Name: À long terme In Vivo suivi de la dynamique de cellules inflammatoires dans les pupes de la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Découvrez l'imagerie à long terme de la réparation des plaies et de la réponse inflammatoire chez les pupes de Drosophile. Cette méthode permet de suivre les hémocytes et d'étudier l'immunité innée en temps réel.

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Nous tenons à remercier les membres du Martin, Nobes, Richardson et laboratoires bois de discussion utile. Nous remercions également l’installation de bio-imagerie Wolfson (Université de Bristol, UK), Bloomington Stock Centre (Université de l’Indiana, USA) et Vienne Drosophila Resource Centre (pour les stocks de drosophile ) et Flybase (pour à jour Drosophila une annotation des gènes). Ce travail a été soutenu par une subvention de projet CRM à heures et W.W. (MR/J002577/1), un Wellcome Trust Senior Fellowship à W.W. et une bourse de chercheur Wellcome Trust à heures.

Ce protocole se compose de quatre étapes principales : (1) préparation des stocks de la drosophile et mise en scène de pupes de drosophile , dissection pupe (2) et montage, blessant pupe (3), (4) l’imagerie confocale in vivo Time-lapse.
1. préparation des Stocks de la drosophile et mise en scène de nymphes
<ol><li>Obtenir les stocks de Drosophila appropriés (voir Introduction et Table des matières).</li>
	<li>Recueillir les jeunes mouches adultes sains du génotype approprié.<ol>
<li>Sélectionnez adulte vole à l’aide des touches de gaz de dioxyde de carbone à anesthésier brièvement les mouches et un pinceau fin pour transférer les mouches du génotype approprié ou de sexe dans un flacon de collection.</li>
		<li>Ajouter 20 femelles vierges et 20 mâles à chaque flacon contenant des médias de norme alimentaire mouche (un mélange de semoule de maïs-mélasse-agar, voir Table des matières) additionné de levure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour la génération de pupe optimale, pointe l’adulte vole chaque jour sur la nouvelle nourriture dans des flacons fraîches, gardant tous les flacons à 25 ° C. Remarque : Si le système de Gal4-UAS31 est utilisé pour piloter l’expression génétique de la lignée spécifique, toutes les étapes devraient être effectuées à 25 ° C ou plus haut, que le système de Gal4-UAS est sensible à la température.</li>
	<li>18 h avant la séance d’imagerie régulier, sélectionnez au moins 10 nymphes nouvellement formés de blancs avant (Figure 1 a) dans les flacons (c'est-à-dire 0 h après la formation du puparium, CSA) à l’aide de forceps ou un pinceau fin pour déloger les nymphes de la surface de la cuvette intérieure et nymphes de transfert soigneusement sur le côté d’un flacon en plastique propre vide. Remarque : Errant 3rd stade larvaire ramper vers le haut hors milieu alimentaire à subir la nymphose ; prénymphes blancs néoformés sont facilement identifiables car ils possèdent des stigmates antérieures éversés et restent fixes (à la différence des larves de stade 3rd ). La cuticule se transforme en « puparium » (la pupe) qui est initialement doux et blanc17. Il faut pour éviter d’endommager les pupes, car cela peut entraîner non seulement à une réaction inflammatoire induite par la blessure de non désirée, mais aussi à un retard de développement important.</li>
	<li>L’âge de la pupe sélectionnée à l’étape de développement approprié (18 h CSA donnera des résultats optimaux) dans le flacon à 25 ° C. Remarque : Comme les nymphes se développent, la pupe deviendra progressivement plus sombre et plus fragile.</li>
	<li>Préparer les autres réactifs à la prochaine étape avance. Pour rendre l’heptane colle, combiner une longueur de 20 cm de ruban double-face de roulé vers le haut avec l’heptane 20 mL dans un tube à centrifuger 50 mL, joint avec le film de paraffine et rock à la température de la pièce toute la nuit sur le banc.</li>
</ol>2. préparation et Dissection des pupes de drosophile 
<ol><li>Transférer les pupes de Drosophila mises en scène sur un morceau de bande adhésive double-face, monté sur une lame de verre. Positionner les pupes de sorte que la face ventrale est fermement collée à la bande et la face dorsale est vers le haut (Figure 1 b). Remarque : La partie antérieure de la chrysalide sera identifiable par les deux stigmates qui dépasse de l’extrémité antérieure de la pupe.</li>
	<li>Retirez soigneusement les pupes de leur enveloppe protectrice puparium sous un microscope à dissection fond clair à l’aide de pinces et ciseaux micro-(Figure 1 b-D).<ol>
<li>Au départ, faites une incision dans la région antérieure plus le puparium à l’aide de la pince (Figure 1 b). Assurez-vous que la pupe dans ce domaine est creuse et dépourvue de pupe tissu car les nymphes seront ont diminué dans le cas au cours du développement de la pupe.</li>
		<li>Après cette incision initiale, soigneusement déchirer ou couper la pupe en antéro-postérieure direction à l’aide de forceps ou microciseaux (Figure 1) jusqu'à ce que la chrysalide est offert gratuitement de l’enveloppe en cassant opaque brun (Figure 1). Remarque : Les nymphes à ce stade sont très fragiles et il faut pour éviter de percer la surface de la pupe ; Il est évident de percer comme hémolymphe s’écoule rapidement sur le site de ponction. Nymphes avec perforations, même minime, doivent être jetées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter les pupes dans un plat à fond de verre à l’aide de colle de l’heptane.<ol>
<li>Une pointe de pipette de 20 mL permet de déposer une goutte de 10 mL de colle heptane préparés à l’avance (voir la section 1.6 ci-dessus) en ligne sur le plat à fond de verre.</li>
		<li>Laisser la colle sécher pendant 5 s avant de transférer les pupes disséqués avec soin sur la colle heptane à l’aide de pinces (Figure 1E).</li>
		<li>Pour faciliter la blessure et l’imagerie, alignez les pupes d’affilée ; environ 5 nymphes sont suggérées, mais plus pourront être gérés avec expérience. Remarque : Utilisation de la colle de l’heptane est recommandée lors de l’utilisation des systèmes d’imagerie verticale mais n’est pas nécessaire lorsque vous utilisez un système inversé. Si la colle crée optique des aberrations au cours des pupes d’imagerie, peuvent être placées directement sur la lamelle à la place – l’adhérence naturelle entre le tissu pupe et le verre sera suffisante dans la plupart des cas pour l’imagerie stable tant que soin lors du déplacement de l’imagerie plat entre les microscopes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour de meilleurs résultats, montez les pupes de sorte que l’aile est plate sur la lamelle avec la majorité de la surface de l’aile en contact direct avec le couvre-objet (Figure 1F). Rouler les pupes avec une pincette pour changer leur position pour s’assurer que l’aile est montée correctement.</li>
	<li>Pour prévenir la déshydratation d’échantillon pendant la période de formation image, ajouter un morceau de papier filtre absorbant imbibé d’eau distillée sur le côté du fond de verre plat à la fin du montage, en veillant à ne pas déranger les pupes (Figure 1E). Couvrir le plat avec un couvercle. Note : Nymphes sont maintenant prêts pour blesser et l’imagerie.</li>
</ol>3. laser-induced blessant de Drosophila ailes Pupal
<ol><li>Placer la capsule à fond de verre, contenant les nymphes montées à un microscope à champ large équipé d’un système d’ablation laser accordable.<ol>
<li>Utiliser un laser pulsé-UV refroidi à l’air pompé azote ablation accordé à 435 nm – Voir la Table des matières pour détails11; la longueur d’onde précise de la lumière utilisée pour l’éclairage est sélectionnée par l’utilisateur via une cellule de colorant approprié.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aide optique fond clair, réglez les commandes de stade de microscope pour localiser l’aile pupe de la première nymphe d’être blessé (Figure 1F).</li>
	<li>Pour des résultats optimaux, utilisez un huile d’immersion 40 X ou 63 X objectif pour les deux l’imagerie et laser ablation ; s’assurer que le liquide d’immersion utilisé (huile ou glycérol) est cohérent entre l’ablation et les systèmes d’imagerie. Régler le microscope de se concentrer sur le plan de l’épithélium nymphal aile le plus proche de la lamelle de verre (c'est-à-dire la mise au point sur la région de l’épithélium se blesser) à l’aide de la molette de mise au point fine.</li>
	<li>En utilisant les réglages de phase de microscope, positionner l’aile pupal afin que la zone de se blesser est directement alignée avec la zone cible connue du laser ablation.</li>
	<li>Une diapositive d’atténuateur de densité d’énergie montée sur le microscope permet de régler manuellement le niveau de puissance de la lumière de l’ablation. Remarque : Le curseur de l’atténuateur a Crans et arrêts d’identifier le niveau relatif d’atténuation et de permettre l’utilisation de paramètres reproductibles.</li>
	<li>À l’aide d’un contrôle externe manuel déclencheur , activer le laser ablation en utilisant un simple clic bref sur la détente pour faire une blessure. Vérifier l’apparition de la bulle d’air transitoire sur le site de l’ablation car blessant sera normalement accompagné. Vérifier si la blessure induite par laser a été un succès en utilisant les filtres appropriés fluorescents pour visualiser l’épithélium nymphal. Remarque : veiller à éviter une exposition accidentelle à des faisceaux laser car les réflexions de faisceau peuvent causer de graves ou dommages de la peau.</li>
	<li>Si la blessure est infructueuse, varier le plan focal (déplacement de l’accent de microscope légèrement au-dessus ou au-dessous du niveau actuel de focal) et répétez le simple clic sur la détente de l’ablation. Vous pouvez également augmenter progressivement la puissance du laser à l’aide de la glissière de l’atténuateur jusqu'à ce que la taille de la plaie désiré est atteint.</li>
	<li>Pour faire varier la fréquence de répétition du pouls ablation laser, utilisez le bouton de la fréquence de répétition sur le panneau arrière (qui modifie le taux de moins de 1 impulsion/s jusqu'à 60 Hz). Pour blessant optimale, définissez le taux de répétition des impulsions à 40 Hz.</li>
	<li>Pour générer des plaies de tailles différentes, utilisez la diapositive d’atténuateur de densité d’énergie pour régler manuellement le niveau de puissance de la lumière de l’ablation.</li>
	<li>S’abstenir de toutes les nymphes montées blessant et utiliser ces nymphes non-ablation comme témoins non blessés.</li>
	<li>Pour des résultats uniformes, régulièrement réaligner le système d’ablation (à l’aide de la notice d’instructions correspondante). En outre, nettoyer et remplir la cellule de résonateur de colorant qui contrôle la longueur d’onde de sortie laser.</li>
</ol>4. imagerie confocale Time-lapse in Vivo 
<ol><li>Transférer rapidement le plat à fond de verre d’un microscope approprié pour l’imagerie Time-lapse. Remarque : Pour des résultats optimaux, utilisez une haute spécification confocale ou microscope à disque tournant avec des détecteurs sensibles capables de détecter des fluorophores fois GFP et mCherry.</li>
	<li>Pour l’aile pupal toute l’image, utilisez un objectif de faible grossissement (p. ex. 20 X) (Figure 2 a). Pour la réparation de l’image enroulé et la réponse inflammatoire qui l’accompagne avec une résolution spatiale élevée, utiliser l’immersion dans l’huile 40 X (NA 1.3) ou 63 X (NA 1.4) lentilles de l’objectif (Voir images représentatives dans la Figure 2 b-D).</li>
	<li>Ouvrez le logiciel de capture d’image appropriée associé au microscope.</li>
	<li>En utilisant le logiciel de capture d’image, allumez le laser approprié par exemple les 488 nm et 561 nm lasers, à visualiser les fluorophores GFP et mCherry, respectivement (en cliquant dans les cases pertinentes) et ajuster la puissance du laser et gain ou compenser les paramètres pour donner signal fluorescent suffisant tout en évitant la saturation des pixels ; Utilisez la puissance du laser possible le plus bas (dans la gamme 5-20 %) afin de minimiser le photoblanchiment et phototoxicité.</li>
	<li>Pour capturer les deux la réparation épithélium et recrutement des cellules inflammatoires, régler le microscope pour enregistrer une z-conduite en utilisant les boutons de réglage de mise au point fine sur le panneau de commande ; pour des résultats optimaux, configurez le logiciel (à l’aide de clics de bouton manuels) record z-tranches dans l’aile pupe (tous les 3 mm au minimum), du haut de l’épithélium blessé par le biais de l’espace extracellulaire sous (contenant les hémocytes migration) pour atteindre une grande z-pile (de l’ordre de 50-100 mm).</li>
	<li>Pour l’imagerie Time-lapse, enregistrer z-piles à intervalles de temps réguliers (minimum toutes les 30 s) au moins 1 h après blessure. Nota : L’intervalle de temps exacte entre z-piles choisi représente un équilibre entre la capture la dynamique cellulaire change rapidement et d’éviter les photo-blanchiment des échantillons.</li>
	<li>Pour l’image simultanément plusieurs chrysalides (y compris les contrôles non blessés non-ablation), utiliser une platine motorisée (attaché au microscope) et la fonction acquisition multi-positions disponible dans le logiciel d’imagerie. Définir manuellement la position de chaque chrysalide individuel au sein du logiciel en utilisant les boutons de commande de position de scène et ensuite définir manuellement les limites appropriées z-pile (haut et bas) pour chaque chrysalide individuel.</li>
	<li>Visualiser les images de Time-lapse pendant la capture d’image ou plus tard avec le logiciel d’analyse image de spécialiste (par exemple ImageJ32) à l’aide de projections de z-pile ou le rendu 3D. Par exemple, pour suivre les mouvements des hémocytes individuels (comme dans la Figure 2' et D'), piste hémocytes noyaux à l’aide de l’accès libre ImageJ plug-ins « TrackMate » ou « Manuel Tracking » (les méthodes publiées dans 33, ( 34).</li>
	<li>Utiliser et sondes (tels que Kaede30) de manière sélective photoconvert et l’étiquette un sous-ensemble de cellules épithéliales ou immunitaires au cours de l’imagerie.<ol>
<li>Ouvrir des modules appropriés au sein du logiciel d’imagerie pour effectuer la photoconversion (comme du PAF, récupération de fluorescence après blanchiment photo module) et activer le 405nm laser (en cliquant dans la boîte de logiciel approprié)35.</li>
		<li>Sélectionnez les cellules à être photoconverted dans le logiciel de PAF à l’aide de l’outil de sélection carrée, circulaire ou à main levée. Au sein du logiciel FRAP, affectez l’évolution temporelle de la photoconversion (blanchiment) d’une seule itération/image et 405 nm laser à la puissance de laser de 20 %. Manuellement, cliquez sur lancer le test pour exécuter photoconversion.</li>
		<li>Quitter le module FRAP (cliquez sur Fermer) et revenir à l’écran d’imagerie d’origine au sein du logiciel ; utilisation du 488 nm et 561 nm lasers afin d’imager le comportement des cellules photoconverted et non-photoconverted en mettant en place un z-pile et enregistrement Time-lapse comme ci-dessus. Remarque : Photoconverted sondes restent stables pendant de longues heures après la photoconversion initiale, ce qui permet le comportement des cellules photoconverted à suivre au fil du temps (pendant au moins 5 h). Par exemple, des cellules inflammatoires dans la plaie peuvent être sélectivement photoconverted (Figure 2F) et leur comportement suivi qu’ils résolvent depuis le site de la lésion (Figure 2 et H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas concurrentes de conflits d’intérêts.

La réaction inflammatoire aiguë aux dommages de tissu est un processus complex et très dynamique qui est essentiel pour orchestrer la réparation des tissus lésés, y compris la compensation des débris nécrotiques et la lutte contre l’infection. Pour bien comprendre et démêler les aspects fondamentaux de cette réponse, il est crucial que des études sont effectuées in vivo sur des échantillons de vie 3-dimensionnelle afin que le comportement précis et les interactions des différentes cellules lignées concernées à suivre avec précision au fil du temps. Analyse en temps réel de la dynamique de ces cellules permet une caractérisation plus détaillée des phénotypes mutants que statiques unique-moments d’échantillons fixes en utilisant des techniques d’immunohistochimie classique. Traditionnellement, la plupart des études d’imagerie en direct en utilisant le modèle drosophile génétiquement tractable ont utilisé le stade embryonnaire du développement de la mouche grâce à sa translucidité optique et l’immobilité comparée aux stades ultérieurs4 , 5. Cependant, plus récemment notre groupe et autres ont mis au point la nymphe de la drosophile comme un modèle original pour effectuer à haute résolution et imagerie à long terme de cicatrisation et l’inflammation en même temps in vivo8,22 ,,23. Cette nouvelle approche offre un potentiel à long terme passionnant pour démêlé les aspects fondamentaux du comportement de cellules inflammatoires et peut être plus adaptée pour enquêter sur le comportement dynamique des autres lignages cellulaires (par exemple les adipocytes de la drosophile 38) après une lésion tissulaire.
Il y a un certain nombre de facteurs critiques lors de la préparation et l’imagerie des pupes de Drosophila blessés qui va déterminer la qualité des résultats d’imagerie décrit ci-dessus. Sans doute l’étape la plus difficile du protocole décrit est la dissection minutieuse et un positionnement précis de la pupe avant blessant et l’imagerie. Nymphes à ce stade de développement sont extrêmement fragiles et le moindre dommage accidentel à la chrysalide pendant les étapes de la préparation nuira considérablement l’expérience ; les nymphes qui ont subi des dommages involontaires doivent être éliminés de l’expérience puisque ce dommage pourrait activer sa propre réponse inflammatoire, ce qui pourrait conduire à des effets plus répandue (ou même systémiques) sur le comportement de cellules inflammatoires ailleurs dans la chrysalide. En raison de l’évolution de la pupe utilisées dans ces expériences (qui subissent des réarrangements des tissus importants pour préparer les tissus à l’âge adulte), parfois les nymphes seront déplacera au cours de l’imagerie. Pupes de roulement est, cependant, plus susceptibles de se produire si les nymphes n'ont pas été montés correctement avec la surface plate de l’aile (ou d’autres tissus à être photographiée) dans le contact direct avec la lamelle ; utilisation de la colle d’heptane pour stabiliser les pupes sur la lamelle couvre-objet doit minimiser ce mouvement indésirable. Pour cette raison, grand soin doit également être prise pour éviter délogeant les pupes postées soigneusement alignés lors du déplacement des échantillons entre les microscopes ; Idéalement, le blessant laser sera joint au microscope même à être utilisé pour l’imagerie de Time-lapse ultérieur et photo-conversion.
En plus de la compétence de la dissection pupe et les étapes de montage, le génotype exact de la pupe de Drosophila utilisée aura un effet significatif sur la qualité des données d’imagerie générées. Par exemple, le nombre de copies du pilote Gal4 et constructions de SAMU (p. ex. SAMU-GFP ou SAMU-Kaede) au sein d’un génotype pupal individuel déterminera le rapport signal sur bruit en imagerie ultérieur. En règle générale, les plus exemplaires de Gal4 ou SAMU construisent actuellement, le plus élevé le niveau total de la protéine fluorescente (p. ex. GFP ou Kaede) dans les tissus. Le niveau optimal de la protéine fluorescente sera, toutefois, un équilibre délicat entre les élévateurs fluorescence de tissu suffisamment pour permettre de haute qualité d’imagerie (permettant l’utilisation de puissances inférieures de laser, réduction photobleaching et imagerie au fil du temps étendu périodes) mais sans provoquer de toxicité cellulaire induite par le fluorophore ; le nombre optimal de constructions Gal4 et SAMU dans chaque expérience varieront selon les conducteurs particuliers et fluorophores utilisés. Il faut soulever la pupe à 25 ° C (ou plus haut, jusqu'à 29 ° C) car le système de Gal4-UAS est sensible à la température et sera inefficace à basse températures31. Afin d’atteindre des niveaux supplémentaires de contrôle sur le tissu ou temps-spécificité de Gal4-piloté par expression, le répresseur de système de Gal4-UAS Gal80 peut également être inclus dans le génotype pupal39. Gal80 peut soit servir à réprimer l’activité de Gal4 au sein d’un tissu particulier (à l’aide d’un Gal80 de tissu-spécifique) ou à un moment donné (à l’aide d’une température Gal80 sensibles). Le système de Gal4-UAS peut être combiné avec d’autres systèmes binaires indépendants (comme la LexA -lexAop et systèmes de QF -QUAS ) pour générer la drosophile qui a des constructions multiples (p. ex. des fluorophores, Arni lignes ou autres constructions génétiques) exprimé en même temps dans une gamme de différents tissus,39.
Utilisation de ce nouveau modèle de pupes de Drosophila offre un certain nombre d’avantages par rapport à l’approche plus traditionnelle de l’embryon. Par rapport à l’imagerie à court terme (jusqu'à 3 h) disponible dans les embryons au stade 15 (le stade auquel plus embryonnaires blessant des études sont effectuées), nymphes peuvent être photographiées sur une période beaucoup plus longue (en principe jusqu'à l’âge adulte après 96 h de développement pupal ). De plus, bien plus grand nombre d’hémocytes (cellules immunitaires innées dedrosophile ) est présentes au sein des tissus pupes (et disponible pour l’imagerie) par rapport au nombre plus limité dans l’embryon et cela nous a permis de recueillir beaucoup plus données d’imagerie sur le comportement de hémocytes utilisant le même nombre total de spécimens. Fondamentalement, ceci, à son tour, nous a permis d’appliquer les plus sophistiqués de modélisation mathématique pour analyser le comportement de hémocytes et extraire des caractéristiques nouvelles de la plaie attractifs et la réaction inflammatoire qui serait autrement restées expérimentalement inaccessible23. Un autre avantage du modèle nymphal est que cette précipitation RNAi-mediated gene est considérablement plus efficace qu’au plus tôt des stades embryonnaires, ce qui permet d’améliorer l’analyse de tissu ou de l’inactivation de gènes précis à l’aide de systèmes binaires tels que le système de Gal4-UAS 39. l’efficacité de l’ARNi à ce stade ouvre ainsi la possibilité d’effectuer à grande échelle (ou même non biaisée Génome-large) Arni écrans pour rechercher des nouveaux acteurs impliqués dans la réparation de plaie ou le comportement de cellules inflammatoires.
Cependant, Drosophila nymphes clairement ne peuvent servir à étudier les phénotypes résultant de mutations génétiques qui sont embryonnaires létale ; des études fonctionnelles et d’images en direct des gènes qui sont essentiels pour le développement embryonnaire doivent donc encore être effectuées chez les embryons, sauf se knockdown gène véhiculée par ARNi en une fois ou de manière spécifique aux tissus permet le développement de se produire à travers aux stades nymphales. L’embryon reste également le modèle de choix pour étudier et image en direct certaines caractéristiques du comportement de cellules immunitaires, dont la dispersion du développement des cellules immunitaires dans leur origine, contact-inhibition de la locomotion et de la phagocytose de corps apoptotiques généré au cours du développement tissulaire sculpture5,8 , qui n’ont pas encore été observés dans les modèles de nymphes. Bien que les études chez les larves de drosophile et les adultes ont fourni un aperçu important dans les mécanismes qui sous-tendent la plaie réparation et inflammation40,41,42,43, études d’imagerie live 44 à ces stades ont prouvé difficiles en raison de la nature intrinsèquement mobile des échantillons. Tandis que les larves peuvent être anesthésiés pour permettre à de brèves périodes de création d’images en direct, en raison du caractère temporaire de l’anesthésie, seulement quelques instantanés de la plaie direct réparera ou réaction inflammatoire peut être visualisée45. Une étude récente vient de développer un protocole amélioré qui permet l’imagerie à plus long terme des larves de cicatrisation46, bien que la préparation et imagerie encore demeurent considérablement plus difficile que dans des embryons ou des nymphes. Sur le long terme, nous envisageons qu’en utilisant le stade de développement plus approprié pour répondre à chaque question spécifique, études dans quatre de ces différentes étapes de la drosophile - d’embryons entre des périodes de larves et les nymphes à l’âge adulte (chacune avec leurs propres avantages uniques et limitations) - fournira des idées complémentaires dans les mécanismes moléculaires et cellulaires conduisant la cicatrisation et l’inflammation.
À l’avenir, ce protocole pour blessant et imagerie à long terme des pupes de drosophile peut être facilement adapté pour étudier une série de phénomènes liés à l’inflammation et a un potentiel de grande envergure pour découvrir de nouvelles caractéristiques de la réponse inflammatoire plaie. La combinaison de l’imagerie à long terme, ainsi que l’application des fluorophores et (par exemple, Kaede), sont d’une grande utilité pour comprendre la dynamique du comportement de cellules immunitaires innées et en particulier l’extrême comprend moins phase de résolution de la réponse inflammatoire de la plaie. Par marquage particulier soit particulier ou sous-populations de cellules immunitaires (par exemple ceux recrutés sur une blessure), il sera possible d’analyser comment l’exposition à un environnement cue (comme un cadavre ou blessures) affecte réponse subséquente de la cellule immunitaire à un plus tard CUE. Le comportement inflammatoire de Drosophila hemocytes peut être modifié par des expériences antérieures - par exemple, ils sont apprêtés pour répondre à des lésions tissulaires par phagocytose préalable de corps apoptotiques au cours du développement,12 , mais il reste à voir Si autres signaux environnementaux induire des événements similaires d’amorçage. Bien que les études des pupes plaies jusqu'à présent ont porté sur la réponse inflammatoire innée, le modèle de pupes aile aussi fournit une occasion idéale pour les deux image en direct et disséquer les mécanismes qui sous-tendent la cicatrisation épithéliale. En outre, cette méthode d’imagerie pupale pourrait également être adaptée pour étudier le comportement dynamique des autres lignages cellulaires en réponse aux tissus des dommages38, soit dans l’aile pupal lui-même ou d’autres tissus pupes facilement accessibles (par exemple, les yeux, les jambes ou thorax). Enfin, en combinant la traçabilité génétique de la drosophile , ainsi que la facilité de l’imagerie pupe à long terme, roman réparation épithéliale ou régulateurs inflammatoires pourraient être découverts grâce à l’application de précipitation impartiale pangénomique approches.

Une réaction inflammatoire et efficace est essentielle pour n’importe quel organisme à combattre l’infection, dégager les débris et orchestrer la réparation des tissus lésés1. Bien que cette réponse est une conséquence inévitable de la plupart des lésions tissulaires, inflammation nécessite une réglementation stricte, car une réponse inflammatoire inappropriée a été liée à une variété de différentes maladies humaines (y compris les plaies chroniques non-guérison, cicatrisation excessive et la prédisposition au cancer)1,2,3. Compte tenu de cette pertinence clinique, il est crucial d’obtenir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires conduisant la réponse inflammatoire afin de développer de nouveaux indicateurs pronostiques et stratégies pour traiter un éventail de chroniques inflammatoire conditions, qui pourraient protéger la réparation des tissus d’une inflammation prolongée et inutile.
Ces dernières années, Drosophila est devenu un système de modèle bien établi et précieux à disséquer les caractéristiques fondamentales de la réponse inflammatoire conservé des insectes humains4,,5. À l’heure actuelle, Drosophila offre bien plus grande traçabilité génétique est actuellement possible dans d’autres modèles expérimentaux (comme souris ou poisson zèbre), permettant des manipulations génétiques spatio-temporel précis en vivo (pour inactiver ou surexpression de n’importe quel gène d’intérêt dans les types spécifiques de cellules à un moment du développement défini) et facilité de Génome-large d’écrans6,7. Traditionnellement, la plupart des études d’imagerie en direct de la cicatrisation des plaies et de l’inflammation chez la drosophile ont été jouées dans des stades embryonnaires, comme les embryons sont immobiles (contrairement aux larves de drosophile ou adultes) et optiquement translucide qui permet inégalée de haute résolution en vivo imagerie8. Cela a permis aux chercheurs de visualiser le recrutement rapid et robuste de cellules immunitaires innées de drosophile (hémocytes) sur le site de la plaie en réponse au dommage mécanique ou induite par laser à l’épithélium embryonnaires9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. en combinant ces études d’imagerie en direct avec la manipulation génétique, des études dans des embryons de drosophile ont mis au jour plusieurs protéines importantes cellules immunitaires qui contrôlent le comportement de cellules inflammatoires in vivo. Par exemple, l’homologue de CED-1 Draper (une protéine du domaine contenant ITAM) a été identifié comme un important « endommager récepteurs » qui intervient dans les cellules immunitaires de drosophile de recrutement dans un H2O2-façon dépendante aux sites de endommager le15. Niveaux de Draper dans les cellules immunitaires relèvent à leur tour induit par JNK signalisation et élevé en aval de l’apoptose cadavre absorption12. Outre la motilité hémocytes nécessite des modifications du cytosquelette complexes pour coordonner une migration dirigée vers la plaie et cela dépend de l’activité des organismes de réglementation du cytosquelette comme l’actine-groupement protéine Fascin16 et de la famille Rho petite Rho et GTPases Rac9.
Drosophile est un insecte holométaboles qui passe par les stades de larves et les nymphes supplémentaires suivant l’embryogenèse, avant d’avoir atteint l’âge adulte,17. La nymphe de la drosophile a été conçue comme un modèle additionnel pour vivre-imagerie non invasive d’une variété d’événements cellulaires dynamiques, y compris developmental cell migration18,19de la division cellulaire, cellule croissance20et muscle 21de contraction. Plus récemment, il a été établi comme un nouveau modèle permettant d’étudier la dynamique de la plaie réparation et inflammation dans vivo22,de23.
Tout comme dans les stades embryonnaires, Drosophila pupes sont immobiles et optiquement transparent, après dissection minutieuse de leurs cas pupal opaque18. En exploitant cette transparence optique, on peut suivre le comportement in vivo de cellules immunitaires innées (hémocytes) en réponse à des lésions tissulaires au sein des tissus pupes de drosophile , tels que les ailes pupal22. L’aile pupal existe sous forme d’une structure simple et double, composé de deux grandes feuilles plates épithéliales qui sont connectés à la périphérie de l’aile ; l’espace extracellulaire entre ces deux couches épithéliales est rempli d’hémolymphe (sang insecte) et un grand nombre de mobiles hémocytes24. Tout comme dans des embryons, des blessures mécaniques ou induite par laser de l’épithélium de l’aile déclenche un recrutement rapid de hémocytes au site blessures23. Toutefois, ce stade pupal offre certains avantages distincts pour l’imagerie au plus tôt les stades embryonnaires. Nymphes blessés peuvent être photographiées au cours des périodes de temps beaucoup plus longs (pendant au moins 5 h), plus grande surface de tissus est disponible pour la perturbation expérimentale (par exemple, génération de blessures multiples) et un nombre significativement plus élevé de hémocytes présents à cette scène ( fournissant des trajectoires plus de cellules de plus longues distances pour l’accroissement de la puissance statistique lors de l’analyse mathématique). En outre, l’efficacité de l’inactivation de gènes véhiculée par ARNi est considérablement améliorée en étapes pupes, ce qui permet de nombreux gènes à être « démontés » dans un mouchoir ou la manière de précis par rapport à l’approche plus traditionnelle tout mutant d’embryons.
Pour suivre la dynamique de réépithélialisation de la plaie et la réponse inflammatoire qui l’accompagne au sein de ce nouveau modèle de pupe, deux populations de cellules différentes doivent être étiquetées : l’épithélium nymphal et les cellules immunitaires innées (Drosophila hémocytes). Il existe un certain nombre de différents marqueurs (Table des matières) qualifier ces deux populations cellulaires différentes - le choix du marqueur dépend le processus particulier à étudier. Pour marquer l’épithélium nymphal, Drosophila lignes contenant soit un gène exprimé GFP-étiquetée E-cadhérine (que les labels jonctions adherens) sont couramment utilisés pour indiquer les positions des marges de cellule, ou sinon, un élément GFP-étiqueté Domaine de liaison de l’actine de la moésine (que les labels le cytosquelette d’actine) pour visualiser les saillies de bague et pointe de plaie-bord actine contractile. Pour étiqueter les hémocytes de drosophile , un hémocytes spécifiques srp-Gal425 à expression lecteur DP nucléaire (pour suivi nucléaire), GFP cytoplasmique ou GFP-étiquetée moésine (d’étiqueter le cytoplasme ou actine cytosquelette, respectivement) ou un et un fluorophore (tels que Kaede) sont utilisés. En fait, il est souvent avantageux d’utiliser plusieurs marqueurs de cellules immunitaires en combinaison, pour permettre une analyse simultanée du mouvement nucléaire et de la morphologie cellulaire (voir résultats représentatifs). Toutefois, étant donné que ce protocole implique l’utilisation de pupes de drosophile , seules combinaisons de marqueurs génétiques qui sont viables jusqu'à mi-pupal étapes peuvent être utilisés. Aussi, les stocks de létalité embryonnaires ne sera pas adaptés. Il s’agit probablement pas d’un problème lorsque le contrôle de l’imagerie (ou sauvage) nymphes mais est importants à considérer lorsque les gènes doivent être renversé ou surexprimée, afin d’évaluer leur effet sur la fermeture de la plaie ou l’inflammation. Dans le cas de létalité précoce causée par précipitation de gène (ou surexpression), un Gal80ts construct peut être utilisé pour induire le knockdown axée sur la famille Gal4 plus tard dans le développement (voir Discussion).
Dans nos études récentes, pénétrant de la chrysalide nous a permis de recueillir des données de trajectoire de cellules immunitaires suffisantes pour analyser le comportement inflammatoire à l’aide de la modélisation mathématique sophistiquée, qui à son tour nous a permis d’en déduire de nouveaux détails de la plaie 23les signaux inflammatoire attractant. Par exemple, cette approche ont montré que le facteur chimiotactique plaie se répand lentement dans les tissus enflammés à 200 μm2/min, un rythme beaucoup plus lent que précédemment suggéré des molécules de petit candidat comme l’ATP ou H2O2 sont signalés à diffuse le26,27,28,29; ces molécules de petits « dommages » sont plutôt susceptibles d’agir en tant que signaux permissifs. En outre, en suivant le comportement à long terme des cellules immunitaires innées qu’ils règlent les éloigner une blessure initiale et sont exposés à une seconde (faite à différents intervalles après la première), nous avons découvert une période temporaire « désensibilisation » au cours de laquelle les cellules immunitaires sont aveugles aux blessures subséquentes23. En exploitant le potentiel d’imagerie à long terme du modèle pupal, ainsi que de la traçabilité génétique de la drosophile , on peut suivre le comportement des populations de cellules immunitaires spécifiques (par exemple uniquement les cellules immunitaires recrutés à la plaie) dans réponse aux insultes suivantes, en utilisant le de fluorophore et30 qui peut s’exprimer exclusivement dans la lignée de cellules immunitaires23.
Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser la dynamique de la cicatrisation et la réponse inflammatoire associée à haute résolution spatio-temporelle à l’aide de vie pupes de drosophile . Nous proposons une méthodologie détaillée pour couvrir les étapes requises pour la préparation initiale de nymphes (dissection et montage) et le blessant subséquente induite par laser et l’imagerie Time-lapse. Nous décrivons également l’utilisation de fluorophores photo convertibles pour permettre l’étiquetage des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires en vivo. Sur le long terme, nous prévoyons que ce nouveau modèle de pupes de Drosophila ouvrira des possibilités passionnantes pour disséquer la dynamique complexe de signalisation qui sous-tendent la réponse inflammatoire aux dommages de tissu. De procéder à des analyses statistiques plus sophistiqués on pourrait découvrir caractéristiques de la réponse qui autrement resteraient expérimentalement inaccessible, tandis que l’efficacité améliorée d’Arni pourrait se prêter à l’application du dépistage du génome au sein les cellules immunitaires en vivo pour identifier les nouveaux joueurs de réglementer le comportement des cellules immunitaires.

<table><tbody><tr><td>Drosophila stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ubiquitous GFP taggé E-cadherin ; Ubi-p63F-shg.GFP ; (chrII)</td><td>Kyoto Stock Center, DGRC</td><td>#109007</td> Les <td>séquences promotrices d’Ubi-p63E stimulent l’expression de Drosophila E-cadhérine (shotgun) marquées à l’extrémité C-terminale avec GFP.</td></tr><tr><td>ubiquitous GFP étiqueté E-cadherin ;; Ubi-p63E-shg.GFP (III)Bloomington</td> <td>Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#58742</td><td>Les séquences promotrices d’Ubi-p63E pilotent l’expression de Drosophila E-cadhérine (shotgun) marquée à l’extrémité C-terminale avec GFP.</td></tr><tr><td>ubiquitous GFP marqués Moesin P{sGMCA}3.1Bloomington</td> <td>Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#59023</td><td>Le promoteur/amplificateur sqh exprimé de manière ubiquitaire entraîne l’expression d’un fragment de Moesin (qui comprend les séquences de liaison à l’actine) marqué avec GFPS65T.</td></tr><tr><td>hemocyte serpent-Gal4 driver ; srp-Gal4 ; </td><td>Généré par Katja Bruckner</td><td>Généré par Katja Bruckner</td><td>L’expression de Scer\GAL4 fusionnée à une queue polyA est sous le contrôle de 2 séquences génomiques en amont du serpent Drosophila. Réf : Br&uuml ; ckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., R&oslash ; rth, P., Perrimon, N. Le récepteur PDGF/VEGF contrôle la survie des cellules sanguines chez la drosophile. Cellule de développement. 7 (1), 73 et 73 ; 84, doi : 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).</td></tr><tr><td>UAS-nuclearRFP w1118 ;; P{UAS-RedStinger}6Bloomington</td> <td>Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#8545 ou #8547</td> Les <td>séquences régulatrices UAS pilotent l’expression de la forme DsRed.T4 de RFP qui est marquée à l’extrémité C-terminale avec un signal de localisation nucléaire</td></tr><tr><td>UAS-cytoplasmicGFP ;; P{UAS-GFP. S65T}Bloomington</td> <td>Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>Plusieurs stocks disponibles (par exemple #1522)</td><td>Expression de la version S65T de la GFP par les séquences régulatrices UAS ; la variante S65T présente une luminosité accrue.</td></tr><tr><td>UAS-photoconvertibleKaede w1118 ;; P{UAS-Kaede.A}3</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#26161</td><td>La protéine Kaede émet une fluorescence vert vif après la synthèse, mais se transforme efficacement en une fluorescence rouge vif stable lors de l’irradiation UV.</td></tr><tr><td>GFP-tagged spaghetti squash w1118 ;; P{sqh-GFP.RLC}</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#57145</td><td>La région de codage sqh, qui est balisée à l’extrémité C-terminale avec une balise T :Avic\GFPS65T, est exprimée sous le contrôle du promoteur naturel sqh.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ingrédients pour les supports alimentaires contre les mouches</td><td></td><td></td>Les <td>supports alimentaires pour mouches sont fabriqués selon des procédures standard (voir Greenspan, R. 1997. Poussée de mouches : la théorie et la pratique de la génétique de la drosophile. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pages.)</td></tr><tr><td>maïs</td><td>Wild Oats, Bristol, Royaume-Uni (ou fournisseur équivalent)</td><td>Contacter le fournisseur directement</td><td></td></tr> biologique <tr><td>Farine de soja</td><td>Wild Oats, Bristol, Royaume-Uni (ou fournisseur équivalent)</td><td>Contacter le fournisseur direct</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de malt</td> biologique <td>Wild Oats, Bristol, Royaume-Uni (ou fournisseur équivalent)</td>Contacter le <td>fournisseur direct</td><td></td></tr><tr><td>mélasse</td><td>biologique Wild Oats, Bristol, Royaume-Uni (ou fournisseur équivalent)</td><td>Contacter fournisseur direct</td><td>de</td></tr><tr><td>gélose Difco</td> biologique <td>BD Biosciences, Fisher Scientific</td><td>DF0142-15-2</td><td>Pour la préparation de nourriture pour mouches</td></tr><tr><td>Acide propionique</td><td>Sigma</td><td>402907</td><td>Pour la préparation de nourriture pour mouches</td></tr><tr><td>Nipagen</td><td>Sigma</td><td>79721</td><td>Pour la préparation de nourriture pour</td></tr><tr><td>mouches Levure de boulanger séchée</td><td>Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD</td><td>Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD</td><td>Pour la préparation de la nourriture contre les mouches</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Préparation et montage d’échantillons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>Pour la préparation de la colle heptane</td></tr><tr><td>Sable fin pinceau</td><td>Daler-Rowney (ou équivalent)</td><td>#0 ou 1</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific (ou Fine Science Tools)</td><td>NC9404145</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Boîtes à fond de verre pour l’imagerie</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Nous suggérons d’utiliser des boîtes de Pétri de 35 mm, avec au moins un Microwell de 10 mm, un verre de couverture de 0,085-0,13 mm, non revêtu. Des boîtes avec des micropuits plus grands permettront de monter et d’imager un nombre croissant de pupes en une seule expérience.</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma</td><td>51730-5ML</td><td>Pour la préparation de la colle heptane</td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face (par exemple Scotch)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG263</td><td>Pour la préparation de la colle heptane Tube de</td></tr><tr><td>50ml (pour la colle heptane)</td><td>Tubes Falcon de Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Pour la préparation de la colle heptane</td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre</td><td>Agar Scientific</td><td>AGL4244</td><td>Pour la dissection de Drosophila pupes</td></tr><tr><td>Dissection au microscope stéréoscopique à fond clair</td><td>Leica (ou équivalent)</td><td>M50</td><td>Pour la dissection de Drosophila pupes</td></tr><tr><td>Microciseaux</td> John <td>Weiss International</td><td>103123</td><td>Miniature Research Scissors (droit)</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td> Numéro de catalogue </td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Ablation laser et imagerie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitogen Ablation</td><td>laser Spectra-Physics (ou équivalent Andor)</td><td>Modèle VSL-337ND-S</td><td>Pour les blessures, celui-ci doit être fixé à un système d’imagerie à grand champ</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser multilaser (CLSM)</td><td>Leica (ou équivalent)</td><td>TCS AOBS SP8 ou SP5-II fixé à un microscope à épifluorescence inversée Leica DMi8 (ou équivalent)</td><td>Idéalement doté d’une platine motorisée pour le balayage multi-sites et le balayage « mosaïque », plus ' Hybride' Détecteurs GaAsP (qui offrent une sensibilité beaucoup plus grande et une amplification du signal faible)</td></tr><tr><td>Services d’imagerie de la durée de vie</td> de <td>la chambre environnementale</td> (ou équivalent)<td>"Système de contrôle de la température du microscope"Fixé</td> <td>au microscope confocal pour le contrôle de la température pendant l’imagerie</td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td> Commentaires</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FRAP Module logiciel</td><td>Leica (ou équivalent)</td><td>Module logiciel CLSM FRAP</td><td>Pour effectuer la photoconversion de fluorophores photoconvertibles tels que Kaede</td></tr><tr><td>ImageJ (logiciel d’analyse d’images)</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td>Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. « NIH Image to ImageJ : 25 ans d’analyse d’images ». Nature Methods 9, 671-675, 2012.</td></tr><tr><td>Plugin ImageJ « Manual Tracking"National</td> <td>Institutes of Health (NIH)</td><td>https://imagej.net/Manual_Tracking</td><td></td></tr><tr><td>plugin ImageJ « TrackMate"</td><td>ImageJ, NIH</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td>Tinevez, JY. ; Perry, N. et Schindelin, J. et al. (2016), « TrackMate : Une plate-forme ouverte et extensible pour le suivi d’une seule particule. », Méthodes 115 : 80-90, PMID 27713081</td></tr><tr><td>Volocity (logiciel d’imagerie 3D haute performance)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Pour l’analyse</td></tr><tr><td>d’images IMARIS (logiciel d’analyse d’images)</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS pour les biologistes cellulaires</td><td>Pour l’analyse d’images</td></tr></tbody></table>

À long terme in vivo suivi de la dynamique de cellules inflammatoires dans les pupes de la drosophile

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Au cours de la réaction inflammatoire rapide aux dommages de tissu, les cellules du système immunitaire inné sont rapidement recrutés pour le site de la lésion. Une fois la plaie, les cellules immunitaires innées exécuter un certain nombre de fonctions essentielles, telles que la lutte contre l’infection, en désactivant les débris nécrotiques et stimulant la déposition de la matrice. Pour bien comprendre les divers événements de signalisation qui régulent cette réponse immunitaire, il est crucial d’observer les comportements complexes de (et les interactions qui se produisent entre) plusieurs cellules lignées in vivo et en temps réel, avec la haute résolution spatio-temporelle. La transparence optique et la traçabilité génétique des embryons de drosophile ont établi la drosophile comme modèle inestimable à l’image en direct et dissèquent les aspects fondamentaux du comportement de cellules inflammatoires, y compris les mécanismes de dispersion du développement, garde de corps apoptotiques et/ou pathogènes microbiens et de recrutement sur les plaies. Cependant, des travaux plus récents a maintenant démontré qu’employant beaucoup ultérieurement dans le cycle de vie de Drosophila – la nymphe de la drosophile – offre un certain nombre d’avantages, y compris la meilleure efficacité de l’ARNi, plus longue périodes, l’imagerie et beaucoup plus grand nombre de cellules immunitaires. Nous décrivons ici un protocole pour la cicatrisation d’imagerie et la réponse inflammatoire associée à la haute résolution spatio-temporelle dans live pupes de drosophile . Pour suivre la dynamique de la réépithélialisation et l’inflammation, nous utilisons un certain nombre de particuliers in vivo des marqueurs fluorescents pour l’épithélium et cellules immunitaires innées. Nous démontrons également l’efficacité des fluorophores photo convertibles, telles que Kaede, pour avoir suivi les sous-ensembles de cellules immunitaires spécifiques, afin de suivre leur comportement, alors qu’ils migrent et volonté de, le site de la lésion.

Ce protocole décrit la préparation des pupes de drosophile pour l’imagerie live Time-lapse de plaie réparation et inflammation in vivo. En utilisant cette méthode, il devrait être possible de générer plusieurs films à haute résolution de refermer les plaies pupes et recrutement des cellules inflammatoires en toute simplicité et à l’image de la pupe pour longues périodes (au moins 5 h) après blessant sans important photobleaching.
Un régime général pour la préparation de chrysalide de drosophile 
La figure 1 illustre la méthode optimale pour la préparation des pupes de drosophile pour l’imagerie in vivo . Drosophila blancs « prénymphes » sont collectées à le '0 h » après formation puparium (APF), car les larves rampants cessent la motilité et adoptent la forme de pupe stéréotypée avec éversion appendices respiratoires (stigmates) visibles à leur extrémité la plus antérieure ( Figure 1 a). Le blanc 0 h prénymphes APF sont autorisés à développer pendant 18 heures à 25 ° C, époque à laquelle le puparium est devenu brun (Figure 1 b) et sont ensuite disséqués à l’aide de pinces fines et/ou microciseaux (Figure 1, pour retirer l’étui de pupe) pour révéler la chrysalide optiquement translucide intérieur (Figure 1). Après dissection, les ailes pupes sera visibles sur les faces latérales du thorax pupe (souligné en bleu, Figure 1-D). À ce stade, les autres parties du corps de nymphes sont également facilement discernables, y compris les yeux, des jambes et abdomen (marqué dans la Figure 1). Les pattes sont également appropriés pour les études de l’inflammation de plaie et peuvent être blessés en utilisant la même méthode laser décrite ci-dessus. Plusieurs 18 h nymphes CSA peuvent être montés simultanément dans le plat d’imagerie (Figure 1E, à l’aide de colle de l’heptane et un papier filtre imbibé d’eau pour minimiser la déshydratation) avec une partie plus plate d’aile (indiqué en bleu) au contact de la lamelle couvre-objet ( Figure 1F) ; Ceci est particulièrement avantageux si le microscope d’imagerie est équipé d’une platine motorisée pour permettre plusieurs chrysalides à être enregistrées pendant une seule période d’imagerie. Les nymphes qui ont été endommagés au cours de la dissection ou montage doivent être jetés (p. ex. la nymphe situé troisième dans l’ordre, la flèche sur la Figure 1E). Autres parties du corps (par exemple les yeux et jambes, rose décrite) peuvent aussi communiquer avec le couvre-objet et sont disponibles pour blesser et ultérieures d’imagerie (Figure 1F). Pour expériences étudient les plaies simples, dommages induite par laser sont généralement mieux infligées au centre dans l’aile (astérisque, Figure 1F), bien que les autres emplacements peuvent être utilisés si les blessures multiples sont à étudier.
Blessant stérile active une réponse inflammatoire robuste dans l’aile de pupes de drosophile 
Pour suivre la cicatrisation et l’accompagnement réponse inflammatoire in vivo, les ailes blessés des pupes APF Drosophila 18 h ont été projetés à l’aide de la microscopie confocale Time-lapse (Figure 2 a-H). À ce stade nymphal, l’épithélium de l’aile est de simples plaques planes de cellules (appelés ici à l’aide de E-cadhérine GFP-étiquetée pour marquer les limites d’une cellule individuelle, à marge aile décrites dans la Figure 2 a). Même dans les ailes non blessés (faible grossissement, les Figures 2 a et 2 a '), un grand nombre de migrateurs cellules immunitaires innées (hemocytes, étiquetés à l’aide de srp-Gal4 piloté par GFP cytoplasmique, vert et nucléaire DP, magenta) se trouvent dans l’hémolymphe ( sang insecte) occupant l’espace extracellulaire (Figure 2 a et 2 a '). Induite par laser des lésions de l’épithélium nymphal aile (plaie de marge en blanc, Figure 2 b-D) stimule une migration rapide d’hémocytes sur le site de la plaie (Figure 2 b-D et noyaux de cellules immunitaires dans la Figure 2 b '-D'). Étiquetage les hémocytes à la fois un marqueur nucléaire (p. ex. la DP nucléaire « rouge-stinger ») en combinaison avec un marqueur cytoplasmique ou du cytosquelette (p. ex. GFP cytoplasmique ou GFP-étiquetée moésine) est particulièrement avantageux car elle permet la suivi simultané de noyaux hémocytes (pour une analyse automatisée des hémocytes comportement par exemple migration la vitesse et la directionalité) et la visualisation de la morphologie hémocytes. Ce dernier est important car il permet de déterminer si les hémocytes sont phagocytants débris nécrotiques (Figure 2, encart) au bord de la plaie (ou microbes dans le cas d’infection)12,23 et nous permet également de suivre leur comportement protrusive car ils s’étendent des filopodes fine ou lamellipodia à leur bord d’attaque alors qu’ils migrent rapprochent ou s’éloignent de la plaie.
Simple de suivi des trajectoires nucléaire hémocytes à l’aide de logiciel32 de l’analyse d’Image approprié (Table des matières) illustre la dynamique spatio-temporelle complexe de la réponse inflammatoire, semblable à celle décrite précédemment pour blessé embryons9,36 (titres multicolores, Figure 2' et D'). Dans seulement 30 mn de blessant, hemocytes proches du site de la lésion commencent une migration dirigée vers la plaie (Figure 2'). Cependant, avec l’augmentation des blessures après, hemocytes trouve progressivement plus loin du site de la lésion également commencent migration dirigée vers la plaie (Figure 2D'). De cette façon, une « vague » de la réactivité des cellules immunitaires qui se propage vers l’extérieur du bord de la plaie est observée, que nous envisageons pour tenir compte de la diffusion de la chemoattractant plaie loin du site de la lésion. Ces dynamiques spatio-temporelles de cellules immunitaires a fourni un point de départ utile pour notre étude récente qui employait sophistiqué analyse mathématique de modélisation (« Inférence bayésienne ») pour déduire des propriétés nouvelles du signal attractant plaie (méthodes détaillées publié dans23). En calibrer nos modèles de calcul (associant le gradient d’attractant plaie la partialité hémocytes) pour s’adapter à des trajectoires immunitaire observée in vivo , on pourrait extraire des caractéristiques détaillées de l’attractant plaie notre trajectoire hémocytes données (telles que la vitesse de diffusion du signal, la source et la durée de production du signal)23.
En outre, par la conduite d’expression du fluorophore et Kaede dans la lignée de cellules immunitaires à l’aide de srp-Gal4 (vert, Figure 2E) nous avons pu également sélectivement étiqueter une sous-population de ces hémocytes aile migrateurs (tels que ceux recrutement à la plaie ; E, avant la photoconversion par les rayons UV et F, post-photoconversion). Nous pouvons ensuite suivre le comportement de ces hémocytes au fil du temps (magenta, Figure 2-H) car ils règlent du site de la plaie (flèches, Figure 2 et H) et comparer comment leur comportement est différent de ceux non-photoconverted cellules qui ne sont pas atteindre le site de la lésion. Nous avons utilisé cette in vivo étiquetage technique afin de démontrer que hémocytes recrutés pour une première blessure sont temporairement désensibilisés à une deuxième blessure générée 90 minutes plus tard23, bien que cette technique de marquage différentielle pourrait également ont de nombreuses autres applications perspicaces dans le futur (voir Discussion).
En utilisant cette approche, nous pouvons aussi en même temps suivre la dynamique spatio-temporelle de la cicatrisation ou êtes-epithelialisation' (Figure 2 b-D). Ici partout exprimée GFP-étiquetée E-cadhérine étiquettes les jonctions cellulaires adherens tout au long de l’épithélium de l’aile et permet les formes de cellules épithéliales à suivre au fil du temps. Le bord de la plaie est facilement identifié comme la jonction entre les cellules épithéliales GFP-étiquetée intactes et débris sans étiquette (ligne en pointillés blanc, Figure 2 b-D). Pour la majorité des blessures, la plaie commence à re-epithelialize à 1 h de blessures et les plaies bord avances vers l’intérieur (Figure 2D) ; plaies de cette taille guériront généralement dans les 2-3 h23de la blessure. Fermeture de la plaie dans les embryons et les nymphes est entraînée par un câble contractile de l’actomyosine avec pointe riche en actine filopodes23,37; ces dynamiques du cytosquelette peuvent être visualisées directement au cours de la cicatrisation en utilisant approprié en vivo reporters, comme la courge Spaghetti GFP-étiquetée (chaîne légère régulatrice de la myosine) ou GFP-étiquetée liant l’actine moésine23. Pour certaines plaies particulièrement grandes, cependant, le câble de l’actomyosine et pointe filopodes ne persistent pas - ces blessures deviennent « chroniques » et jamais complètement re-epithelialize23 même après des périodes beaucoup plus longues (plus de 24 h) de in vivo d’imagerie. Fait intéressant, la réponse inflammatoire associée à ces blessures non-guérison est nettement différente de celle associée à des plaies aiguës normal23 ce qui suggère que le comportement anormal de cellules immunitaires pourrait être un marqueur pronostique utile dans la clinique . À l’avenir, davantage en vivo analyse des plaies chroniques en utilisant l’imagerie à long terme (plus de 24 h) dans le modèle de pupe pourrait fournir important mécaniste aperçu de cette maladie débilitante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig1.jpg"> Figure 1 : Drosophila chrysalide préparation blessant et d’images en direct. (A) de Drosophila prénymphes blancs recueillis à 0 h CSA, avec extrémité antérieure indiquée par éversion respiration appendices (stigmates). (B) après avoir soulevé les prénymphes APF blanc 0 h de 18 h à 25 ° C, le puparium apparaît brun. Dissection de la pupe devrait commencer à la région plus antérieure (flèche), indiquée par les stigmates éversés la nymphe correcte étant absente de cette région et des pinces fines et/ou microciseaux utilisé pour enlever l’étui chrysalide (C). Les ailes pupes sera visibles sur les faces latérales du thorax pupe (contours bleus). Pupe (D) complètement retiré du 18 h chrysalide APF, ici la chrysalide a été roulée 90 ° pour montrer le côté latéral, avec l’aile pour être photographié souligné en bleu. (E-F) Cinq nymphes d’APF 18h monté sur une lamelle de verre dans le plat avec du papier filtre imbibé d’eau pour minimiser la déshydratation (E) à l’aide de colle de l’heptane, l’imagerie. Chrysalide tiers situé dans la séquence (flèche) devrait être jeté comme le dommage est survenu au cours de la préparation. Nymphes sont montés avec la partie plate de l’aile (indiqué en bleu) au contact de la lamelle couvre-objet (F) et plaies induite par laser sont générés au centre dans l’aile (astérisque, F), bien que les autres emplacements peuvent être utilisés si les blessures multiples sont pour être étudié. L’image en (D) adapté avec la permission de tisserands et coll., 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig2.jpg"> Figure 2 : Dynamique en vivo analyse de la réponse inflammatoire aux dommages de tissu. Chrysalides disséqué de protection cas de pupes et monté sur une lamelle de verre (A) sont blessés et imagé par la suite en utilisant la microscopie confocale Time-lapse (B-H). Vue de grossissement de l’aile de pupe non blessé à faible (A, marge d’aile en blanc) qui contient un grand nombre de migrateurs hémocytes (A'). Les lésions induites par le laser à l’épithélium nymphal aile (B-D, limites d’une cellule marquées à l’aide de GFP-étiquetée Drosophila E-cadhérine ; plaie marge contour blanc) active une réaction inflammatoire rapide avec la migration de plusieurs hemocytes ( SRP-Gal4 piloté par expression de DP nucléaire, GFP magenta et cytoplasmique, vert) vers le site de la plaie (B-D; images représentatives d’un Time-lapse film dans lequel chaque image est une projection de 25 tranches 3 μm de chaque). Suivi manuel des trajectoires hémocytes (titres multicolores, C' et D') indiquent la dynamique spatio-temporelle complexe de la réponse inflammatoire, similaire à celle rapportée pour les embryons blessés. Hémocytes également phagocytent les débris cellulaires nécrotiques à la plaie (pointe de flèche, C et également encadré). Expression du fluorophore et Kaede dans la lignée de cellules immunitaires (vert, E, à l’aide de srp-Gal4) permet la plaie recrutés hémocytes (flèche, E) être différemment étiquetées (magenta, F) et suivi au fil du temps qu’ils résolvent depuis le site de la lésion (flèches, G et H). Les génotypes de pupes suivants ont été utilisés : (A-D) w1118; ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4 &gt; UAS-GFP(II) ; UAS-nRFP(III) (E-H), w1118; srp-Gal4(II) ; UAS-Kaede(III). Images adaptés avec la permission de tisserands et coll., 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole pour la création d’images en direct de la cicatrisation et la réponse inflammatoire associée à haute résolution spatio-temporelle in vivo. Cette méthode utilise la chrysalide du développement de la drosophile pour permettre à long terme d’imagerie et suivi des populations de cellules spécifiques au fil du temps et est compatible avec l’inactivation de gènes RNAi efficace.

À long terme In Vivo suivi de la dynamique de cellules inflammatoires dans les pupes de la drosophile

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

En exploitant le potentiel d’imagerie à long terme de ce nouveau modèle de nymphe ainsi que la traçabilité génétique de la drosophile, cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la cicatrisation des plaies et de l’immunité innée. Le stade nymphal offre des avantages distincts pour l’imagerie en direct par rapport aux modèles plus traditionnels de cicatrisation des plaies de la drosophile. Par exemple, les pupes peuvent être imagées sur des périodes beaucoup plus longues, une plus grande surface tissulaire est disponible pour la manipulation expérimentale et plus d’hémocytes sont présents à ce stade.De plus, l’efficacité de l’inactivation des gènes médiée par l’ARNi est considérablement améliorée au cours de ces stades nymphaux, ce qui permet à de nombreux gènes d’être éliminés d’une manière spécifique au tissu ou au temps. Pour mettre en place la collection de nymphes, installez des flacons avec 20 femelles vierges et 20 mâles. Ensuite, 18 heures avant la séance d’imagerie, prélevez au moins 10 pré-pupes blanches nouvellement formées dans les flacons.Pour prélever une nymphe, utilisez des pinces ou un pinceau fin pour la déloger de la surface intérieure du flacon et transférez-la soigneusement sur le côté d’un nouveau flacon de mouches. Une fois que les pupes se sont développées au point de temps souhaité, transférez-les sur un morceau de ruban adhésif double face monté sur une lame de verre. Maintenant, sous un microscope de dissection à fond clair, retirez soigneusement les pupes de leurs enveloppes.Positionnez les pupes de manière à ce que leurs côtés ventraux soient fermement collés au ruban. Faites la première incision dans la région la plus antérieure du puparium à l’aide de la pince. Assurez-vous que l’étui nymphal dans cette zone est creux et dépourvu de tissu nymphal, car les pupes auront rétréci à l’intérieur de l’étui au cours du développement précoce de la nymphe.Ensuite, déchirez ou coupez soigneusement l’enveloppe de la nymphe dans une direction d’avant en arrière à l’aide de pinces ou de microciseaux jusqu’à ce que la chrysalide soit complètement libérée de l’enveloppe cassante opaque et brune. Attention ces pupes sont très fragiles. Maintenant, il est crucial que les pinces et les microciseaux ne perforent pas la surface de la nymphe pendant cette étape.Essayez d’éviter de toucher la chrysalide elle-même lorsque vous retirez l’étui environnant. Montez maintenant les pupes non endommagées dans un plat à fond de verre à l’aide de colle heptane. Déposez d’abord une ligne de colle heptane préparée à partir d’une aliquote de 10 microlitres.Ensuite, après cinq secondes de séchage, utilisez une pince pour transférer soigneusement les pupes disséquées sur la colle. Lors de l’apprentissage, alignez jusqu’à cinq nymphes. Il est possible d’en préparer davantage avec l’expérience acquise.Roulez les pupes à l’aide d’une pince pour monter les pupes de manière à ce que l’aile soit à plat sur le verre de protection et que la majorité de la surface de l’aile soit en contact direct avec le verre de protection. Enfin, pour éviter la déshydratation, ajoutez un morceau de papier filtre absorbant trempé dans de l’eau distillée sur le côté du plat à fond de verre. Couvrez ensuite le plat et procédez à la procédure de blessure induite par laser.Transférez les pupes montées dans un microscope à grand champ équipé d’un système d’ablation laser accordable. Réglez le laser d’ablation à l’azote refroidi par air et refroidi par air pulsé à la longueur d’onde souhaitée à l’aide de la pile à colorant appropriée. Pour une blessure optimale, réglez la fréquence de répétition du pouls sur 40 hertz.Maintenant, à l’aide d’objectifs 40 fois ou 63 fois et d’un champ clair, ajustez les commandes de la platine du microscope pour localiser l’aile de la nymphe de la première nymphe blessée. Concentrez-vous sur le plan de l’épithélium de l’aile nymal le plus proche de la lamelle de verre. Alignez la zone à blesser avec la zone cible connue du laser d’ablation.Pour ce faire, profitez du marqueur de réticule à l’intérieur de l’oculaire du microscope. Ensuite, ajustez la puissance du laser en ajustant la lame de l’atténuateur de densité d’énergie dans le microscope. Profitez des butées de clic pour rendre le réglage reproductible.Maintenant, pour faire une plaie, activez le laser d’ablation d’un clic rapide de commande manuelle. Vérifiez ensuite l’apparition de la bulle d’air transitoire au site d’ablation, ce qui est normal avec les blessures. Si la blessure n’est pas réussie, essayez de varier le plan focal.Vous pouvez également augmenter progressivement la puissance du laser à l’aide de la glissière de l’atténuateur jusqu’à ce que la taille de plaie souhaitée atteigne. Après avoir blessé les bords de l’aile de la nymphe, transférez rapidement la boîte à fond de verre dans un microscope approprié pour l’imagerie en accéléré. Ouvrez ensuite le logiciel de capture d’images approprié.Dans le logiciel, allumez les lasers appropriés et ajustez leur puissance et leur gain/décalage pour obtenir suffisamment de signal fluorescent sans saturation des pixels. En général, la puissance laser la plus faible possible, dans la plage de 5 à 20 %, fonctionne le mieux pour minimiser le photoblanchiment. Concentrez-vous sur l’ensemble de l’aile nymphale sous un faible grossissement ou concentrez-vous sur la plaie sous un fort grossissement pour étudier la réparation de la plaie.Pour capturer à la fois l’épithélium réparateur et le recrutement des cellules inflammatoires, réglez d’abord le microscope pour qu’il enregistre une pile z à l’aide du réglage précis de la mise au point sur le panneau de commande. Scintigraphie de l’épithélium blessé jusqu’à l’espace extracellulaire situé en dessous contenant les hémocytes migrateurs. Ensuite, réglez le logiciel pour qu’il enregistre des coupes en Z à travers l’aile de la nymphe tous les trois microns ou à des intervalles encore plus serrés.Pour l’imagerie en accéléré, enregistrez les piles z au moins toutes les 30 secondes pendant au moins une heure. Lorsque vous utilisez les sondes photoconvertibles pour photoconvertir et étiqueter de manière sélective un sous-ensemble de cellules pendant l’imagerie, ouvrez les modules appropriés dans le logiciel d’imagerie pour effectuer la conversion de photos et activer le laser de 405 nanomètres. Sélectionnez ensuite les cellules à photo-convertir dans le logiciel FRAP à l’aide d’un outil de sélection.Ensuite, réglez le temps de conversion des photos sur une seule itération d’image et réglez le laser de 405 nanomètres sur une puissance laser de 20 %. Cliquez ensuite sur Démarrer l’expérience pour effectuer la conversion de photos. Une fois l’opération terminée, quittez le module FRAP et revenez à l’écran d’imagerie d’origine.Là, réglez les lasers sur les fluorophores utilisés et imagez les cellules photoconverties et non photoconverties à l’aide d’enregistrements en accéléré. Les ailes blessées de pupes de drosophile 18 heures après la formation du puparium ont été imagées à l’aide de la microscopie confocale à intervalle de temps. Les lésions induites par le laser à l’épithélium de l’aile nymphale ont stimulé une migration rapide des cellules immunitaires innées de la drosophile appelées hémocytes vers le site de la plaie.Les hémocytes ont été marqués à la fois avec un marqueur nucléaire et un marqueur cytoplasmique ou cytosquelettique pour permettre un suivi et une vue de leur morphologie, respectivement. Le suivi des trajectoires nucléaires des hémocytes démontre la dynamique spatio-temporelle complexe de la réponse inflammatoire. Dans les 30 minutes suivant la blessure, les hémocytes situés les plus proches du site de la blessure ont commencé à migrer vers la plaie.Finalement, les hémocytes situés progressivement plus loin de la blessure commencent à migrer vers la plaie. En utilisant le fluorophore photoconvertible Kaede, des sous-populations de ces hémocytes d’ailes migratrices ont été marquées de manière sélective. Cette méthode a été utilisée pour montrer que les hémocytes recrutés sur une première plaie sont temporairement désensibilisés à une seconde plaie générée 90 minutes plus tard.En marquant l’E-cadhérine dans les jonctions cellulaires adhérentes avec GFP, le bord de la plaie est facilement identifiable, ce qui permet d’analyser la dynamique de cicatrisation des plaies. La plupart des plaies commencent à se réépithélialiser dans l’heure qui suit la blessure. Le bord de la plaie avance vers l’intérieur et les plaies finissent par cicatriser en trois heures.Une fois que cette technique a été maîtrisée, plusieurs pupes peuvent être préparées pour l’imagerie en direct en seulement 10 minutes, mais lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’une fois disséquées de leur nymphe, les pupes de drosophile sont extrêmement vulnérables aux dommages et à la déshydratation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunité innée pour collaborer avec des biologistes informaticiens et appliquer une modélisation mathématique plus sophistiquée pour explorer le comportement des signaux d’attraction de la plaie qui sont responsables du recrutement des cellules inflammatoires. Et encore plus récemment, des types de cellules alternatifs ont également été marqués pour suivre leur réponse aux lésions induites par le laser, ce qui a révélé que les cellules adipocytaires, les cellules graisseuses de la drosophile, répondent également aux blessures au sein de ce système.

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