Name: Culture et la Transfection des cellules primaires de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Apprenez à culturer et transfecter des cellules primaires de Danio rerio pour étudier la dynamique intercellulaire en imagerie cellulaire vivante. Cette méthode offre une résolution inégalée pour la biologie cellulaire.

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Nous remercions T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde et S.-M. Tokarski pour animaux excellent et un support technique. Nous sommes reconnaissants à tous les membres du laboratoire Köster de discussions intenses et utiles. Nous reconnaissons avec financement par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) et le Land de Basse-Saxe, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

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<li>Stornaiuolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDEL+and+KKXX+retrieval+signals+appended+to+the+same+reporter+protein+determine+different+trafficking+between+endoplasmic+reticulum%2C+intermediate+compartment%2C+and+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).</li>
<li>Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+proteins+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Targeting of proteins to mitochondria.</a> FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).</li>
<li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+zebrafish+primary+cell+culture+for+transfection+and+live+cellular+and+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging.</a> Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).</li>
<li>Horesh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublecortin%2C+a+stabilizer+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Doublecortin, a stabilizer of microtubules.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+neither+persistently+leads+migration+nor+determines+the+site+of+axonogenesis+in+migrating+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).</li>
<li>Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+dynamics+inside+cells+using+a+rationally+designed+photoconvertible+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein.</a> Nature Methods. 5, 339-345 (2008).</li>
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<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10, 407-409 (2013).</li>
<li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).</li>
<li>Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133, 916-927 (2008).</li>
<li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132, 5069-5079 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+expressed+transiently+in+all+types+of+amacrine+cells+in+the+embryonic+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina.</a> Neural Development. 4, 34(2009).</li>
<li>Kani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+gene-linked+neurogenesis+in+zebrafish+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum.</a> Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+cell+lines+from+zebrafish+embryos+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors.</a> Zebrafish. 10, 316-332 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici deux protocoles différents de cellules en culture primaire de 2 embryons de poisson-zèbre dpf ou cerveau de poisson-zèbre adulte.
La préparation des cultures de cellules primaires de 2 dpf poisson zèbre est relativement facile à réaliser pour quelqu'un ayant une expérience dans les techniques de culture cellulaire de base. Toutefois, pour obtenir des résultats reproductibles satisfaisants, un nombre suffisant d’embryons comme matériel de départ est crucial (100 est le minim...

Le poisson zèbre (Danio rerio, d. rerio) est un modèle populaire vertébré pour nombreux domaines de la recherche biomédicale et de base1. Des embryons de poisson-zèbre se développent rapidement ex utero, sont transparents et s’adaptent au microscope, offrant ainsi des conditions excellentes pour l’étude du développement des vertébrés dans un organisme vivant. En raison de la traçabilité génétique du poisson-zèbre2, nombreuses lignes de journaliste transgéniques stable avec l’expression spécifique de type cellule de différents marqueurs fluorescents ont été établies permettant l’observation des populations de cellules spécifiques. La communauté de poissons zèbres vous propose un large éventail de ce que l'on appelle lignes de Gal4-pilote muni d’un transgène exprimant les Kal4TA4 synthétiques (ou l’équivalent de KalTA3-GalFF) gène avec le domaine de Gal4-DNA-binding de levure fondue à l’activation de la transcription virale domaines relevant d’exhausteurs de spécifiques au type de cellule. Ces lignes de pilote sont croisent aux lignes effectrices qui transportent les transgènes consistant en une séquence activatrice en amont (UAS) déterminée fusionnée à un gène rapporteur. La protéine Kal4TA4 se lie à l’élément de SAMU, activant ainsi l’expression de type sélectif de cellule du journaliste gene3,4. Cette approche permet de très diverses études combinatoires de presque tous les éléments disponibles d’enhancer et reporter chez les animaux double-transgéniques.
Cependant, profondeur imagerie live mettant l’accent sur des cellules individuelles ou leur contenu subcellulaire est limité dans un embryon entier et en constante évolution. Pour répondre à des questions biologiques spécifiques de cellules avec la résolution la plus élevée, l’utilisation de cultures cellulaires est souvent préférable. Certaines lignées cellulaires de poisson-zèbre existent, mais elles sont considérées comme fortement sélectionné5,6,7 et leur propagation est souvent fastidieux. En outre, toutes les lignées de cellules disponibles sont des fibroblastes dérivés, limitant les expériences de culture cellulaire à un seul type de cellules. Par conséquent, nous avons établi un protocole à la fois efficace et facile à utiliser pour préparer les cellules primaires directement à partir des embryons de poisson-zèbre et le cerveau de poisson zèbre adulte, ainsi que des approches pour augmenter la longévité de la culture et d’élargir la diversité de la culture types de cellules. En outre, nous présentons une procédure pour transfecter les cellules embryonnaires primaires avec les constructions de l’expression des marqueurs fluorescents organite. Ainsi, les morphologies cellulaires et subcellulaires structures peuvent être analysées avec haute résolution spatiale et temporelle de types cellulaires distincts qui conservent leurs caractéristiques principales.

<table><tbody><tr><td>Fish lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB (de type sauvage)</td><td></td><td></td><td>établie par Streisinger et ses collègues, disponible auprès du Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td></tr><tr><td>Tg(ptf1a :eGFP)jh1</td><td></td><td></td><td>lignée transgénique stable dans laquelle l’activateur du gène du poisson zèbre ptf1a entraîne l’expression de la protéine fluorescente EGFP (Parsons et al., 2007)</td></tr><tr><td>Tg(XITubb :DsRed)zf148</td><td></td><td></td><td>lignée transgénique stable dans laquelle le promoteur de la bêta-tubuline Xenopus neural-specific stimule l’expression de la protéine fluorescente DsRed&nbsp ; (Peri et N&uuml ; sslein-Volhard, 2008)</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>model 5804 R</td></tr><tr><td>Système d’imagerie ChemiDoc MP</td><td>BioRad</td><td></td><td>modèle XRS+, utilisé pour l’acquisition d’images en noir et blanc de boîtes de Pétri contenant 1 da embryons</td></tr><tr><td>microscope confocal à balayage laser</td><td>Microsystèmes</td><td></td> Leica <td>modèle SP8, équipé de 28 &deg ; C et un microscope épifluorescent objectif 63X</td></tr><tr>modèle DM5500B de microscope<td>Leica</td><td>microsystems</td><td></td><td>, équipé de 28 &deg ; C et un objectif 40X</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell avec prolongateur de capacité</td><td>BioRad</td><td>1652661</td><td>dispositif d’électroporation</td></tr><tr><td>Agitateur horizontal</td><td>GFL</td><td></td><td>modèle 3011</td></tr><tr><td>incubateur pour la culture cellulaire (28 &deg ; C)</td><td>Incubateur modèle</td> <td>Memmert</td><td></td> I</tr><tr><td>incubateur pour embryons (28 &deg ; C)</td><td>Microscope optique Heraeus</td><td></td><td>type B6120</td></tr><tr><td></td> Modèle <td>Zeiss</td><td></td><td>TELAVAL 31</td></tr><tr><td>Micro pipettes</td> Banc de travail stérile <td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio Base</td><td></td><td>avec flux laminaire et pince à épiler à lumière UV</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td></td><td>Style 5,</td></tr><tr><td>Rotateur de tube vertical</td> Inox <td>Labinco B.V.</td><td></td><td>modèle LD-79</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>BioRad</td><td></td><td>pour le système d’imagerie ChemiDoc MP de BioRad</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Santé</td><td></td><td>utilisée pour compter les embryons de 1 dpf en appliquant l’outil Compter les particules aux images en noir et blanc respectives ; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, États-Unis, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>pour microscopes confocaux et épifluorescents de Leica Microsystems</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-DCX-tdTomato</td><td>K&ouml ; ster Lab</td><td># 1599</td><td>basé sur le squelette pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-eGFP</td><td>K&ouml ; ster Lab</td><td># 7</td><td>basé sur le squelette pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-H2B-mseCFP</td><td>K&ouml ; ster Lab</td><td># 2379</td><td>basé sur le squelette pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-mClover</td><td>K&ouml ; ster Lab</td><td># 3865</td><td>basé sur le squelette pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-MitoTag-YFP</td><td>K&ouml ; ster Lab</td><td># 2199</td><td>basé sur le squelette pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-ss-RFP-KDEL</td><td>K&ouml ; ster Lab</td><td># 4330</td><td>basé sur le squelette pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-VAMP1-mCitrine</td><td>K&ouml ; ster Lab</td><td># 2291</td><td>basé sur le squelette pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pSK-UAS :mCherry</td><td>K&ouml ; ster Lab</td><td># 1062</td><td>basé sur le squelette pBluescript de Stratagene</td></tr><tr><td>Les numéros de plasmide se réfèrent aux entrées de la base de données du K&ouml ; Ster Lab. Des plasmides sont disponibles sur demande.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plastic and glass ware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer (40 &micro ; m)</td><td>FALCON</td><td>REF 352340</td><td>distribué par BD Bioscience, utilisé comme « épuisette" pour tremper les embryons découpés dans de l’éthanol et les transférer rapidement dans un milieu de culture cellulaire frais</td></tr><tr><td>Tubes de réaction</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>24 puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube falconic</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 96 puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924.005</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer (40 &micro ; m)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542 040</td><td>avec fentes de ventilation ; utilisé pour filtrer les cellules après une cuvette d’électroporation par dissociation médiée par la collagénase</td></tr><tr><td>(0,4 cm)</td><td>Lamelles en verre Kisker</td><td>4905022</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1051201</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific (Menzel Gl&auml ; ser)</td><td>631-0845</td><td></td></tr><tr><td>Chambre Neubauer</td><td>Henneberg-Sander GmbH</td><td>9020-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur (plastique ; 3 mL)</td><td>A. Hartenstein</td><td>PP05</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (plastique ; diamètre 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>821473</td><td>pour embryons de poisson-zèbre pointes de</td></tr><tr><td>pipette</td><td>Sarstedt</td><td>Blue (1000 &micro ; l) : 70762 ; Jaune (200 &micro ; l) : 70760002 ; Blanc (10 & micro ; L) : 701116</td><td></td></tr> boîtes stériles de <tr><td>culture cellulaire (plastique ; diamètre 3 cm)</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93040</td><td></td></tr> boîtes stériles de <tr><td>culture cellulaire (plastique ; diamètre 6 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>boîtes de Pétri stériles (plastique ; diamètre 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>pour la dissection</td></tr> <tr><td>cérébraleNom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Roth</td><td>0601.1</td><td></td></tr><tr><td>4 % de paraformaldéhyde dans 1x PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>nitrate de calcium tétrahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>éthanol p.a. 100 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>chèvre &alpha ;-souris IgG (spécifique Fc) FITC conjugué</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31547</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>graisse sous vide poussé</td><td>DOW CORNING</td><td>3826-50</td><td>graisse de silicone utilisée pour les plats à fond en verre fabriqués par nos soins</td></tr> sulfate de <tr><td>magnésium heptahydrate</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>bleu de méthylène</td><td>Serva</td><td>29198.01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubuline monoclonale, anticorps acétylé</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount (support de montage)</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Biochrom</td><td>L 7240</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de puissance</td><td>Merck</td><td>104938</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé</td><td>Roth</td><td>68514-61-4</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Synonyme : Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>collagénase (Type 2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>dissoudre la poudre dans un milieu de culture cellulaire (8 mg/mL) et filtrer la solution de manière stérile, stocker les aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>pronase (de Streptomyces griseus)</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>distribués par Sigma-Aldrich, se dissolvent dans 30 % de Danieau (10 mg/mL) et stockent les aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Medium et solutions pour la culture cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-169</td><td>distribué par Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Milieu CO2-indépendant</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>18045054</td><td>distribué par Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sérum de veau filtré (FBS)</td><td>PAN-Biotech</td><td></td><td>single batch</td></tr><tr><td>glutamine 100x</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>25030081</td><td>distribué par Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Milieu L-15 de Leibovitz</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>11415049</td><td>distribué par Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PenStrep (10 000 U/mL)</td><td>Gibco par Life Technologies</td><td>15140148</td><td>distribué par Thermo Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

culture et la transfection des cellules primaires de poisson-zèbre

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Des embryons de poisson-zèbre sont transparentes et se développeront rapidement en dehors de la mère, permettant ainsi d’excellents en vivo imagerie des processus biologiques dynamiques chez un vertébré intacte et en développement. Cependant, l’imagerie détaillée de la morphologie de types cellulaires distincts et des structures subcellulaires est limité dans toute montures. Donc, nous avons établi un protocole efficace et facile à utiliser pour la culture des cellules vivantes primaire par des embryons de poisson-zèbre et de tissus adultes.
En bref, 2 embryons de poisson-zèbre dpf sont déchorionés, deyolked, stérilisé et se dissocie des cellules individuelles avec la collagénase. Après une étape de filtration, les cellules primaires sont ensemencés sur des plats en verre bas et cultivées pendant plusieurs jours. Des cultures fraîches, au long terme différencié ceux, peuvent être utilisés pour les études d’imagerie confocale haute résolution. La culture contient différents types de cellules, avec des myocytes striés et les neurones étant visible sur revêtement poly-L-lysine. À spécifiquement étiquette structures subcellulaires de protéines marqueur fluorescent, nous avons aussi établi un protocole d’électroporation qui permet la transfection d’ADN plasmidique dans différents types de cellules, y compris les neurones. Ainsi, en présence de l’opérateur défini des stimuli, comportement cellulaire complexe et dynamique intracellulaire des cellules primaires de poisson-zèbre peut être évaluée avec une haute résolution spatiale et temporelle. En outre, en utilisant le cerveau adulte poisson-zèbre, nous démontrons que la technique de dissociation décrites, ainsi que les conditions de culture base, également travaillent pour des tissus de poisson-zèbre adulte.

Figure 1 montre une image de lumière transmise d’une culture typique provenant d’embryons de type sauvage avec des myocytes striés et amas de cellules de neurone comme étant plus abondant. Pour identifier plus facilement certains types de cellules, une lignée transgénique avec expression spécifiques à un type de cellule d’une protéine fluorescente peut être utilisée (Figure 1 H).
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Nous présentons un protocole efficace et facile à utiliser pour la préparation de cultures de cellules primaires d’embryons de poisson-zèbre pour la transfection et l’imagerie de cellules vivantes, mais aussi un protocole pour préparer les cellules primaires du cerveau adulte poisson-zèbre.

Culture et la Transfection des cellules primaires de poisson-zèbre

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Cette méthode fournit à la communauté du poisson-zèbre un outil pour l’analyse de la dynamique intercellulaire avec une résolution inatteignable in vivo. Et aussi cela permet de compenser le manque de lignées cellulaires de poisson-zèbre. Le principal avantage de cette technique est que vous isolez et transférez ces cellules primaires directement à partir du tissu d’origine, vous n’avez donc pas besoin de conserver des lignées cellulaires.Pour commencer le protocole, préparez les embryons de poisson-zèbre deux jours après la fécondation, ou dpf. Le premier jour, il a mis en place plusieurs croisements de la souche de poisson zèbre de son choix. Le deuxième jour, accouplez-vous avec le poisson et récupérez les œufs directement après la ponte dans une boîte de Pétri en plastique de 10 centimètres.Prélevez les œufs morts et contaminés à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Lavez les œufs une fois avec du Danieau 30 % avec 0,0001 % en poids par volume de bleu de méthylène. Remplacez ensuite le milieu par du Danieau frais 30 % sans bleu de méthylène et incubez les œufs pendant la nuit à 28 degrés Celsius.Le troisième jour, retirez les embryons morts et contaminés et échangez le mi

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La vidéo montre une méthode de culture de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires à partir d’embryons de poisson-zèbre. Les embryons à un stade précoce subissent une dissection pour isoler les yeux, qui sont ensuite dissociés mécaniquement en une suspension de cellules ganglionnaires rétiniennes. Cette suspension cellulaire est cultivée sur des lamelles recouvertes de protéines adhésives pour faciliter le développement des axones.

Génération de cultures de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires à partir d’embryons de poisson-zèbre

Ici, nous fournissons une méthode reproductible pour examiner la neurogenèse adulte en utilisant un essai de neurosphères dérivées de l'ensemble du cerveau ou de l'une ou l'autre télencéphalique, tectale ou des régions cérébelleuses du cerveau adulte de poisson zèbre. En outre, nous décrivons la procédure de manipuler l'expression des gènes dans les neurosphères de poisson zèbre.

Isolement et culture de neurosphères Adult Zebrafish Brain-dérivés

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

Nous décrivons ici les modèles de xénogreffes de poisson zèbre en utilisant deux sites d'injection différents, à savoir, l' espace périvitelline et canal de Cuvier, pour étudier le comportement invasif et d'évaluer le potentiel de intravasculaire et extravasation des cellules cancéreuses du sein humain, respectivement.

Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain dans Embryonic Zebrafish

Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Les manipulations embryologiques telles que la disparition et la transplantation de cellules sont des outils importants pour étudier le développement précoce. Ce protocole décrit un dispositif de transplantation simple et efficace pour effectuer ces manipulations chez des embryons de poisson zèbre.

Un dispositif de transplantation simple et efficace pour les embryons de poisson zèbre

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Ici, nous présentons un protocole de culture 3D efficace, facile et rapide pour la formation de sphéroïdes de deux lignées cellulaires de poisson zèbre (Danio rerio): ZEM2S (embryon) et ZFL (hépatocytes normaux).

Une méthode de culture 3D de sphéroïdes de lignées cellulaires de poissons-zèbres embryonnaires et hépatiques

Nous présentons ici un protocole de transplantation de cellules à haute résolution spatiale et temporelle chez des embryons et des larves de poisson-zèbre à n’importe quel stade entre au moins 1 et 7 jours après la fécondation.

Transplantation cellulaire à haute résolution chez le poisson-zèbre embryonnaire et larvaire

Apprenez à culturer et transfecter des cellules primaires de Danio rerio pour étudier la dynamique intercellulaire en imagerie cellulaire vivante. Cette méthode offre une résolution inégalée pour la biologie cellulaire.

Culture et la Transfection des cellules primaires de poisson-zèbre

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