td></td><td></td><td></td> chirurgicale</tr></tbody></table>

in vivo sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In vivo la microdialyse est une technique puissante pour recueillir l’ISF des animaux éveillés, agir librement basés sur un principe de la dialyse. Microdialyse est une méthode établie qui mesure relativement petites molécules, y compris les acides aminés ou neurotransmetteurs, il a été récemment utilisé pour évaluer aussi dynamique de molécules plus grosses dans l’ISF à l’aide de sondes à haut poids moléculaire coupé membranes. Lors de l’utilisation de ces sondes, microdialyse doit être exécuté en mode push pull pour éviter la pression accumulée à l’intérieur les sondes. Cet article fournit des protocoles étape par étape, y compris la chirurgie stéréotaxique et comment configurer les lignes microdialyse pour collecter les protéines de l’ISF. Au cours de la microdialyse, médicaments peuvent être administrés soit systématiquement, soit par injection directe dans ISF. Microdialyse inverse est une technique d’infuser directement composés en ISF. Inclusion des médicaments dans le tampon de perfusion microdialyse leur permet de diffuser dans l’ISF à travers les sondes alors qu’elles ramassaient simultanément ISF. En mesurant la protéine tau à titre d’exemple, l’auteur montre comment ses niveaux sont altérées lors de stimulation de l’activité neuronale par microdialyse inverse de la picrotoxine. Avantages et limites de la microdialyse sont décrits ainsi que l’application étendue en associant d’autres méthodes in vivo .

Pour stimuler ou inhiber l’activité neuronale dans la microdialyse inverse11,12,13, picrotoxine, antagoniste des récepteurs GABAA ou la tétrodotoxine, bloqueur des canaux Na+ ont été utilisés. Il a été démontré que tau libération est stimulée par l’augmentation de l’activité neuronale13,14. Compatible avec ces observ...

In vivo la microdialyse a permis la collecte des molécules présentes dans le liquide interstitiel de cerveau (ISF) des animaux éveillés, agir librement. Afin d’analyser les molécules relativement importantes dans l’ISF, l’article actuel se concentre spécifiquement sur le protocole de la microdialyse utilisant des sondes à haut poids moléculaire, couper des membranes.

In Vivo Sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche en neurosciences sur la façon dont le transport du substrat de transduction du signal et un dégagement des déchets se produisent dans les espaces extracellulaires du cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’échantillonnage et la quantification de grandes molécules extracellulaires dans le fluide interstitiel ou ISF d’animaux éveillés en mouvement libre. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils, retirez les cheveux du crâne d’une souris anesthésiée et utilisez les barres d’oreille et une pince nasale pour fixer solidement l’animal fixe sur un adaptateur.Appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et placez l’adaptateur sur l’appareil stéréotaxique. Utilisez un scalpel pour faire une incision cutanée sagittally sur le crâne et attacher une perceuse sur le manipulateur du cadre stéréotaxique. Abaissez la perceuse jusqu’à ce qu’elle touche doucement lambda et réinitialise la coordonnée DV de la perceuse à zéro.Ensuite, déplacez la perceuse à bregma pour réinitialiser les coordonnées AP et ML à zéro. Déplacez la perceuse de bregma à la coordonnée verticale. Abaissez la perceuse au crâne et réglez la coordonnée DV à zéro à nouveau.Après avoir répété la procédure pour une troisième coordonnée, percer soigneusement un trou de bavure à la coordonnée cible, suivi d’un deuxième trou sur le côté contralatéral de l’os pariétal. Insérez une vis osseuse dans le deuxième trou et placez le morceau de verrouillage à partir d’un couvercle de tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre sur le crâne de sorte que les trous de bavure sont dans le cercle. Ensuite, placez une canule guide sur le bras plus court de l’adaptateur stéréotaxique et attachez la canule avec un écrou de bouchon.Réglez le bras plus long de l’adaptateur stéréotaxique sur la pince d’électrode et fixez le bras sur le manipulateur de l’appareil stéréotaxique. Faites pivoter l’assemblage stéréotaxique DV sur le bras manipulateur de 12 degrés et déplacez la canule du guide vers le trou de bavure. Ensuite, abaissez lentement la canule guide de 1,2 millimètre dans le cerveau.Ajouter du ciment dentaire à la couronne jusqu’à ce que la partie métallique de la canule guide, la vis osseuse et tout crâne exposé soient couverts et fixés et permettent au ciment de sécher. Après 12 à 20 minutes, retirez l’adaptateur stéréotaxique de la pince à électrode, retirez l’écrou du bouchon et remplacez l’adaptateur stéréotaxique par une sonde factice. Ensuite, refasten l’écrou bouchon, libérer la souris de l’appareil stéréotaxique, et abriter la souris seule dans une cage individuelle.Avant de mettre en place la microdialyse, remplissez une seringue jetable d’un millilitre d’eau distillée et utilisez un tube viton pour connecter la seringue à la sortie d’une sonde de microdialyse. Couvrez manuellement les trous d’évent et déprimez doucement le piston de seringue pour infuser la sonde avec de l’eau. Confirmer que de l’eau apparaît dans l’entrée de la sonde et qu’il y a une fuite à la surface de la membrane de microdialyse.Pour activer la sonde, submergez les membranes de la sonde dans 70-100% éthanol pendant deux secondes, suivie d’une deuxième infusion d’eau distillée. Fixez une aiguille de raccordement à une entrée et une ligne de sortie et chargez une seringue jetable de trois millilitres avec tampon de perfusion fraîchement préparé. Connectez une seringue munie d’une aiguille émoussée à l’extrémité de l’entrée du tube et utilisez une pompe à seringues pour remplir l’ensemble du tube d’un tampon de perfusion.Lorsque le tube est plein, remplacez l’aiguille de raccordement entre les lignes d’entrée et de sortie par la sonde de microdialyse activée et l’écrou de bouchon et montez un tube à rouleaux dans le tube de sortie sur une pompe à rouleaux. Démarrez la pompe à seringues à 10 microlitres par minute et la pompe à rouleaux à 9,5-9,8 microlitres par minute. Placez maintenant le collier autour du cou de l’animal implanté anesthésié de canule de guide et enlevez l’écrou de chapeau et la sonde factice.Insérez lentement la sonde de microdialyse à travers la canule guide et attachez l’écrou du bouchon. Ensuite, placez la souris dans une cage reliée à un système en mouvement libre et attachez la souris avec le collier. Après au moins une heure, arrêter séquentiellement la pompe à rouleaux et la pompe à seringues, redémarrer les pompes avec la pompe à seringue réglée à 20% plus vite que la pompe à rouleaux et placer l’extrémité libre du tube de sortie sur un collecteur de fraction réfrigéré pour recueillir le cerveau ISF.Lorsque le volume expérimental approprié a été obtenu, retirez la sonde et manipulez la récupération de la souris comme nous venons de le démontrer. Conformément aux observations précédentes, lorsque 50 picrotoxines micromolaires sont administrées par microdialyse inverse comme l’ont démontré les souris éveillées C57B6J, une augmentation des niveaux interstitiels de tau endogène est observée par rapport aux niveaux mesurés chez les animaux traités avec un contrôle du véhicule. En plus des administrations pharmaceutiques, la microdialyse peut être combinée avec d’autres méthodes in vivo comme l’enregistrement EEG ou l’optogénétique pour répondre à d’autres questions sur la façon dont l’activité neuronale influence la concentration du substrat dans l’ISF.

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La surveillance des niveaux de neurotransmetteurs extracellulaire dans les régions cérébrales distinctes d'animaux se déplaçant librement offre un aperçu sur le lien entre la libération des neurotransmetteurs et des comportements. En microdialyse in vivo couplée à une détection électrochimique fournit anatomiques et une résolution excellentes chimiques et des informations sur la façon dont la neurotransmission basale est altérée par des manipulations pharmacologiques ou physiologiques.

Survivable chirurgie stéréotaxique chez les rongeurs

Modulation de charge hippocampally-mémoire de travail spatiale par micro-injection directe intrahippocampique, accompagnée et suivie...

La micro-injection d&#39;insuline de l&#39;hippocampe et<em&gt; In vivo</emMicrodialyse&gt; Test de la mémoire spatiale cours

La vidéo montre le processus d’utilisation d’une sonde de microdialyse pour collecter des protéines extracellulaires du liquide interstitiel (ISF) du cerveau d’une souris. Une sonde de microdialyse, équipée d’une membrane semi-perméable de coupure de haut poids moléculaire, est insérée dans le cerveau d’une souris anesthésiée via une canule guide implantée. La sonde, reliée à des pompes, permet à un tampon physiologique de perfuser le tissu cérébral et de se mélanger à l’ISF. Les protéines de...

Microdialyse du liquide interstitiel d’un cerveau de souris pour isoler des protéines extracellulaires

Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.

Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d&#39;extraction pour l&#39;étude de l&#39;homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting

Microdialyse est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Par conséquent sondes commerciales sont en grande demand.In ce travail un ensemble de sonde est expliqué en détail à construire une concentrique, sonde de microdialyse fiable, sur mesure pour moins de 10 $.

Sur mesure Microdialyse Probe Conception

Ici, on décrit une méthode pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de la membrane. Ce protocole a l’avantage clair de produire des microvaisseaux enrichi échantillons avec la protéine acceptable donnent sur des animaux. Échantillons peuvent être ensuite utilisés pour les analyses de protéines robuste à l’endothélium microvasculaire cérébral.

Une méthode Simple et reproductible pour préparer les échantillons de la Membrane des microvaisseaux de cerveau de Rat fraîchement isolées

Nous décrivons ici une méthode pour en vivo microdialyse analyser le communiqué de l’aspartate et du glutamate dans l’hippocampe ventral de rats épileptiques et non-épilepsie, en combinaison avec des enregistrements EEG. Les concentrations extracellulaires de l’aspartate et le glutamate peuvent être corrélées avec les différentes phases de la maladie.

Microdialyse d’acides aminés excitateurs durant les enregistrements EEG en se déplaçant librement des Rats

Le protocole fournit ici un échantillonnage dynamique détaillé en temps réel du liquide extracellulaire de l’hippocampe de rats éveillés à l’aide d’un système de microdialyse.

Collecte dynamique en temps réel de liquide extracellulaire hippocampique de rats conscients à l’aide d’un système de microdialyse

In vivo, les communications intercellulaires à l’origine de nombreuses maladies du système nerveux central, telles que le glioblastome (GBM), sont notoirement difficiles à mesurer et à caractériser. Ici, nous décrivons les procédures de microperfusion cérébrale à flux ouvert (cOFM) qui peuvent être utilisées pour échantillonner des composants du liquide interstitiel dans un modèle animal longitudinal de GBM.

Utilisation de la microperfusion cérébrale à flux ouvert pour la collecte longitudinale de liquide interstitiel dans un modèle animal de glioblastome

Enregistrements extracellulaires de l'activité neuronale en utilisant des sondes de silicium chez le rat anesthésié seront décrites. Cette technique permet d'obtenir des informations à travers de multiples zones du cerveau de plus de 100 neurones simultanément. Il fournit des informations avec une résolution cellule unique sur la dynamique des ensembles neuronaux dans de multiples circuits locaux.

Enregistrement à grande échelle ensembles neuronaux avec des sondes en silicone chez le rat anesthésié

Découvrez la microdialyse in vivo avec des sondes à seuil de poids moléculaire élevé pour échantillonner de grosses protéines extracellulaires dans le liquide interstitiel cérébral de souris éveillées. Cette technique permet d'étudier la signalisation neuronale et l'élimination des déchets.

In Vivo Sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé (Vidéo) | JoVE Journal

In Vivo Sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé

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