Name: In Vitro Élevage des abeilles solitaires : un outil pour évaluer les facteurs de risque larvaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez l'élevage in vitro des larves d'abeilles solitaires pour évaluer l'impact des fongicides sur leur développement et leurs symbiontes microbiens. Cette méthode permet d'isoler les facteurs de risque pour la santé des pollinisateurs.

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Les auteurs remercient Kimball Clark et Tim Krogh pour fournir des roseaux nidification Osmia , Meredith Nesbitt et Molly Bidwell d’assistance dans le laboratoire, les Drs Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter et trois évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles qui ont amélioré le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des fonds de la USDA-Agricultural Research Service ouvert (Current Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin Department of Agriculture, le commerce et la Protection des consommateurs (#197199), National Science Foundation (sous Grant no DEB-1442148), le centre de recherche de bioénergie DOE Great Lakes (DOE Office of Science, DE BER-FC02-07ER64494).

1. Préparez expériences d’exposition fongicide Propiconazole Solutions
<ol><li>Préparer 0,1 x solution fongicide en dissolvant les volumes appropriés de propiconazole achetés dans le commerce 14,3 % dans de l’eau stérile le jour de l’expérience. Veiller à ce que la seule solution fongicide fraîchement préparé est utilisée pour tous les traitements.</li>
	<li>Ajouter 23 µL de 0,1 x solution fongicide par gramme de provision de pollen pour obtenir la concentration maximale du propiconazole rapportée du pollen d’abeille Collector24 (0,361 PPM ou µg d’ingrédient actif g-1 de pollen).</li>
</ol>2. récolte des oeufs et dispositions Pollen hôte Osmia roseaux
<ol><li>À l’aide d’un scalpel stérilisé, disséquer fraîchement branché nidification roseaux de Osmia, diviser en deux parties sur la longueur de l’anche pour exposer les chambres individuelles. NOTE : Chaque nid peut contenir entre 8 et 14 chambres et un seul oeuf dans une chambre.</li>
	<li>Inspecter les roseaux visuellement afin d’identifier les chambres contenant des œufs mâles issus des directives publiées antérieurement77. Utiliser une aiguille tordue stérilisée pour supprimer chaque disposition de pollen ainsi que le œuf associée de l’anche de nidification et placer dans un endroit propre peser bateau.</li>
	<li>Doucement séparer le œuf de la disposition à l’aide d’un pinceau propre fine et enregistrer le poids frais de la fourniture de pollen et d’oeufs à l’aide d’une balance de laboratoire standard. Calculer le poids moyen des dispositions pollen mâle.</li>
	<li>Effectuez les opérations suivantes avec un délai minimal pour réduire les risques de dommages à l’oeuf d’une exposition à l’échauffement et la déshydratation.</li>
</ol>3. préparer l’hôte plante Pollen dispositions
<ol><li>Inspecter visuellement le pollen de plantes-hôtes maternellement recueillies exhumé dans les chambres de nidification pour s’assurer qu’aucun parasite n’est présent78. Afin de réduire tout biais potentiels maternelle, combiner les dispositions de pollen en une masse unique dans une boîte de petri stérile et mélanger bien à l’aide d’une aiguille stérilisée.</li>
	<li>Divisons la masse combinée des nouvelles dispositions de pollen, s’assurer que le poids de chaque disposition reconstitué est approximativement égal au poids moyen d’une disposition des mâle naturellement attribué (moyenne ± écart-type, 0,35 ± 0,01 g, N = 42). Remarque : Étant donné que Osmia sp. alloue plus petites dispositions de pollen à la descendance mâle, il en résulte un poids plus faible des larves mâles par rapport à celle des femelles,77. Pour éviter une telle partialité résultant des différences de sexe, utilisez uniquement les oeufs mâles dans les expériences.</li>
</ol>4. préparer la fourniture de Pollen de plantes Non hôtes
<ol><li>Pulvériser le miel acheté dans le commerce Collector bee pollen en poudre fine à l’aide d’un broyeur à billes standard de laboratoire.</li>
	<li>Basé sur la teneur des dispositions de pollen hôte maternellement Collector (~ 20 %), l’hydrate la poudre de pollen à l’aide des volumes appropriés de sucre 40 % stérilisés solution79 et mélanger soigneusement pour former une pâte consistance.</li>
	<li>Diviser en masses de pollen individuels, chacun pesant environ le même que le poids moyen d’une disposition des mâle naturellement attribué. NOTE : Taux d’humidité de pollen hôte maternellement recueillies dispositions peuvent être normalisées en avant en comparant le poids frais et sec des dispositions de pollen de 30 chambres hommes choisis au hasard,80. Pour obtenir le poids sec, les dispositions de pollen doivent être lyophilisées dans un lyophilisateur (1,5 Pa pendant 72 h).</li>
</ol>5. Préparez les plaques de Culture cellulaire multipuits
<ol><li>La ligne des puits individuels de stérile 48 puits culture avec tasses étain autoclavés (5 × 9 cm). En utilisant une pince stérile, doucement flair sur la bordure supérieure de la capsule afin qu’il peut accueillir la provision de pollen.</li>
	<li>Placez une seule masse d’hôte ou non disposition de pollen à l’intérieur de la coupe d’étain à l’aide des outils stériles basées sur le groupe de traitement. Remarque : Pour éviter la contamination croisée, utilisez plaques séparées pour le traitement et les groupes témoins.</li>
</ol>6. ajouter les fongicides
<ol><li>Faire une dépression position centrale au sein de la masse de pollen à l’aide d’un bâton en bois stérile. Utilisez un nouveau bâton pour chaque disposition de pollen.</li>
	<li>Ajouter des volumes appropriés de solution fongicide (pour traitement) ou d’eau stérile (pour les contrôles) dans la dépression. Pincez l’ouverture de la dépression à l’aide d’une pince stérile afin de minimiser la surface de contact entre le fongicide / stérile l’eau et l’oeuf.</li>
	<li>Assurez-vous que la factorielle mise en place du plan expérimental s’aligne avec celui représenté dans la représentation schématique (Figure 4).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg"> Figure 4. Représentation schématique de l’installation expérimentale. L’expérience représente un entièrement traversé 2 × 2 factorielle des configurations. Facteur 1 représente l’exposition fongicide et se compose de 2 niveaux : (i) Aucun fongicide (N = 10) et (ii) fongicide (N = 10). Facteur 2 représente la source de Pollen et se compose de 2 niveaux : pollen hôte (i) (N = 8) et (ii) Non-hôte pollen (N = 8). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
7. arrière et observer les larves
<ol><li>Placer un œuf homme choisi au hasard sur la surface supérieure de la provision de pollen à l’aide d’un pinceau propre fine. Une fois que les oeufs ont été placés sur toutes les dispositions, replacez le couvercle de la plaque de culture cellulaire, fixant avec marquage du ruban sur les coins.</li>
	<li>Placer les plaques bien sur un plateau propre et couvrez-la avec un linge foncé pour obstruer le contact avec la lumière directe. Place un puits 6 plaque contenant 30 mL d’eau stérile dans la barre d’État pour éviter la dessiccation. Laisser les bacs d’incubation à l’intérieur d’un incubateur à température ambiante.</li>
	<li>Observer des plaques bien tous les jours sous un microscope à dissection sans enlever le couvercle des plaques bien. Veiller à ce que les larves sont vivants en recherchant les mouvements. Si aucun mouvement n’est détecté, jeter la coupe étain contenant les larves mortes et la fourniture de pollen restants. Permettre à toutes les larves survivantes de développer non perturbée dans les plaques bien jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade prénymphal.</li>
	<li>Retirez la larve de la coupe d’étain lorsqu’elle atteint le stade prénymphal41. Utilisez une brosse pour le lavage des déféquer partir du cocon de soie. Soigneusement couper à travers le cocon de soie à l’aide d’un microscope à dissection et extraire le prépupale avec une pince en caoutchouc.</li>
	<li>Gérer le prépupale doucement pour s’assurer que les outils ne pas percent le corps mou. Noter le poids frais de la prépupale (prénymphale biomasse) et la durée du développement de l’oeuf au stade prénymphal (durée du développement larvaire). Remarque : Toute larve morte doit être jetée immédiatement pour empêcher la croissance microbienne indésirable sur le cadavre et la fourniture de restes de pollen. Cela réduit le risque d’infection pour les larves saines restantes.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Élevage d’abeilles à l’extérieur de leurs roseaux nidification naturelle, dans des conditions de laboratoire, permet l’essai de plusieurs hypothèses relatives à la remise en forme larvaire. Dans la mesure où les facteurs non identifiés continuent à causer la mortalité des abeilles, des études d’évaluation des risques à l’aide de in vitro expériences peuvent aider à identifier les menaces potentielles et informer des pratiques de gestion pour ce groupe riche en espèces de pollinisateurs sauvages <sup class="xref"...

Compte tenu de leur rôle comme le groupe dominant des insectes pollinisateurs1, la perte globale dans les populations d’abeilles constitue une menace pour la sécurité alimentaire et l’écosystème stabilité2,3,4,5,6 ,,7. Les tendances à la baisse dans les deux populations d’abeilles sauvages et non managées ont été attribués à plusieurs facteurs de risque partagés, y compris la fragmentation de l’habitat, émergeant des parasites et pathogènes, perte de diversité génétique et l’introduction d’espèces envahissantes3 ,4,7,8,9,10,11,12. En particulier, l’augmentation spectaculaire de l’utilisation des pesticides, (p. ex., les néonicotinoïdes) a été directement liée à des effets néfastes chez les abeilles13,14,15. Plusieurs études ont montré que la synergie entre les néonicotinoïdes et ergostérol-inhibiteur de la biosynthèse des fongicides (EBI) peut entraîner une mortalité élevée à travers plusieurs abeilles espèces16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. Néanmoins, fongicides, longtemps considéré comme « bee-safe », continuent à être pulvérisés sur les cultures en fleurs sans beaucoup d’examen minutieux23. Abeilles butineuses ont été documentés pour ramener systématiquement les masses polliniques contaminés par des résidus de fongicide24,25,26. La consommation de ce fongicides-ladenpollen peut provoquer une mortalité élevée chez les larves d’abeilles27,28,29,30et une suite d’effets sublétaux chez les abeilles adultes16 , 31 , 32 , 33 , 34. une étude récente suggère que fongicides peuvent provoquer des pertes d’abeilles en altérant la communauté microbienne au sein de la ruche-stockée pollen, perturbant ainsi les symbioses critiques entre les abeilles et les microbes transmis par pollen35.
Bien que les abeilles solitaires sont indispensables à la pollinisation de plusieurs plantes sauvages et agricoles36,37,38, ce groupe diversifié des pollinisateurs a reçu beaucoup moins d’attention dans les études de surveillance des pesticides. Le nid d’une femelle adulte solitaire contient 5-10 chambres de couvée scellées, chacun agrémentés d’une masse finie de maternellement Collector pollen et nectar et un seul oeuf39. Après l’éclosion, les larves s’appuient sur la fourniture de pollen allouée et la microflore transmises par pollen associée afin d’obtenir une nutrition adéquate40,41. Parce qu’ils n’ont pas les avantages d’un mode de vie sociale, abeilles solitaires peuvent être plus vulnérables aux pesticides exposition42. Par exemple, tandis que des déficits sociaux abeilles après une pulvérisation peut être compensée à certains étendent en travailleurs et nouvelles couvées, la mort d’une seule femelle solitaire adulte termine toute activité reproductrice43. Ces différences de sensibilité mettent en évidence la nécessité d’incorporer des taxons divers abeille en études écotoxicologiques pour assurer une protection adéquate pour les abeilles sauvages et non managée comme. Toutefois, mis à part une poignée d’études, enquêtes sur les effets de l’exposition de fongicide a surtout à abeilles sociales18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.
Les abeilles solitaires appartenant au genre Osmia (Figure 1) ont été utilisés dans le monde entier comme des pollinisateurs efficaces de plusieurs importants fruits et noix cultures39,50,51,53, 53. comme avec les autres pollinisateurs managé regroupe24,,du5455,56,57,58, abeilles Osmia adultes sont systématiquement exposés aux fongicides pulvérisés sur les cultures en fleurs44. Femelles adultes nourrissent les cultures récemment pulvérisées peuvent recueillir et stocker leurs chambres de couvée avec du pollen de fongicide-laden, qui constitue plus tard le régime unique pour les larves en développement. Consommer les dispositions du pollen contaminé peut exposer ensuite les larves à des résidus de fongicide42. Le risque d’exposition peut être plus élevé chez les espèces d’oligolectiques qui s’alimentent uniquement sur quelques proches hôte plantes59,60,61. Certaines abeilles mégachiles, par exemple, semblent préférentiellement recherchent le pollen de faible qualité des Astéracées, comme un moyen de réduire le parasitisme62. Toutefois, l’étendue des auquel fongicides répercussions de remise en forme larvaire chez les abeilles solitaires oligolectiques n’a pas été empiriquement quantifiée. L’objectif de cette étude est d’élaborer un protocole pour tester les principaux et des effets interactifs de la source de l’exposition et le pollen fongicide sur l’aptitude de in vitro élevés des abeilles solitaires. Pour étudier, oeufs de ribifloris o. sensu lato (s.l.) peuvent être obtenus sur le marché (Table des matières). Cette population est idéale en raison de son importance comme un pollinisateur natif et sa forte prédilection pour les riches en nectar Mahonia aquifolium (Mahonia nervé) trouvés dans la région53,63,64 (Figure 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> Figure 1. Une photo à haute résolution d’un adulte Osmia ribifloris. Crédit photographique Dr Jim Cane, recherche entomologiste, USDA-ARS <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> Figure 2. Phragmite nidification roseaux de Osmia ribifloris (s.l.) avec une femelle de nidification à l’avant-plan. Partitions de chambre et prises terminales pour les anches sont construits à partir des feuilles mastiquées. Photo crédit M. Kimball Clark, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Le premier objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de la consommation de pollen traitées par des fongicides sur la remise en forme larvaire (mesurée en termes de temps de développement et de la biomasse prénymphale). Alors que l’exposition à la propiconazole fongicide couramment appliquée a été associée à une mortalité accrue chez les abeilles adultes à travers plusieurs espèces 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, son impact sur les abeilles larvaires est inférieur connu. Le deuxième objectif de cette étude est d’évaluer les effets de la consommation de pollen non hôte sur la forme larvaire. Des études antérieures indiquent que les larves d’abeilles oligolectiques ne parviennent pas à se développer lorsque obligés de consommer le pollen non hôtes68. Ces résultats peuvent être attribuées aux variations de l’abeille physiologie69, pollen biochimie70et le microbiome bénéfique associé à pollen naturel dispositions71. Le troisième objectif de cette étude est d’évaluer les effets interactifs de traitement fongicide et diététique pollen sur la remise en forme larvaire.
Nombreux traits biologiques, y compris la taille du corps maternel, provisionnement taux, stratégie de recherche de nourriture et quantité de pollen72,73,74,75 sont connus pour affecter une remise en forme larvaire chez les abeilles solitaires. Ces facteurs peuvent introduire une variation importante entre les roseaux, qui pose un problème dans le développement de modèles expérimentaux défendables lors de l’évaluation de santé larvaire. En outre, étant donné que le développement larvaire se produit à l’intérieur de roseaux de nidification scellé, les effets de cette variabilité sur la descendance sont difficiles à visualiser et quantifiés sans utiliser des techniques non létales (Figure 3). Pour relever ce défi, toutes les hypothèses dans cette étude sont testés à l’aide de larves élevées en dehors de leur nidification roseaux. Le protocole expérimental représente un entièrement croisées 2 × 2 factorielle tables de travail, avec chaque facteur composé de 2 niveaux ; Facteur 1 : Exposition fongicide (fongicide ; Aucun fongicide) ; Facteur 2 : Source de Pollen (hôte pollen, pollen Non-hôte). Abeilles sont déclenchés de le œuf au stade prénymphal dans les plaques de culture cellulaire multipuits stérile dans des conditions contrôlées en laboratoire. Chaque bien est approvisionné individuellement avec une quantité standardisée de provision de pollen et un seul oeuf. Après l’éclosion, la larve se nourrit du pollen alloué dans le puits, remplit le développement larvaire et initie la pupaison. Des études antérieures ont montré que la mortalité inexpliquée est plus faible chez les abeilles soulevées au sein de ce milieu d’élevage artificiel que celle rencontrée dans le sauvage49,76. L’utilisation du in vitro-élevage d’abeilles a plusieurs avantages par rapport aux études sur le terrain : 1) elle minimise les effets confondants de variabilité naturelle et incontrôlée des facteurs généralement associés aux études sur le terrain ; 2) il permet plusieurs niveaux de manipulation pour chaque facteur (s) d’intérêt à être testées simultanément dans l’ensemble des groupes de traitement ; 3) le nombre de répétitions peut être prédéterminé, et facteurs expérimentaux pour chaque répétition peuvent être manipulés individuellement ; 4) variables de réponse larves peuvent être facilement visualisés et enregistrés de façon autonome sans inquiétantes larves adjacents ; 5) le protocole peut être modifié pour tenir compte des conceptions expérimentales plus complexes impliquant de multiples facteurs et variables de réponse.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> Figure 3. Contenu dans un roseau de nidification naturel de Osmia ribifloris (s.l.). Près (A) un roseau disséqué montrant des chambres individuelles, dispositions de pollen et des partitions et (B) fraîchement récoltés dispositions de pollen et les œufs associés (indiqués par un cercle noir). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>oeufs de O. ribifloris sensu lato (s.l.)</td><td></td><td></td><td>Kaysville, Davis County, Utah, USA</td></tr><tr><td>Roseaux Osmia</td><td>Nativebees.com</td><td>NA</td><td>Anches fraîchement bouchées</td></tr><tr><td>Kit de dissection</td><td>VWR</td><td>89259-964</td><td>Stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>Pince à bec long</td><td>Husky</td><td>1006</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture à 6 puits</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Scellé stérile</td></tr><tr><td>Plaques de culture à 48 puits</td><td>VWR</td><td>10062-898</td><td>Boîtes</td></tr><tr><td>de Pétri</td> scellées <td>stériles VWR</td><td>25373100</td><td></td></tr><tr><td>Bateaux de pesage carrés</td> étanches <td>stériles VWR</td><td>10770-448</td><td></td></tr><tr><td>Brosse en poil de chameau</td><td>Bioquip</td><td>1153A</td><td></td></tr><tr><td>Capsules d’étain</td><td>EA Consommables</td><td>D1021</td><td>Stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR</td><td>470302-808</td><td></td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3 %</td></tr><tr><td>Pollen d’abeille</td><td>Abeille énergisée</td><td>897098001244</td><td>Pollen brut, naturel non traité</td></tr><tr><td>Microbalance</td><td>VWR</td><td>10204-990</td><td></td></tr><tr><td>Pulverisette</td><td>LAB SYNERGY INC.</td><td></td><td></td>30334913</tr><tr><td>Bâtonnets en bois</td><td>VWR</td><td>470146908</td><td>Stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>VWR</td><td>89403-384</td><td></td></tr><tr><td>Bac de plantation</td><td>VWR</td><td>470150-632</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger</td><td>VWR</td><td>21008936</td><td></td></tr><tr><td>Microseringue</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-07940-07</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler en caoutchouc</td><td>Amazon</td><td>B0135HWPN4</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles à seringue</td><td>VWR</td><td>89219-334</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisateur</td><td>Labcono</td><td>LFZ-1L</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel statistique</td><td>SPSS</td><td>Version 21.0</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro Élevage des abeilles solitaires : un outil pour évaluer les facteurs de risque larvaire

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Bien que les abeilles solitaires offrent des services de pollinisation crucial pour les cultures sauvages et gérés, ce groupe riche en espèces a été largement négligé dans les études de réglementation des pesticides. Le risque d’exposition à des résidus de fongicide est susceptible d’être particulièrement élevé si le jet se produit sur ou à proximité des plantes hôtes tandis que les abeilles recueillent pollen pour provisionner leurs nids. Pour les espèces de Osmia qui consomment le pollen d’un groupe restreint de plantes (oligolecty), l’impossibilité d’utiliser le pollen provenant de plantes non hôtes peut augmenter leur facteur de risque de toxicité liée à fongicide. Ce manuscrit décrit les protocoles utilisés pour élever avec succès oligolectiques mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, de l’oeuf au stade prénymphal au plaques de culture cellulaire dans des conditions de laboratoire normalisées. L' in vitro-élevage d’abeilles sont ensuite utilisés pour étudier les effets de la source de l’exposition et le pollen fongicide sur l’aptitude de l’abeille. Selon un plan factoriel 2 x 2 entièrement traversé, l’expérience examine les effets principaux et interactives de la source de l’exposition et le pollen fongicide sur la forme larvaire, quantifiée par la biomasse prénymphale, durée du développement larvaire et survie. Un avantage majeur de cette technique est que l’utilisation en vitro-élevage d’abeilles réduit la variabilité de fond naturel et permet la manipulation simultanée de multiples paramètres expérimentaux. Le protocole décrit présente un outil polyvalent pour hypothèses essais portant sur la suite des facteurs affectant la santé des abeilles. Pour les efforts de conservation à respecter avec des succès significatifs et durables, ces connaissances sur l’interaction complexe de facteurs physiologiques et environnementales à l’origine des déclins de l’abeille seront révélera pour être critique.

Remise en forme larvaire a été quantifiée à l’aide de trois temps du développement (i) larvaire métriques, biomasse (ii) prénymphale et (iii) le pourcentage de survie. Une ANOVA bidirectionnelle a été réalisée en utilisant une exposition de fongicide (deux niveaux : aucun fongicide, fongicide) et source de Pollen (deux niveaux : le pollen de l’hôte, pollen Non-hôte) comme les variables indépendantes et la durée du développement larvaire comme variable dépendante. L’effet principal d’expos...

Pulvérisations sur les plantes à fleurs peuvent vous exposer à de fortes concentrations de résidus de fongicide transmissibles par le pollen des abeilles solitaires. À l’aide d’expériences en laboratoire in vitro-larves d’abeilles élevés, cette étude examine les effets interactifs de consommer le pollen traitées par des fongicides dérivé de plantes hôte et non hôte.

In Vitro Élevage des abeilles solitaires : un outil pour évaluer les facteurs de risque larvaire

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Les espèces d’abeilles solitaires représentent le groupe d’abeilles le plus diversifié de la planète, mais il peut être assez difficile d’élever avec succès les larves dans des conditions hautement contrôlées. Nous avons créé une méthode de culture in vitro d’espèces d’abeilles solitaires, nous permettant d’isoler et de mesurer les facteurs de risque associés à leurs symbiotes microbiens. Parmi certaines espèces d’abeilles solitaires nichant dans des tiges, il est essentiel que les techniques de culture tiennent compte des jeunes larves ainsi que de leurs symbiotes microbiens nés du pollen.Ici, nous avons mis en lumière les effets principaux et interactifs de plusieurs facteurs de stress, ce qui nous permet de discerner si les facteurs de stress agissent en grande partie seuls ou de concert. Molly Bidwell et Prarthana Dharampal, tous deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. À l’aide d’un scalpel stérilisé, disséquez des roseaux de nidification d’Osmia fraîchement bouchés.Divisez les anches en deux parties dans le sens de la longueur pour exposer les chambres individuelles. Les nids contiennent généralement de huit à 14 chambres avec un œuf par chambre. Identifiez les ovules mâles à l’aide de la méthode standard.Seuls les œufs mâles sont utilisés dans cette expérience en raison du biais sexuel dans la taille de la fourniture de pollen. Les provisions pour les hommes sont généralement plus petites que les provisions pour les femmes. Ensuite, à l’aide d’un instrument stérilisé, retirez chaque provision de pollen ainsi que l’œuf associé et placez-les dans un bateau de pesée propre.Dans le bateau de pesée, séparez délicatement l’œuf de la provision. Pesez ensuite la provision de pollen et l’œuf séparément. Travaillez rapidement avec les œufs d’Osmia pour minimiser leur temps sans le pollen.Pour les préparations d’approvisionnement en pollen d’hôte, inspectez d’abord visuellement le pollen de plantes hôtes prélevé par la mère et extrait des chambres de nidification pour détecter la présence de parasites. Ensuite, pour réduire tout biais maternel potentiel, combinez les provisions de pollen en une seule masse et mélangez-les à l’aide d’une aiguille stérilisée. Ensuite, divisez le pollen de l’hôte en nouvelles dispositions de masse standard.Pour préparer des provisions de pollen de plantes non hôtes, pulvérisez le pollen collecté par les abeilles mellifères dans le commerce en une poudre fine à l’aide d’un broyeur à os de laboratoire standard. Ensuite, en fonction de la teneur en humidité des réserves de pollen de l’hôte, hydratez la poudre de pollen à l’aide d’une solution stérilisée à 40 % de sucre. Mélangez-le jusqu’à obtenir une consistance semblable à celle d’une pâte.Ensuite, faites des provisions de pollen non hôte du même poids que les provisions collectées par la mère. Pour la plaque de traitement, tapisser les puits individuels d’une plaque de culture de 48 puits avec des godets en étain autoclavés. Préparez des plaques distinctes pour les groupes de traitement et de contrôle.Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, évasez doucement le bord supérieur des gobelets afin qu’ils puissent accueillir l’approvisionnement en pollen. Ensuite, chargez des provisions de pollen individuelles dans les gobelets en fer-blanc. Maintenant, à l’intérieur de chaque masse de pollen, faites une dépression placée au centre à l’aide d’un bâtonnet en bois stérile.Utilisez un nouveau bâtonnet pour chaque provision de pollen. Dans la dépression, ajoutez les volumes appropriés de solution de traitement comme un fongicide et de l’eau stérile pour les témoins. Après chaque ajout, pincez la dépression à l’aide d’une pince stérile propre.Pour commencer, chargez bien chaque plaque de traitement avec un œuf mâle sélectionné au hasard. Placez-le sur la provision de pollen à l’aide d’un pinceau fin et propre. Une fois les œufs placés, fixez le couvercle sur l’assiette à l’aide de ruban adhésif sur les coins.Ensuite, placez chaque assiette préparée dans un incubateur maintenu à température ambiante. Inclure une plaque à six puits remplie d’eau stérile pour éviter la dessiccation. Laissez les plaques intactes à l’intérieur de l’incubateur.Vérifiez la plaque quotidiennement sous un microscope à dissection sans retirer le couvercle. Si les larves sont vivantes, elles se déplaceront. Si aucun mouvement n’est détecté, jetez le gobelet contenant les larves mortes et le reste de la réserve de pollen.Lorsqu’une larve atteint le stade de prénymphe, retirez-la de la tasse en étain et utilisez une brosse pour nettoyer les excréments du cocon de soie. Ensuite, à l’aide d’un microscope de dissection, coupez soigneusement le cocon de soie et extrayez la prépupe à l’aide d’une pince poids plume. Manipulez la prépupe avec précaution pour éviter tout dommage à son corps.Notez maintenant la masse de la prépupe et le temps de développement de l’œuf au stade prénymphal. La valeur adaptative des larves a été quantifiée à l’aide du temps de développement larvaire et de la biomasse prénymphale. Il y avait une corrélation négative significative entre le temps de développement des larves et la biomasse prénymphale entre les groupes traités et non traités par fongicide.Bien qu’il y ait eu une corrélation négative significative pour les larves élevées avec du pollen non hôte, aucune relation de ce genre n’a été observée pour les larves élevées avec du pollen d’hôte. La source de pollen a eu un effet principal significatif sur la valeur adaptative des abeilles. Lorsqu’elles sont élevées avec du pollen non hôte, le temps de développement des larves augmente considérablement, tandis que la biomasse prénymphale diminue significativement chez les groupes traités et non traités par rapport aux larves élevées avec du pollen d’hôte.L’exposition aux fongicides n’a pas eu d’effet principal significatif sur la valeur adaptative. Il n’y avait pas de différence statistiquement significative dans le temps de développement et la biomasse prénympale pour les traitements élevés sur le pollen de l’hôte et le pollen non de l’hôte entre les groupes traités et non traités par un fongicide. Il n’y a pas eu d’effet interactif significatif de l’exposition aux fongicides et de la source de pollen sur le temps de développement larvaire et la biomasse prénymphale.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élever avec succès des larves d’abeilles solitaires dans des conditions in vitro. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour élever des abeilles dans des conditions in vitro, de l’œuf au stade nymphal, tout en causant une mortalité minimale due au stress de manipulation. Lors de l’utilisation de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser des œufs ou de très jeunes larves.Cela garantit que les larves sont élevées presque entièrement selon la manipulation prévue des traitements alimentaires. Ce protocole peut être étendu à plusieurs autres espèces d’abeilles et de guêpes solitaires et peut être facilement modifié pour tester les effets principaux et interactifs de multiples facteurs de risque ayant une incidence sur la santé des pollinisateurs. En fournissant un moyen de culture in vitro pour les larves d’abeilles solitaires, cette technique peut aider à identifier des facteurs de risque jusqu’alors inconnus parmi les populations d’abeilles vulnérables.Par exemple, certaines de leurs expériences basées sur ce protocole peuvent aider à déterminer le rôle du microbiome pollinique dans l’octroi de divers degrés de résistance aux facteurs de stress xénobiotiques. En tant que technique accessible et peu coûteuse, ce protocole représente un outil polyvalent pour tester des hypothèses qui peut être facilement modifié par les chercheurs pour répondre à leurs propres objectifs de recherche.

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Le protocole de conditionnement Proboscis Extension Response (PER), développé pour l’abeille mellifère (Apis mellifera), fournit un moyen écologiquement pertinent et facilement quantifiable pour étudier plusieurs mécanismes d’apprentissage différents chez de nombreuses espèces d’insectes.

Un Protocole d&#39;intervention en Trompe d&#39;extension pour les enquêtes plasticité comportementale chez les insectes: application à la base, biomédicale et la recherche agricole

Le but de cette présentation est de démontrer in vivo et in vitro techniques pour l'élevage des nématodes entomopathogènes. Dans les méthodes in vivo considèrent l'élevage de ces nématodes avec un insecte hôte, alors que les méthodes in vitro utilisent rich media agar.

In vivo et in vitro Élevage de Nématodes entomopathogènes (Steinernematidae et Heterorhabditidae)

Nous présentons ici   un procédé pour alimenter des aliments contaminés par les pesticides à la fois une abeille individuelle et une colonie ruche. La procédure évalue l'effet des pesticides sur les abeilles individuelles par l' alimentation in vivo de l' alimentation des larves de base et sur la condition naturelle de la colonie de ruche.

Évaluation de l&#39;incidence des produits chimiques sur l&#39;environnement Miel de développement Abeille de l&#39;individu à la colonie Niveau

Dans le présent protocole, les méthodes pour effectuer des croisements de consanguinité et à l’évaluation de la réussite de ces croisements, sont décrites pour la fourmi Vollenhovia emeryi. Ces protocoles sont importants pour les expériences visant à comprendre les bases génétiques des systèmes de détermination du sexe dans les hyménoptères.

L’induction et l’évaluation des croisements de consanguinité à l’aide de la fourmi, Vollenhovia Emeryi

Ici, nous présentons des protocoles pour 1) la propagation en captivité de laboratoire du papillon bleu de Miami en voie de disparition fédérale (Cyclargus thomasi bethunebakeri), et 2) évaluant des informations de base d’histoire de la vie telles que le temps de développement immature et le nombre de stades larvaires. Les deux méthodes peuvent être adaptées pour une utilisation avec d’autres programmes de conservation ex situ.

Programmes de propagation des papillons captifs à risque pour améliorer les connaissances sur l’histoire de la vie et les techniques efficaces de conservation Ex Situ

Nous décrivons ici deux protocoles: d’abord pour propager, extraire, purifier et quantifier de grandes quantités de particules virales non enveloppées d’abeilles mellifères, y compris une méthode pour éliminer les pupes d’abeilles mellifères et ensuite pour tester les effets de l’infection virale à l’aide d’un essai biologique en cage hautement reproductible et à haut débit.

Préparation de l’inoculum enrichi en virus pour l’infection orale des abeilles mellifères (Apis mellifera)

Ce protocole a été développé pour améliorer la compréhension de la façon dont les produits agrochimiques affectent la reproduction desabeilles mellifères (Apis mellifera)en établissant des méthodes pour exposer les reines des abeilles mellifères et leurs soignants travailleurs aux produits agrochimiques dans un laboratoire contrôlé et en surveillant attentivement leurs réponses pertinentes.

Évaluation du risque agrochimique pour les reines d’abeilles mellifères accouplées

Le présent protocole explique une méthode pour nourrir les larves des abeilles solitaires, Osmia excavata, contaminées par des pesticides. La procédure examine l’écotoxicité du pesticide pour les larves des abeilles solitaires.

Évaluation de l’effet des pesticides sur les larves des abeilles solitaires

Dans le présent document, deux protocoles d’évaluation de la source de nourriture et des préférences de ponte chez les larves et les femelles de mouches à viande sont détaillés. Ceux-ci comprennent quatre choix avec deux facteurs en interaction : le type de substrat et la température. Les tests permettent de déterminer la préférence de la source de nourriture des larves et la préférence du site de ponte pour les femelles.

Explorer les choix de cycle vital : Utilisation de la température et du type de substrat comme facteurs d’interaction pour les préférences des larves et des femelles de la mouche à viande

Nous faisons la démonstration d’une méthode éprouvée pour manipuler en toute sécurité les abeilles collectées sur le terrain. Cette méthode permet une manipulation rapide, une identification, un échantillonnage génétique et la confirmation des interactions plantes-insectes grâce au pollen collecté lors de l’échantillonnage. Facilement adaptable, cette approche offre un moyen rentable et non létal d’étudier des groupes d’insectes rares.

Une méthode rapide pour confiner et manipuler en toute sécurité les abeilles sur le terrain

Découvrez l'élevage in vitro des larves d'abeilles solitaires pour évaluer l'impact des fongicides sur leur développement et leurs symbiontes microbiens. Cette méthode permet d'isoler les facteurs de risque pour la santé des pollinisateurs.

In Vitro Élevage des abeilles solitaires : un outil pour évaluer les facteurs de risque larvaire

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