Name: Isolation rapide de la Mitoribosome de cellules HEK (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'isolation des mitoribosomes à partir de cellules HEK humaines utilisant la cavitation à l'azote. Cette technique efficace permet d'obtenir des mitoribosomes de haute qualité pour les études structurales.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation suédoise pour la recherche stratégique (Future Leaders Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Foundation (Fellowship en médecine M44/16), Conseil de recherche suédois (Starting Grant NT × 2015-04107), bourses de longue durée FEBS (SA) , Projet H2020-ACEM-ITN-2016 721757 (VS).

Tous les travaux de culture de cellules de mammifères doivent être effectué à l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique. Utiliser du matériel stérile si contact avec les cellules. Porter des gants en nitrile et une blouse de laboratoire et suivre la pratique de la bonne culture de tissus.
1. Culture cellulaire
<ol><li>Maintenir les cellules en suspension HEK293S en de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % sérum exempt de tétracycline fœtal (SVF), 5 μg/mL blasticidine et 200 μg/mL azithromycine, à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>L’échelle jusqu'à 9 flacons de x T175. À la confluence de 90 %, récolter les cellules et de filer vers le bas à 500 g pendant 5 min. remettre les cellules granulés en Freestyl additionnée de 5 % FBS exempt de tétracycline. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées et ajuster la concentration cellulaire à 1,5 x 106 cellules/mL dans une fiole de secousse ventilée. Remarque : Ceci correspondra généralement à un volume de départ de 300 mL dans une fiole avec évent de 1 000 mL.</li>
	<li>Incuber les cellules dans un incubateur à agitation à 37 ° C et 5 % de CO2 à 120 tr/min (50 mm de diamètre secouant).</li>
	<li>Après 2 jours compter les cellules et continuer à fractionner les cellules, si la densité est supérieure à 3,0 x 106 cellules/mL. Fractionner les cellules en tournant vers le bas de la culture de cellules de 2 x 150 mL dans des bouteilles coniques de 2 x 250 mL à 500 g pendant 5 min. remettre les cellules en 2 x 10 mL de milieu frais et transférer à un 2 x 1, 000 mL ventilés flacons contenant le volume approprié pour une densité finale de 1. 5 x 106 cellules/mL par exemple 2 x 300 mL d’une densité cellulaire départ de 3,0 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Incuber les cellules dans un incubateur à agitation à 37 ° C et 5 % de CO2 à 120 tr/min (50 mm de diamètre secouant).</li>
	<li>Après deux jours compter les cellules et continuer à fractionner les cellules, si la densité est supérieure à 3,0 x 106 cellules/mL. Split, les cellules de la filature sur culture cellulaire 4 x 150 mL dans des bouteilles coniques 4 x 250 mL à 500 g pendant 5 min. remettre en suspension les cellules en 2 x 10 mL de milieu frais et transférer dans ballon ventilé de 2 x 2 000 mL contenant le volume approprié pour une densité finale de 1. 5 x 106 cellules/mL, par exemple 2 x 700 mL de départ une densité de 3,0 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Incuber les cellules dans un incubateur à agitation à 37 ° C et 5 % de CO2 à 120 tr/min (50 mm de diamètre secouant).</li>
	<li>Après deux jours compter les cellules et continuer à fractionner les cellules, si la densité est supérieure à 3,0 x 106 cellules/mL. Fractionner les cellules en versant le 2 x 700 mL culture cellulaire en 2 x 2800 mL ventilé flacons et recharger avec 2 x 300 mL de milieu frais pour atteindre un volume de 2 x 1 L.</li>
	<li>Incuber les cellules dans un incubateur à agitation à 37° C et 5 % de CO2 à 120 tr/min (50 mm de diamètre secouant).</li>
	<li>Après 24 h compter les cellules et récolter les cellules si la densité des cellules se situe entre 3,0 à 4,0 x 106 cellules/mL.</li>
</ol>2. mitochondries isolement
<ol><li>Tampons requis Note : Les quantités sont données pour une préparation de cellules de 2 L. Préparer les solutions suivantes avance pour tampon d’isolement mitochondriale (MIB), tampon saccharose/mannitol (SM4), tampon expérimental (MIBSM), tampon de resuspension (SEM).<ol>
<li>Tampon de MIB font 0,5 L : 50mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA 1 mM EGTA, 1 millimètre DTT, inhibiteurs de la protéase.</li>
		<li>Faire 100 mL SM4 tampon : saccharose de 280 mM, 840 mM de mannitol, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, EGTA, 1 mM 10 mM 1 m M DTT, inhibiteurs de la protéase.</li>
		<li>160 mL de tampon de MIBSM de marque : 120 mL de tampon de MIB + 40 mL SM4 tampon.</li>
		<li>Stocker 200 mL de PBS à 4 ° C.</li>
		<li>Faire 5 mL SEM tampon : saccharose 250 mM, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, EDTA 1 mM.</li>
		<li>Faire des solutions mères 4 x 10 mL pour le gradient de saccharose par étapes contenant 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, EDTA 1 mM et 60 % / 32 % 23 % et 15 % de sucrose, respectivement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolement de mitochondries Remarque : Il est important de travailler rapidement et de maintenir le tout sur la glace tout au long de la procédure.</li>
	<li>Refroidir le prieur de chambre azote cavitation à utiliser.<ol>
<li>Récolter les cellules 2 x 1 L (3-4 x 109 cellules / tube à centrifuger) par centrifugation à 1 000 x g pendant 7 min, 4 ° C.</li>
		<li>Décanter le liquide surnageant avec soin et remettre en suspension les cellules granulés rapidement en 2 x 100 mL de PBS. Mettre en commun les cellules.</li>
		<li>Centrifuger les cellules resuspendues à 1 200 g pendant 10 min, 4 ° C.</li>
		<li>Décanter le liquide surnageant avec soin et peser le culot (~ 20 g).</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 120 mL de tampon de MIB.</li>
		<li>Permettre aux cellules à gonfler en remuant doucement dans une chambre froide pendant 10 min.</li>
		<li>Placer la chambre de cavitation d’azote sur la glace et transférer les cellules soufflées à la chambre de cavitation d’azote. Ajouter 45 mL SM4 tampon (1/3 du volume final de cellules resuspendues, environ 140 mL, ce qui donne une concentration finale de 70 mM de sucrose et 210 mM de mannitol).</li>
		<li>Fixer l’azote cavitation chambre et le remplissage à l’azote jusqu'à ce que la pression atteint 500 lb/po2. Fermer les robinets et le maintenir isolé sur la glace pendant 20 min.</li>
		<li>Doucement, relâcher la pression dans la chambre de cavitation azote et récupérer le lysate (environ 185 mL).</li>
		<li>Centrifuger le matériau lysé pour supprimer les débris cellulaires et les noyaux à 800 g pendant 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recueillir le liquide surnageant en le versant dans l’étamine dans un bécher gardé sur glace. Ne jetez pas le culot.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans un tampon MIBSM 90 mL (1/2 le volume précédent). Homogénéiser à l’aide de téflon/verre Dounce homogénéisateur et répétez la centrifugation à 800 x g pendant 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recueillir le liquide surnageant en le versant dans l’étamine dans un bécher gardé sur glace. Combinez ce surnageant avec le surnageant de l’étape 2.2.11.</li>
		<li>Centrifuger les surnageants combinées à 1 000 x g pendant 15 min, 4 ° C.</li>
		<li>Recueillir le liquide surnageant en le versant dans l’étamine dans un bécher gardé sur glace.</li>
		<li>Jeter le culot et centrifuger le surnageant contenant des mitochondries bruts à 10 000 g pendant 15 min, 4 ° C. Remarque : Le pellet sera typiquement constituée de deux parties : lâche et serré.</li>
		<li>Lavent soigneusement par le culot lâche sans déranger la partie serrée. Resuspendre le culot serré dans 10 mL de tampon MIBSM.</li>
		<li>Effectuer un dosage de concentration protéique à l’aide d’une trousse de dosage de protéine commerciale ou une méthode similaire. Les rendements de concentration typique de 2 L à partir de la culture sont environ 2 mg/mL.</li>
		<li>Ajouter 200 unités de RNase free DNase et laisser pour tourner sur un rouleau dans la chambre froide pendant 20 min à mélanger uniformément la DNase pour l’enlèvement de l’ADN génomique.</li>
		<li>Centrifuger à 10 000 g pendant 15 min, 4 ° C et Resuspendre le culot dans 2 mL SEM de tampon. Homogénéiser doucement en utilisant un petit homogénisateur Dounce Teflon/verre pour remettre en suspension les agrégats restants. Effectuez pas plus de cinq passes de haut en bas pour éviter la casse. Rester sur la glace.</li>
		<li>Préparer le gradient de saccharose dans 14 mL tubes SW40 par pipetage soigneusement 1,5 mL de 60 % de sucrose stock tampon au fond du tube. Ajouter avec précaution 4,5 mL de 32 % de sucrose stock tampon sur le dessus de la bande de 60 % sans déranger il. Répétez avec 1,5 mL de tampon de stock de 23 % de sucrose et de nouveau avec 1,5 mL de tampon de stock de 15 % de sucrose.</li>
		<li>Charger la suspension mitochondriale complet (environ 3 mL) sur le dessus du gradient de saccharose.</li>
		<li>Centrifuger à rotor SW40 à 139, 065 x g pendant 60 min.</li>
		<li>Soigneusement collecter la bande brune migrer vers l’interface de 32 % et 60 % de sucrose à l’aide d’une pipette de transfert, généralement de 2 à 3 mL.</li>
		<li>Clin d’oeil-gel les mitochondries purifiées dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. préparation de Mitoribosome
<ol><li>Tampons requis Remarque : Préparer les solutions suivantes avance pour le tampon de lyse, coussin/gradient de sucrose et tampon de resuspension.<ol>
<li>Faire 10 mL de tampon lyse : 25 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM de KCl, 50mM MgOAc, 2 % polyéthylène glycol éther d’octylphényle, 2 mM DTT, inhibiteurs de la protéase.</li>
		<li>Faire 10 mL de tampon de coussin saccharose : sucrose à 1 M (34 % p/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, 1 % polyéthylène glycol éther d’octylphényle, 2 mM TNT.</li>
		<li>Faire 5 mL de tampon de resuspension : 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM de KCl, 20mM MgOAc, 2 mM TNT</li>
		<li>Faire des gradients de sucrose linéaire avec tampon de resuspension 15-30 % dans des tubes en polycarbonate TLS-55.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitoribosome purification<ol>
<li>Décongeler les mitochondries congelés sur la glace.</li>
		<li>Ajouter 2 volumes de la mémoire tampon de lyse,par exemple ajouter de tampon de lyse 6 mL aux mitochondries de 3 mL. Mélanger immédiatement en renversant le tube plusieurs fois.</li>
		<li>Homogénéiser avec un petit verre/téflon dounce homogénéisateur pour aider la lyse et incuber pendant 5 à 10 minutes sur la glace pour terminer la lyse.</li>
		<li>Centrifuger le matériau lysé (environ 9 mL) à 30 000 x g pendant 20 min, 4 ° C pour enlever la matière insoluble. Décanter le liquide surnageant avec précaution de la pastille et jeter le culot.</li>
		<li>Répétez la centrifugation à 30 000 x g pendant 20 min à 4 ° C pour assurer des éclaircissements sur le surnageant. Décanter le liquide surnageant avec précaution de la pastille et jeter le culot.</li>
		<li>Préparer le coussin de saccharose dans des tubes de 120,2 TLA (ultra-clair) : coussin de saccharose de 0,4 mL par tube. Préparer un tube par mL de produit lysé.</li>
		<li>Couche des mitochondries lysés sur les coussins de saccharose : environ 1 mL par tube, ayant pour résultat un lysat : ratio de coussin de 2.5 : 1.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 231, 550 x g pendant 45 min en TLA120.2 rotor à 4 ° C.</li>
		<li>Jeter le surnageant et rincer les tubes séquentiellement avec 100µl de la mémoire tampon de resuspension pour enlever le saccharose résiduel.</li>
		<li>Remettre en suspension les pellets au total 100 µl de tampon de resuspension.</li>
		<li>Vortex à vitesse lente pendant 30 s à dissoudre les agrégats restants et centrifuger à 17 949 x g pendant 10 min dans le microtube centrifuger à 4 ° C.</li>
		<li>Avec précaution, recueillir le surnageant et répétez la centrifugation.</li>
		<li>Mesurer l’absorption de mitoribosome à A260. Remarque : Le rendement typique est de 7 A260, avec A260: A280 ratio de 1,3.</li>
		<li>Charger la totalité de l’échantillon sur un tube de gradient de saccharose linéaire unique. Centrifuger à rotor TLS-55 à 213, 626 x g pendant 120 min à 4 ° C.</li>
		<li>Fractionner le gradient, déterminer la densité optique à A260 et mettre en commun la fraction correspondant au pic de l’acide nucléique ensemble. Remarque : Le typique A260: A280 ratio du pic est > 1.6.</li>
		<li>Échange de la mémoire tampon si nécessaire, en utilisant une méthode de choix. Calculer la concentration finale en utilisant la conversion 1 A260 = 0,1 mg/mL.</li>
		<li>Composant logiciel enfichable geler l’échantillon mitoribosome purifiée dans le tampon de resuspension et conserver à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

En ce qui concerne la source du matériel, de départ, bien que la disponibilité relativement facile de tissus d’origine animales qui sont connus pour être une source riche des mitochondries, il fait un choix populaire pour les mitoribosomes3,5,12, 13, ils ne peuvent pas être génétiquement modifiés et reproduits en laboratoire facilement. Par conséquent, il y a un besoin clair pratique pour l’élaboration des protocoles portant sur des lignées cellulaires humaines cultivées de façon homogène. La principale différence entre les protocoles traitant des tissus et des cellules est le mode de lyse et homogénéisation. Pour les cellules cultivées, cultivés comme une monocouche, une méthode typique est Teflon/verre dounce homogénéisation14. Les protocoles de préparation originale tandis qu’efficace ont été développés pour les petites échelles15. Une extension directe employant un homogénéisateur avec une capacité de 500 mL est possible11, cependant, il faut environ 2 h de travail manuel pour atteindre 80 % de lyse. Cela présente au moins trois questions : agrégation des organites en raison des longs délais d’attente, lyse non homogène en raison des matériaux lourds, couler au fond d’un gros vaisseau, chauffage de l’échantillon en raison de la nécessité de plusieurs tracés. Par conséquent, une méthode préférable de lyse utilise la cavitation d’azote, qui repose sur la décompression d’un navire sous pression16,17. Dans cette méthode, les cellules sont gonflés tout d’abord dans la chambre froide afin de ramollir les cellules et les rendent plus vulnérables à la lyse. Comme ils sont placés dans l’appareil de cavitation azote un tampon contenant du saccharose et du mannitol est ajouté afin de maintenir une pression osmotique qui vous permettront de garder la mitochondrie intacte. L’appareil de cavitation d’azote est alors sous pression avec un grand volume d’azote sans oxygène qui se dissout dans les cellules. Étant donné la pression des bulles d’azote libéré hors de la solution, ce qui entraîne une rupture des membranes cellulaires. Cette méthode offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes homogénéisation mécaniques mettant en cause des contraintes de cisaillement et le frottement comme suit : 1) est d’éviter tout stress physique externe sur les cellules ; 2) une détente adiabatique qui refroidit l’échantillon, n’assure aucun dommages thermiques aux organelles ; 3) composants cellulaires sont protégés contre l’oxydation de l’azote inerte ; 4) aucune modification de pH de comme milieu de suspension ; 5) le processus est uniforme et reproductible car les mêmes forces perturbatrices sont appliquées au sein de chaque cellule et dans l’ensemble de l’échantillon ; 6) le processus est rapide et peut être complété en 20-30 min.
Isolation des mitochondries des cellules et des tissus a été décrit dans la littérature largement, et il est basé sur une perturbation cellulaire douce suivie d’une série de centrifugations différentielles. La plupart des protocoles utilisés actuellement suivre les procédures originales mis au point au milieu du siècle précédent18. Alors que les approches biochimiques fondamentaux sont corrects, il y a plusieurs idées fausses qui sont mis en évidence dans la littérature et sont restés inaperçus. Pour optimiser le protocole pour mitoribosomes, nous systématiquement étudié les principes généraux rapportés et conclure que : 1) Inclusion de Mg2 + et de K+ dans la mémoire tampon ne sont pas crucial. On a fait valoir que l’aide de KCl à prévenir protéines cytoplasmiques de former un gel19, cependant, a fourni une dilution suffisante telle que décrite dans notre protocole, ce phénomène ne se produit pas. En outre, l’exclusion de Mg2 + est utile pour réduire les contaminations par les ribosomes cytoplasmiques20; 2) il n’y a aucun besoin de maintenir le ratio volume possible maximale des cellules au milieu pour protéger les organites libérés dans l’environnement hypo-osmotique. Les osmotiques dans notre protocole est suffisamment confortée par des tampons contenant du saccharose et la dilution des cellules avec un tampon d’isolation mitochondries (étape 2.II.5) est essentiel pour la séparation efficace des organites dans une préparation à grande échelle.
Le pH du tampon d’isolement mitochondries est proche des valeurs physiologiques, c'est-à-dire 7,5, qui est aussi le pH optimal pour la préparation de mitoribosome suivant. Agents liants EDTA et l’EGTA sont ajoutés pour les milieux d’isolement pour chélater les ions contaminantes et ils chélatent gratuit magnésium et calcium, respectivement. Il a été discuté que l’inclusion de l’EDTA peut mener aux dommages de la membrane mitochondriale interne14, la concentration est donc limitée à 1 mM par mesure de précaution. Nous n’avons pas observé aucune différence lorsque vous utilisez 5 mM EDTA dans l’étape de purification finale de gradient de densité de saccharose.
Le protocole décrit ci-après utilise HEK293S dérivés des cellules humaines pour la purification de le mitoribosome. La qualité de la préparation permet à l’échantillon obtenu à investiguer biochimiquement et structurellement à la résolution atomique. Ceci permet d’appliquer la méthode de mitoribosomal humain traduction complexes, des assemblées de contrôle de la qualité et mitoribosomal sous-unités intermédiaires. En outre, étant donné que les cellules cancéreuses ont amplifié capacité OXPHOS et traduction de protéine mitochondriale élevées par rapport aux tissus adjacents de stroma21, mitoribosomes sont cibles médicamenteuses établies pour le cancer22. Par conséquent, utilisant ce protocole pour la purification spécifique de mitoribosomes en présence d’inhibiteurs aura des applications médicales. Aussi, mitoribosomal mutations ont été liées à des maladies mitochondriales héréditaire23. Ces mutations ont des effets directs sur la structure, l’approche présentée ici sera utile pour leur caractérisation structurale. Le protocole peut être développé et appliqué à une série de questions scientifiques s’attaquer à la compréhension fondamentale de la traduction dans les mitochondries humaines et son importance médicale expérimentalement.

Le processus de synthèse des protéines mitochondriales est issu de 13 mt-ARNm essentiel qui se traduisent par une mitoribosome spécialisé attaché à la membrane pour former le noyau catalytique de la chaîne respiratoire. Les génomes mitochondriaux altérées et la nécessité pour les protéines insérer des protéines dans la membrane ont largement façonné l’architecture des ribosomes mitochondriaux1. Ces dernières structures à haute résolution de la mitoribosome chez les mammifères ont montré un aspect général très différent à l’homologue bactérien2,3. En particulier, au moins 36 protéines spécifiques aux mitochondries sont ajoutés, contribuant ~ 1 MDa masse extra moléculaire, tandis que mt-ARNr est réduit de double et fortement divergé. Les réarrangements structuraux modifient presque tous les caractéristiques fonctionnelles essentielles qui auparavant étaient généralement reconnus pour être universellement conservé4.
Nouveaux éléments principaux ont été acquis par chacun des sous-unités mitoribosomal, par exemple, la petite sous-unité a incorporé une mS29 de protéines GTPase intrinsèque dans sa région de « tête ». L’activité GTPase n’a pas été trouvée dans d’autres systèmes de traduction, et la structure indique que la GTPase peut-être avoir un rôle dans la sous-unité Assemblée2. L’ARNr 5 s qui était censé être un point de repère de toutes les sous-unités ribosomiques grandes connues, formant le noyau de la protubérance centrale, est absent de la mitoribosome chez les mammifères et a adopté mt-ARNt-Val comme une composante intégrante plutôt2. Interdiction et ses collègues ont montré que le mitoribosome porcine possède mt-ARNt-Phe et non-Val5. Chrzanowska-Lightowlers Minczuk et collègues suite à ces données et trouvent que mitoribosomes de patients atteints de compromis stabilité mt-ARNt-Val peut en principe accueillir mt-ARNt-Phe6,7. Pourquoi les mitoribosomes ont intégré ces éléments particuliers et quelles voies et trans-facteurs sont nécessaires pour ces assemblys uniques restent inconnues.
Dans l’ensemble, la grande complexité de la mitoribosome humaine, nouveaux constituants protéiques et l’association unique de la mt-tRNA comme élément structurel impliquent la participation des facteurs spécifiques mitochondries comme-encore-inconnu -trans. Toutefois, étant donné que bon nombre des caractéristiques de ce système sont uniques aux mitochondries, qui sont traditionnellement difficiles d’enquêter sur8, on connaît le mécanisme moléculaire et contrôle de la qualité. Avec le développement de l’analyse de la particule à haute résolution par électron cryo-microscopie (cryo-EM)20, occasions se présentent maintenant d’étudier globalement les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’assembly, l’action et la contrôle de la qualité de l’être humain mitoribosome. Notre rapport de la première structure de l’Assemblée de le mitoribosome humaine intermédiaire fournit la reconnaissance qu’il est possible de visualiser comment la mitoribosome humaine est formé et montre que cryo-EM joue un rôle important dans l’identification de nouvelles trans- l’Assemblée intérimaire facteurs9.
Pour développer cet effort initial, les auteurs décrivent un protocole rapid pour la purification de mitoribosome humaine en détail. Dans la première partie du protocole, un isolement à grande échelle des mitochondries intactes très pures de cellules en suspension est décrite. Cette procédure requiert 9 h et peut être facilement modifiée et adaptée aux échelles et différents types de cellules. Une étape importante dans le présent protocole est l’utilisation de la cavitation d’azote pour briser les cellules. La deuxième partie du protocole a été développée pour purifier les mitoribosomes. Cette procédure requiert 7 h et donne une quantité suffisante de mitoribosomes d’études biochimiques et structurales. Utilisation de mitochondries pures comme matière première offre les derniers préparatifs de haute qualité et peut être extrapolée à d’autres macromolécules mitochondriales.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, supplément de GLUTAMAX, pyruvate</td><td>Thermo Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de sélection de zéocine</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25001</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Freestyle 293 Milieu d’expression</td><td>Thermo Scientific</td><td>12338026</td><td></td></tr><tr><td>T175 Fiole de culture tissulaire avec bouchon ventilé</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.002</td><td></td></tr><tr><td>Fioles agitatrices avec bouchon ventilé</td><td>Thermo Scientific</td><td>4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de bouteilles coniques de 250 ml, stériles</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Eve compteur de cellules automatisé</td><td>NanoEnTek</td><td>E1000</td><td></td></tr><tr><td>Cuve de rupture de cellule de cavitation d’azote</td><td>Parr Instruments</td><td>4635, 4639</td><td>Volume de sécurité : 40 ml, 600 ml respectivement</td></tr><tr><td>Dnase (sans ARN)</td><td>HT Biotechnology</td><td>N401a</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateurs de décelation en téflon/verre</td><td>Cambridge Glassblowing Taille limitée</td><td></td><td>conçue sur demande</td></tr><tr><td>Tubes SW40 pour gradient de mitochondries</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td>Polypropylène, paroi mince</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.2 tubes pour coussin</td><td>Beckman</td><td>343778</td><td>Tubes en polycarbonate, paroi épaisse</td></tr><tr><td>TLS-55 pour gradient</td><td>Beckman</td><td>347356</td><td>Ultra-clear</td></tr><tr><td>Gradient Station IP</td><td>BioComp</td><td>153-002</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation rapide de la mitoribosome de cellules hek

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Les mitochondries humaines possèdent un ensemble dédié des ribosomes (mitoribosomes) qui traduisent les 13 composants de protéine essentielle des complexes de la phosphorylation oxydative codées par le génome mitochondrial. Comme toutes les protéines synthétisées par les mitoribosomes humains sont protéines intégrales de membrane, mitoribosomes humains sont attachés à la membrane interne mitochondriale durant la traduction. Par rapport au ribosome cytosolique du mitoribosome a un coefficient de sédimentation de 55 ans, la moitié du contenu de l’ARNr, aucun ARNr 5 s et 36 autres protéines. Par conséquent, un ratio plus élevé de protéine-à-ARN et une structure atypique font la mitoribosome humaine nettement distincte de son homologue cytosolique.
Malgré l’importance centrale de la mitoribosome à la vie, aucun protocole n’était disponibles pour purifier le complexe intact de lignées cellulaires humaines. Traditionnellement, mitoribosomes ont été isolées de tissus d’origine animales riches en mitochondries qui nécessitait des kilogrammes de matière première. Nous avons pensé que mitochondries en divisant HEK293 dérivées des cellules humaines cultivées dans un milieu riche en nutriments expression auraient une traduction mitochondriale active et, par conséquent, pourraient être une source de matériel pour les études structurales et biochimiques des le mitoribosome. Afin d’étudier sa structure, nous avons développé un protocole pour la purification à grande échelle de mitoribosomes intact de cellules HEK. Ici, nous introduisons azote cavitation de la méthode plus rapide, moins fastidieuse et plus efficace alternative à mécaniques axée sur le cisaillement des méthodes traditionnelles pour la lyse cellulaire. Il en est résulté dans des préparations de la mitoribosome qui a permis à sa détermination de structure à haute résolution, révélant la composition de la mitoribosome humaine intacte et ses intermédiaires de l’Assemblée. Ici, nous suivre sur ce travail et présenter une optimisée et plus rentable, nécessitant seulement 10 ~10 mis en culture des cellules HEK. La méthode peut être employée pour purifier les humain mitoribosomal traduction complexes, des mutants, assemblées de contrôle de la qualité et mitoribosomal sous-unités intermédiaires. La purification peut être linéairement entartrée décuplé si nécessaire et également appliqué à d’autres types de cellules.

Les cellules en division et très viables est un point de départ essentiel pour la purification de mitoribosomes active. Le présent protocole est applicable à toutes les cellules HEK293 suspension. Nous utilisons la lignée de cellules internes T501, qui exprime un transporteur sous contrôle tétracycline-inducible stablement. La lignée parentale est HEK293S-GnTI– cellules (Table des matières)10. Au cours de la croissance cellulaire et l’expansion dans le milieu d’Expression 293 FreeStyle la densité minimale doit être maintenue à 1,5 x 106 cellules/mL, afin de garantir un taux de doublement de tous les deux jours, alors que la densité de cellules de la maximale ne doit pas dépasser environ 5 x 106 cellules / mL. arriver à une densité supérieure à 3 x 106 cellules/mL, les cellules sont granulées et remis en suspension dans un milieu frais, préchauffé dans un volume élargi pour atteindre la densité cellulaire minimal de 1,5 x 106 cellules/mL. Cette séparation est effectuée plusieurs fois tous les 2-3 jours jusqu'à l’obtention d’une masse de la cellule souhaitée pour la procédure. La densité cellulaire finale peut varier de l’ordre de 3 à 4,5 x 106 cellules/mL, et il faut au moins 2 L comme point de départ pour l’isolation des mitochondries. La viabilité cellulaire devrait être généralement maintenue &gt; 90 % et pour la culture finale qui est récoltée &gt; 95 %. Traitement de culture cellulaire à grande échelle avec des antibiotiques n’est pas recommandé.
Après la série de centrifugations différentielles, le volume de la suspension mitochondrial après l’étape 2.2.20 est typiquement de l’ordre de 3 à 5 mL. Les mitochondries sont alors séparés du gradient de saccharose (Figure 1) d’autres organites. Le gradient de saccharose par étapes est préparé tels que le volume du dégradé et le volume de la suspension mitochondrial ensemble remplissent le tube de centrifugation à son volume maximal. Ici, une attention particulière est nécessaire pour recueillir la bande marron, migration vers les 60 % / 32 % s’interfacer avec une contamination minimale dans la zone tampon environnante. Ceci est important afin de maintenir le ratio de protéine constant : détergent à l’étape suivante de la solubilisation de mitochondries. Il est conseillé d’évaluer la concentration de protéines mitochondriales à ce stade, et un rendement typique de 15-20 mg de protéine mitochondriale total est attendu à partir des cellules HEK ~ 1010 cultivés.
Isolement de mitochondries réussie, ils sont lysées par addition d’éther de polyéthylèneglycol octylphényle et mitoribosomes sont séparés par un coussin de saccharose (Figure 2). Pour séparer les mitoribosomes de la substance membraneuse hydrophobe, granulés sont remis en suspension dans le tampon ne contenant ne pas de détergent, et complexes hydrophobes sont granulées par centrifugation. Cette procédure est répétée, et le degré de purification de mitoribosomes est quantifié par A260/A280 ratio, qui devrait atteindre environ 1,3. Rendement typique est de 7 A260 d’un 2 L à partir de la culture. Cette fraction de mitoribosomal contient également supplémentaires grands complexes mitochondries solubles, tels que le pyruvate déshydrogénase et de la glutamate déshydrogénase. Pour séparer les mitoribosomes des complexes solubles mitochondriales, le surnageant est appliqué à un gradient de densité de saccharose. Fractions contenant le mitoribosome sont généralement situées en bas troisième du tube. Le fractionnement du gradient du saccharose alors peut être fait qu’avec un piston automatique ou manuellement en prenant soigneusement des fractions µL 50 avec une pipette ou par le bas du tube de poinçonnage avec une aiguille de 21 G et recueillir les gouttes.
Deux populations de mitoribosomal principales sont identifiées dans le gradient : monosome 55 s et la grande sous-unité S39, comme illustré dans la Figure 3 et Figure 4. La présence de la fraction de la grande sous-unité suggère que les cellules sont récoltées à une démarcation très actif Etat11. Le rapport entre les monosome et les sommets de la grande sous-unité peut changer. Un pic supplémentaire situé plus près vers le bas peut-être apparaître dans les préparations à contaminer les ribosomes cytoplasmiques des années 80. S’il vous plaît note que le gradient de saccharose petit utilisant le balancement seau rotor TLS-55 permet la purification rapide de ~ 1 mL de mitoribosomes à une densité optique de 0,4 à 1 A260. La séparation de la monosome et les sommets de la grande sous-unité peut varier légèrement selon le fractionnement, mais il y a habituellement un chevauchement des deux sommets. Par conséquent, les fractions de recueillir, et piscine devrait être pris en considération afin d’assurer la plus forte proportion de monosome, ou alternativement grande sous-unité, dans l’échantillon. Pour des études de haute résolution cryo-EM, la séparation entre les deux populations de mitoribosomal n’est pas absolument nécessaire (en raison d’autres silico opérations). Toutefois, si meilleure séparation est nécessaire, il est recommandé d’utiliser les plus grands tubes et correspondant de durées de validité.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig1.jpg"> Figure 1 : Purification des mitochondries sur un gradient de saccharose. Organites subcellulaires d’un 2 L à partir de la culture ont été fractionnés par une série de centrifugations différentielles comme décrit dans le protocole, et les mitochondries ont été séparés sur un gradient discontinu de saccharose. Les mitochondries purifiées sont trouvent dans la bande inférieure à l’interface de 32/60 %.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig2.jpg"> Figure 2 : Purification de mitoribosomes sur un coussin de saccharose. Mitoribosomes bruts d’une culture de départ 2 L sont sédimentées par M 1 coussin de saccharose. Les pellets sont remises en suspension dans un tampon sans tensioactifs et mitoribosomes sont clarifiés par deux centrifugations tel que décrit dans le protocole. L’absorbance est enregistré afin d’évaluer la qualité de la préparation et la typique A260/A280 ratio de ~1.3 (panneau de droite) certifie une fraction riche mitoribosome. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig3.jpg"> Figure 3 : Fine purification de mitoribosomes sur un gradient de saccharose. Trace d’absorbance d’un 2 L à partir de la culture. Fractions sont numérotées du haut vers le bas de la pente. Deux mitoribosomal principales populations sont identifiées : grosse sous-unité (max. 1) et monosome de 55 ans (max. 2). Le ratio entre les populations peut-être changer. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig4.jpg"> Figure 4 : Microscopie électronique, les classes 2D et 3D reconstruction. Panneau de gauche : une micrographie avec l’échantillon après avoir culminé à monosome 2 à un grossissement étalonné de 1,23 A / pixel. Panneau milieu : Une post-traitement données représentatives (classes 2D) révélant monosomes intacts. Panneau de droite : reconstruction 3D. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Mitochondries ont spécialisé des ribosomes qui ont divergé de leurs équivalents bactériens et cytoplasmiques. Ici, nous montrons comment mitoribosomes peuvent provenir de leur compartiment natif dans les cellules HEK. La méthode implique l’isolation des mitochondries des cellules en suspension et purification conséquente de mitoribosomes.

Isolation rapide de la Mitoribosome de cellules HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

L’objectif global de cette procédure est de purifier les ribosomes des mitochondries des lignées cellulaires humaines à grande échelle, ce qui est suffisant pour des études structurelles. Cette méthode de purification ribosome mitochondriale permet la caractérisation des complexes de traduction, des mutants, des assemblages de contrôle de la qualité et des intermédiaires sous-unit mitoribosomal. Ceux-ci peuvent être utilisés pour répondre à des questions clés sur la synthèse des protéines dans les mitochondries.Le principal avantage de cette technique est que la cavitation de l’azote est utilisée pour la lyse cellulaire et seulement 10 à 10 cellules de culture sont nécessaires pour préparer des mitoribosomes pour la détermination de la structure à haute résolution. Cette technique peut entraîner la découverte de nouveaux composants des machines de traduction des mitochondries et peut être utilisée pour le développement de nouvelles thérapies pour le traitement du cancer. Après avoir culture des cellules HEK293S selon le protocole du texte, récoltez deux tubes de cellules d’un litre par centrifugation à 1000 fois g et quatre degrés Celsius pendant sept minutes.Décanter soigneusement le supernatant et résuspendre rapidement chaque granulé en 100 millilitres de PBS. Ensuite, mettre les cellules en commun et centrifuger la suspension à 1200 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, après avoir soigneusement décanté le supernatant, peser la pastille.Ensuite, utilisez 120 millilitres de tampon MIB pour le résuspendre et laisser les cellules résuspendues gonfler dans la chambre froide pendant 20 minutes. Transférer les cellules gonflées dans une chambre de cavitation d’azote pré-refroidie sur la glace. Ensuite, ajoutez 45 millilitres de tampon SM4 aux cellules.Attachez la chambre de cavitation d’azote et remplissez-la d’azote jusqu’à ce que la pression atteigne 500 PSI. Ensuite, fermez les robinets et gardez-les sur la glace pendant 20 minutes. La méthode de lyse des cellules de cavitation de l’azote prévient le stress physique externe sur les cellules, évite les dommages causés par la chaleur aux organites et le gaz azoté protège les cellules de l’oxydation.En outre, c’est une méthode hautement reproductible. Relâchez lentement la pression dans la chambre et recueillez le lysate. Ensuite, pour enlever les débris cellulaires et les noyaux, centrifugez le matériau lysé à 800 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Recueillir le supernatant en le versant à travers un morceau plié de tissu de mousseline dans un bécher maintenu sur la glace. Ne jetez pas la pastille. Resuspendez la pastille en 90 millilitres de tampon MiBSM.Ensuite, à l’aide d’un homogénéisateur en verre téflon, homogénéisez l’échantillon et répétez la centrifugation à 800 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Encore une fois, recueillir le surnatant en le versant à travers un morceau plié de tissu de mousseline dans un bécher conservé sur la glace. Ensuite, combinez ce supernatant avec le premier supernatant.Centrifugez l’échantillon à 1000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, recueillir le surnatant comme avant. Après avoir jeté la pastille, centrifugeuse le supernatant contenant des mitochondries brutes à 10 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Lavez soigneusement n’importe quelle pastille lâche sans déranger la partie serrée. Ensuite, utilisez 10 millilitres de tampon MiBSM pour réutiliser la pastille serrée. Ajouter 200 unités de DNase sans RNase à l’échantillon pour éliminer l’ADN génomique et faire pivoter le tube sur un rouleau dans la chambre froide pendant 20 minutes pour digérer uniformément l’échantillon.Centrifugez l’échantillon à 10 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes et utilisez deux millilitres de tampon SEM pour réutiliser la pastille. Chargez toute la suspension mitochondriale sur le dessus du gradient de saccharose. Après avoir fait tourner le gradient selon le protocole de texte, à l’aide d’une pipette de transfert, recueillir soigneusement la bande brune migrant à l’interface de 32% et 60% saccharose.Ce protocole utilise la cavitation de l’azote pour briser les cellules. Une fois maîtrisé, un isolement à grande échelle de mitochondries hautement pures et intactes peut être fait en neuf heures et peut facilement être modifié et adapté pour différents types et échelles cellulaires. Après avoir décongelé les mitochondries gelées sur la glace, ajouter deux volumes de tampon de lyse à trois millilitres de mitochondries.Mélanger immédiatement en inversant le tube plusieurs fois. Utilisez un petit homogénéiseur en verre téflon pour aider à la lyse et incuber l’homogénéate sur la glace pendant cinq à dix minutes pour compléter la réaction. Centrifugeuse le lysate à 30 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour enlever le matériau insoluble.Ensuite, recueillir soigneusement le surnatant et jeter la pastille. Répétez la centrifugation pour assurer la clarification du surnatant. Ensuite, recueillir soigneusement le surnatant et jeter la pastille.Pour chaque millilitre de matériau lysé, préparez un coussin saccharose dans un tube ultra clair TLA-120.2 en ajoutant 0,4 millilitres de coussin saccharose aux tubes. Superposez environ un millilitre de mitochondries lysées sur chaque coussin saccharose, ce qui donne un rapport lysate-coussin de 2,5 pour un. Ensuite, centrifugez l’échantillon dans un rotor TLA-120.2 à 231, 550 fois g et quatre degrés Celsius pendant 45 minutes.Jetez le supernatant et utilisez 100 microlitres du tampon de resuspension pour rincer le tube et enlever le saccharose résiduel. Resuspendez les granulés et combinez-les dans un total de 100 microlitres de tampon de resuspension. Tout en réutilisant la pastille de coussin, il est essentiel d’effectuer sur la glace pour éviter le chauffage de l’échantillon et aussi pour éviter la mousse de l’échantillon afin d’assurer l’intégrité structurale des ribosomes mitochondriaux.Vortex l’échantillon à vitesse lente pendant 30 secondes pour dissoudre les agrégats restants et centrifuger les tubes à 17, 949 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Recueillir soigneusement le supernatant et répéter la centrifugation. Après avoir mesuré l’absorption du mitoribosome à L’A260, chargez l’échantillon entier sur un seul tube linéaire de gradient de saccharose.Centrifugez l’échantillon dans un rotor TLS-55 à 213, 626 fois g et quatre degrés Celsius pendant 120 minutes. Pour fractionner le gradient, perforez le fond du tube et recueillez l’échantillon dans une plaque de 96 puits. La purification du mitoribosome ne devrait pas prendre plus de sept heures pour une quantité suffisante de mitoribosomes.Comme démontré dans ce gradient discontinu de saccharose, les mitochondries purifiées migrent vers la bande inférieure brune à l’interface de 32-60%. Après la séparation des mitoribosomes des complexes mitochondriques solubles sur un gradient de saccharose, deux populations mitoribosomal principales sont identifiées, le monosome 55S et le grand sous-unité 39S. La présence de la grande fraction de sous-unité suggère que les cellules sont récoltées dans un état de division active.Ce panneau montre un micrographe avec l’échantillon du pic monsome deux à un grossissement calibré de 1,23 angstroms par pixel. Voici les données après le traitement initial révélant monosomes intacts. Enfin, une reconstruction 3D monosome est illustrée dans ce panneau.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des mitoribosomes humains intacts pour des études structurelles et biochimiques. Notre protocole offre des préparations finales de haute qualité qui pourraient être extrapolées à d’autres macromolécules mitochondriques.

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La comparaison du potentiel de membrane mitochondriale entre les échantillons fournit des informations précieuses sur l’état cellulaire. Les étapes détaillées de l’isolement des mitochondries et de l’évaluation de la réponse aux inhibiteurs et aux découpleurs à l’aide de la fluorescence sont décrites. La méthode et l’utilité de ce protocole sont illustrées par l’utilisation d’une culture cellulaire et d’un modèle animal de stress cellulaire.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Ici, nous présentons une modification d’une méthode précédemment rapportée qui permet d’isoler des mitochondries purifiées de haute qualité à partir de plus petites quantités de muscle squelettique de souris. Cette procédure aboutit à des mitochondries fortement couplées qui respirent avec une fonction élevée lors des tests respiratoires sur microplaques.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Nous présentons une technique pour stabiliser rapidement les complexes translationnels (biosynthèse des protéines) avec réticulation du formaldéhyde dans les cellules de levures et de mammifères vivantes. L’approche permet de disséquer les intermédiaires transitoires et les interactions dynamiques ARN:protéine. Les complexes réticulés peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que les méthodes de profilage basées sur le séquençage en profondeur, la microscopie et la...

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

Nous présentons un protocole en deux étapes pour l’isolement de mitochondries de haute qualité qui est compatible avec la découverte et la quantification des protéines à l’échelle du protéome. Notre protocole ne nécessite pas de génie génétique et convient donc à l’étude des mitochondries de toutes les cellules et tissus primaires.

Isolement sans marquage en deux étapes des mitochondries pour améliorer la découverte et la quantification des protéines

Les sites de contact mitochondrial sont des complexes protéiques qui interagissent avec les protéines membranaires internes et externes mitochondriales. Ces sites sont essentiels pour la communication entre les membranes mitochondriales et, par conséquent, entre le cytosol et la matrice mitochondriale. Nous décrivons ici une méthode permettant d’identifier les candidats éligibles à cette classe spécifique de protéines.

Une méthode améliorée pour isoler les sites de contact mitochondrial

La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Découvrez une méthode rapide d'isolation des mitoribosomes à partir de cellules HEK humaines utilisant la cavitation à l'azote. Cette technique efficace permet d'obtenir des mitoribosomes de haute qualité pour les études structurales.

Isolation rapide de la Mitoribosome de cellules HEK

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