À long terme In Vivo suivi de la dynamique de cellules inflammatoires dans les pupes de la drosophile

En exploitant le potentiel d’imagerie à long terme de ce nouveau modèle de nymphe ainsi que la traçabilité génétique de la drosophile, cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la cicatrisation des plaies et de l’immunité innée. Le stade nymphal offre des avantages distincts pour l’imagerie en direct par rapport aux modèles plus traditionnels de cicatrisation des plaies de la drosophile. Par exemple, les pupes peuvent être imagées sur des périodes beaucoup plus longues, une plus grande surface tissulaire est disponible pour la manipulation expérimentale et plus d’hémocytes sont présents à ce stade.

De plus, l’efficacité de l’inactivation des gènes médiée par l’ARNi est considérablement améliorée au cours de ces stades nymphaux, ce qui permet à de nombreux gènes d’être éliminés d’une manière spécifique au tissu ou au temps. Pour mettre en place la collection de nymphes, installez des flacons avec 20 femelles vierges et 20 mâles. Ensuite, 18 heures avant la séance d’imagerie, prélevez au moins 10 pré-pupes blanches nouvellement formées dans les flacons.

Pour prélever une nymphe, utilisez des pinces ou un pinceau fin pour la déloger de la surface intérieure du flacon et transférez-la soigneusement sur le côté d’un nouveau flacon de mouches. Une fois que les pupes se sont développées au point de temps souhaité, transférez-les sur un morceau de ruban adhésif double face monté sur une lame de verre. Maintenant, sous un microscope de dissection à fond clair, retirez soigneusement les pupes de leurs enveloppes.

Positionnez les pupes de manière à ce que leurs côtés ventraux soient fermement collés au ruban. Faites la première incision dans la région la plus antérieure du puparium à l’aide de la pince. Assurez-vous que l’étui nymphal dans cette zone est creux et dépourvu de tissu nymphal, car les pupes auront rétréci à l’intérieur de l’étui au cours du développement précoce de la nymphe.

Ensuite, déchirez ou coupez soigneusement l’enveloppe de la nymphe dans une direction d’avant en arrière à l’aide de pinces ou de microciseaux jusqu’à ce que la chrysalide soit complètement libérée de l’enveloppe cassante opaque et brune. Attention ces pupes sont très fragiles. Maintenant, il est crucial que les pinces et les microciseaux ne perforent pas la surface de la nymphe pendant cette étape.

Essayez d’éviter de toucher la chrysalide elle-même lorsque vous retirez l’étui environnant. Montez maintenant les pupes non endommagées dans un plat à fond de verre à l’aide de colle heptane. Déposez d’abord une ligne de colle heptane préparée à partir d’une aliquote de 10 microlitres.

Ensuite, après cinq secondes de séchage, utilisez une pince pour transférer soigneusement les pupes disséquées sur la colle. Lors de l’apprentissage, alignez jusqu’à cinq nymphes. Il est possible d’en préparer davantage avec l’expérience acquise.

Roulez les pupes à l’aide d’une pince pour monter les pupes de manière à ce que l’aile soit à plat sur le verre de protection et que la majorité de la surface de l’aile soit en contact direct avec le verre de protection. Enfin, pour éviter la déshydratation, ajoutez un morceau de papier filtre absorbant trempé dans de l’eau distillée sur le côté du plat à fond de verre. Couvrez ensuite le plat et procédez à la procédure de blessure induite par laser.

Transférez les pupes montées dans un microscope à grand champ équipé d’un système d’ablation laser accordable. Réglez le laser d’ablation à l’azote refroidi par air et refroidi par air pulsé à la longueur d’onde souhaitée à l’aide de la pile à colorant appropriée. Pour une blessure optimale, réglez la fréquence de répétition du pouls sur 40 hertz.

Maintenant, à l’aide d’objectifs 40 fois ou 63 fois et d’un champ clair, ajustez les commandes de la platine du microscope pour localiser l’aile de la nymphe de la première nymphe blessée. Concentrez-vous sur le plan de l’épithélium de l’aile nymal le plus proche de la lamelle de verre. Alignez la zone à blesser avec la zone cible connue du laser d’ablation.

Pour ce faire, profitez du marqueur de réticule à l’intérieur de l’oculaire du microscope. Ensuite, ajustez la puissance du laser en ajustant la lame de l’atténuateur de densité d’énergie dans le microscope. Profitez des butées de clic pour rendre le réglage reproductible.

Maintenant, pour faire une plaie, activez le laser d’ablation d’un clic rapide de commande manuelle. Vérifiez ensuite l’apparition de la bulle d’air transitoire au site d’ablation, ce qui est normal avec les blessures. Si la blessure n’est pas réussie, essayez de varier le plan focal.

Vous pouvez également augmenter progressivement la puissance du laser à l’aide de la glissière de l’atténuateur jusqu’à ce que la taille de plaie souhaitée atteigne. Après avoir blessé les bords de l’aile de la nymphe, transférez rapidement la boîte à fond de verre dans un microscope approprié pour l’imagerie en accéléré. Ouvrez ensuite le logiciel de capture d’images approprié.

Dans le logiciel, allumez les lasers appropriés et ajustez leur puissance et leur gain/décalage pour obtenir suffisamment de signal fluorescent sans saturation des pixels. En général, la puissance laser la plus faible possible, dans la plage de 5 à 20 %, fonctionne le mieux pour minimiser le photoblanchiment. Concentrez-vous sur l’ensemble de l’aile nymphale sous un faible grossissement ou concentrez-vous sur la plaie sous un fort grossissement pour étudier la réparation de la plaie.

Pour capturer à la fois l’épithélium réparateur et le recrutement des cellules inflammatoires, réglez d’abord le microscope pour qu’il enregistre une pile z à l’aide du réglage précis de la mise au point sur le panneau de commande. Scintigraphie de l’épithélium blessé jusqu’à l’espace extracellulaire situé en dessous contenant les hémocytes migrateurs. Ensuite, réglez le logiciel pour qu’il enregistre des coupes en Z à travers l’aile de la nymphe tous les trois microns ou à des intervalles encore plus serrés.

Pour l’imagerie en accéléré, enregistrez les piles z au moins toutes les 30 secondes pendant au moins une heure. Lorsque vous utilisez les sondes photoconvertibles pour photoconvertir et étiqueter de manière sélective un sous-ensemble de cellules pendant l’imagerie, ouvrez les modules appropriés dans le logiciel d’imagerie pour effectuer la conversion de photos et activer le laser de 405 nanomètres. Sélectionnez ensuite les cellules à photo-convertir dans le logiciel FRAP à l’aide d’un outil de sélection.

Ensuite, réglez le temps de conversion des photos sur une seule itération d’image et réglez le laser de 405 nanomètres sur une puissance laser de 20 %. Cliquez ensuite sur Démarrer l’expérience pour effectuer la conversion de photos. Une fois l’opération terminée, quittez le module FRAP et revenez à l’écran d’imagerie d’origine.

Là, réglez les lasers sur les fluorophores utilisés et imagez les cellules photoconverties et non photoconverties à l’aide d’enregistrements en accéléré. Les ailes blessées de pupes de drosophile 18 heures après la formation du puparium ont été imagées à l’aide de la microscopie confocale à intervalle de temps. Les lésions induites par le laser à l’épithélium de l’aile nymphale ont stimulé une migration rapide des cellules immunitaires innées de la drosophile appelées hémocytes vers le site de la plaie.

Les hémocytes ont été marqués à la fois avec un marqueur nucléaire et un marqueur cytoplasmique ou cytosquelettique pour permettre un suivi et une vue de leur morphologie, respectivement. Le suivi des trajectoires nucléaires des hémocytes démontre la dynamique spatio-temporelle complexe de la réponse inflammatoire. Dans les 30 minutes suivant la blessure, les hémocytes situés les plus proches du site de la blessure ont commencé à migrer vers la plaie.

Finalement, les hémocytes situés progressivement plus loin de la blessure commencent à migrer vers la plaie. En utilisant le fluorophore photoconvertible Kaede, des sous-populations de ces hémocytes d’ailes migratrices ont été marquées de manière sélective. Cette méthode a été utilisée pour montrer que les hémocytes recrutés sur une première plaie sont temporairement désensibilisés à une seconde plaie générée 90 minutes plus tard.

En marquant l’E-cadhérine dans les jonctions cellulaires adhérentes avec GFP, le bord de la plaie est facilement identifiable, ce qui permet d’analyser la dynamique de cicatrisation des plaies. La plupart des plaies commencent à se réépithélialiser dans l’heure qui suit la blessure. Le bord de la plaie avance vers l’intérieur et les plaies finissent par cicatriser en trois heures.

Une fois que cette technique a été maîtrisée, plusieurs pupes peuvent être préparées pour l’imagerie en direct en seulement 10 minutes, mais lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’une fois disséquées de leur nymphe, les pupes de drosophile sont extrêmement vulnérables aux dommages et à la déshydratation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunité innée pour collaborer avec des biologistes informaticiens et appliquer une modélisation mathématique plus sophistiquée pour explorer le comportement des signaux d’attraction de la plaie qui sont responsables du recrutement des cellules inflammatoires. Et encore plus récemment, des types de cellules alternatifs ont également été marqués pour suivre leur réponse aux lésions induites par le laser, ce qui a révélé que les cellules adipocytaires, les cellules graisseuses de la drosophile, répondent également aux blessures au sein de ce système.