Name: Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez un modèle cellulaire simplifié pour étudier l'agrégation de l'alpha-synucléine dans les neurones primaires sans purification complexe. Cette méthode permet d'observer la formation d'inclusions et la propagation des agrégats.

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Ce travail a été soutenu par le ministère italien de l’Université et la recherche (MIUR) à travers le programme de subventions de carrière réinsertion (programme RLM pour jeune chercheur) et de la Scuola Normale Superiore. Nous remercions Prof Michael Lee de l’Université du Minnesota, é.-u., pour fournir le αS Prp humain A53T souris Tg, d'où les agrégats sont isolés.

L’utilisation d’animaux WT et Tg a été approuvée et respectée dans leur intégralité par le national et les lois internationales de bien-être animal de laboratoire et d’expérimentation (CEE du Conseil directive 86/609, 12 décembre 1987 et Directive 2010/63/UE, 22 septembre 2010). Tous les protocoles décrits dans cet article suivent les directives de protection des animaux de notre institution.
1. isolement des agrégats αS Microsomes associées à des malades A53T αS Tg souris
<ol><li>Préparer le tampon d’homogénéisation qui est composé de saccharose de 250 mM, 20 mM HEPES, KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl2, 2 mM EDTA et 1 x phosphatase /-inhibiteurs de la protéase. Garder le tampon sur la glace.</li>
	<li>Homogénéiser les frais ou congelés de tissu dans un 01:10 volume (p/v) de tampon d’homogénéisation glacee utilisant un téflon Pilon homogénéisateur, avec 10 à 15 coups.</li>
	<li>Transférer l’homogénat initial (1 à 2 mL) dans un tube de microcentrifuge et centrifuger à 1 000 × g pendant 10 min à 4 ° C à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée afin d’enlever les noyaux et ininterrompu de cellules dans le culot qui en résulte (P1). Jeter le P1.</li>
	<li>Transférer le surnageant (S1) dans un tube de microcentrifuge propre et centrifuger S1 à 10 000 x g pendant 20 min à 4 ° C à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée afin d’obtenir le deuxième surnageant (S10) et le culot (P10). NOTE : P10 est une boulette de membrane brut qui contient des mitochondries et des synaptosomes. Jeter les P10.</li>
	<li>Transférer le surnageant (S10) dans une bouteille de polycarbonate (> 1 mL) et centrifuger S10 à 100 000 × g, pendant 1 h à 4 ° C à l’aide d’une ultracentrifugeuse et un rotor à angle fixe (90 Ti). Remarque : Le surnageant est la fraction pure cytosol tandis que le culot, P100, contient agrégats αS microsomes-associés.</li>
	<li>Resuspendre le culot P100 avec 500 µL de tampon de l’homogénéisation. Transférer P100 dans un tube propre microcentrifuge et centrifuger à 10 000 x g pendant 20 min à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension P100 avec 100 µL de tampon de l’homogénéisation. Remarque : Cette fraction est les agrégats αS microsomes-associés.</li>
	<li>Soniquer échantillons pour 2 s sur la glace [sortie puissance 1 watt (RMS)]. Conserver les échantillons à-80 ° C.</li>
	<li>Le lendemain, déterminer la quantité de protéines en utilisant l’analyse de la BCA.</li>
</ol>2. Western Blot
Remarque : La caractérisation biochimique des agrégats αS associées aux microsomes est évaluée par Western Blot.
<ol><li>Monter un appareil d’électrophorèse verticale à un gel de polyacrylamide de Tris-glycine dégradé 4 à 20 %.</li>
	<li>Charge 1 µg de fractions αS associées aux microsomes, dissous dans la solution tampon dénaturation.</li>
	<li>Dans un autre puits, charger 5 µL de marqueur standard de protéines.</li>
	<li>Exécutez le gel à 100 V en un Tris/glycine/SDS exécutant tampon marqueur protéique jusqu'à la fin du gel.</li>
	<li>Protéines de transfert sur une membrane de nitrocellulose, à l’aide d’un tampon de carbonate basique (10 mM de l’OCNA3, 3 mM NaHCO3, 20 % méthanol) O/N à 4 ° C, à raison de 200 mA, constante.</li>
	<li>Bloquer la membrane avec PBS-non ioniques tensioactif 0,05 % (PBS-T) avec 5 % non-lait écrémé dans un agitateur orbital pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Rincez brièvement, la membrane avec PBS-T.</li>
	<li>Incuber la membrane avec Syn-1 (1:5 000) ou anticorps pSer129-αS (1:5, 000) à 2,5 % non-lait écrémé en PBS-T, O/N à 4 ° C dans un agitateur orbital.</li>
	<li>Laver la membrane pendant 10 min à RT avec PBS-T dans un agitateur orbital.</li>
	<li>Incuber la membrane avec anti-souris ou anti-lapin HRP-conjugués anticorps secondaire (1:3, 000) à 2,5 % non-lait écrémé en PBS-T pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver la membrane pendant 10 min à RT avec PBS-T dans un agitateur orbital. Répéter 3 x.</li>
	<li>Obtenir le signal à travers les kits de chimiluminescence ordinaire.</li>
</ol>3. principales Cultures de neurones
Remarque : Les cultures primaires de neurones ont été préparés de la WT nouveau-né (P0) souris hippocampe ou cortex (ligne C57BL/6). L’ensemble de la procédure, moins les étapes de centrifugation, est effectuée sous une hotte de culture cellulaire, dans des conditions stériles.
<ol><li>Traiter des lamelles couvre-objet (Ø 18 mm) avec la solution d’acide nitrique 65 % pendant au moins 12 h à température ambiante.</li>
	<li>Retirer l’acide nitrique. Rincer deux fois avec du PBS 10 x et plusieurs fois avec de l’eau distillée lamelles couvre-objet.</li>
	<li>Insérer les lamelles couvre-objet en 24 paraboloïdes et enduisez-les avec poly-D-lysine (0,1 mg/mL dans l’eau distillée stérile ou PBS 1 x) pendant 1 h à 37 ° C.</li>
	<li>Enlever poly-D-lysine et laver les lamelles couvre-objet trois fois avec de l’eau distillée. Stocker à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.</li>
	<li>Euthanasier les souriceaux par décapitation et séparer les têtes des corps. Placez les têtes sur la vaisselle et disséquer doucement la peau.</li>
	<li>À l’aide des ciseaux, ouvrir le crâne en faisant une incision à la base du cerveau. Séparer les deux moitiés des crânes et retirez-les avec précaution.</li>
	<li>À l’aide de pinces, pincez les cerveaux des bases et isoler le cortex et l’hippocampe. Transférez-les dans deux plats séparés contenant Balanced Salt Solution (HBSS) un milieu de Hank contenant 1 % pénicilline/streptomycine.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.6 et 3.7 pour chaque animal. Sachez que l’ensemble du processus ne devrait pas prendre plus de 30-45 min.</li>
	<li>Émincer les tissus prélevés et transférez-les dans deux tubes conique de 50 mL (un pour l’hippocampe) et l’autre pour cortex avec 10 mL de milieu HBSS contenant 0,1 % de trypsine. Incuber dans un bain-marie pendant 7 min à 37 ° C. Remarque : Aucune agitation n’est nécessaire.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de DMEM contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 10 µg/mL DNase à l’homogénat pour bloquer l’activité de la trypsine.</li>
	<li>Centrifuger le tissu résultant dissocié à 200 × g pendant 5 min à RT sur une centrifugeuse et éliminer le surnageant. Remarque : Le pellet représente les cellules disséqués par le tissu.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans le milieu de l’électrodéposition, contenant 2 % B27, 2 mM de glutamine, glucose 6 mg/mL, 10 % FBS, 12,5 µM glutamate et la gentamicine 10 µg/mL.</li>
	<li>Plaque dissociée des neurones sur lamelles de poly-D-Lysine dans 24 plaques bien selon le ratio : puits de cortex 1/12 et 1 hippocampe/6 puits, entraînant environ 150 000/200 000 cellules par puits. Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 ° C.</li>
	<li>Le lendemain (jour in vitro, 1 DIV), remplacer le support de placage avec le milieu contenant 2 % B27, 10 gentamicine µg/mL et 2 mM de glutamine.</li>
	<li>DIV 2, enlever 1/3 du milieu et ajouter 1/3 du milieu frais contenant 2,5 µM cytosine arabinoside pendant 48 h afin de réduire la contamination gliale.</li>
	<li>Maintenir les neurones à 37 ° C et remplacer la moitié de la moyenne tous les trois jours.</li>
</ol>4. les neurones traitement
Remarque : Le traitement a été joué dans DIV 7. Toutes les étapes sont exercées sous une hotte de culture de cellules dans des conditions stériles. Un exemple de la densité neuronale corticale de la culture à la DIV 7 est illustré à la Figure 1.
<ol><li>Agrégats αS associées aux microsomes de piscine provenant de la moelle épinière des trois souris Tg malades différentes afin d’avoir un 1 µg/µL de solution, à l’aide de la mémoire tampon d’homogénéisation original pour la dilution.</li>
	<li>Retirez 1/3 du milieu et doucement le remplacer par du milieu frais contenant 2 % B27, 1 x gentamicine et 2 mM de glutamine.</li>
	<li>Ajouter 1 µg d’agrégats communs associés aux microsomes αS dans le milieu cellulaire. Retourner les neurones dans l’incubateur à 37 ° C.</li>
	<li>Tous les 3 jours pendant 1 semaine, ajouter 1/3 du milieu frais. Ne remplacez pas le milieu. Juste l’ajouter.</li>
	<li>Après 1 semaine de traitement, enlever 1/3 du milieu et doucement le remplacer par du milieu frais contenant 2 % B27, 10 gentamicine µg/mL et 2 mM de glutamine. Répéter tous les 3 jours.</li>
	<li>Difficulté les neurones après 2 semaines de traitement (DIV 21).</li>
</ol>5. immunofluorescence
<ol><li>Difficulté des neurones avec paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS 1 x et solution de sucrose de 5 % pendant 15 min à RT sans agitation, en vertu d’un produit chimique des fumées hotte.</li>
	<li>Enlever la solution de fixation. En bref, laver avec du PBS 1 x, 3 fois. Remarque : Effectuez toutes les étapes de lavage doucement car les neurones primaires ne collent pas fermement à lamelles poly-lysine.</li>
	<li>Permeabilize des neurones avec 0,3 % de tensioactifs non ioniques dans du PBS 1 x pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>En bref, laver avec du PBS 1 x, 3 fois.</li>
	<li>Incuber les neurones avec 3 % FBS dans du PBS 1 x pendant 30 min à RT, de bloquer les sites de liaison non-spécifique, dans un agitateur orbital.</li>
	<li>Incuber les neurones avec des anticorps primaire approprié dissous dans 3 % FBS dans du PBS 1 x, O/N à 4 ° C dans un agitateur orbital. NOTE : syn303 (1:1 000), la souris αS (1 : 200), pser129-αS (1:1, 000) et le Tau (01:10, 000) anticorps ont été utilisés.</li>
	<li>Supprimer la solution d’anticorps et de lavage, brièvement, avec du PBS 1 x, 3 fois.</li>
	<li>Incuber les neurones avec des anticorps secondaire fluorescent approprié dissous dans 3 % FBS dans du PBS, pendant 1 h à RT dans l’obscurité dans un agitateur orbital.</li>
	<li>Supprimer la solution d’anticorps et de lavage, brièvement, avec du PBS 1 x, 3 fois.</li>
	<li>Colorer les neurones avec solution DAPI (0,1 µg/mL dans du PBS 1 x) pendant 15 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital.</li>
	<li>Supprimer la solution d’anticorps et de lavage, brièvement, avec du PBS 1 x, 3 fois.</li>
	<li>Monter les lamelles couvre-objet sur une diapositive à l’aide du milieu de montage antifade.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit une méthode pour obtenir formation d’inclusions αS dans les cultures primaires de neurones encéphales de souris WT, grâce à l’ajout des agrégats purifiée αS associées aux microsomes isolés des modèles animaux de αS Tg.
Les étapes critiques du présent protocole sont les suivants : le ratio de µg de microsomes-associated αS agrégats/neurones et la source des agrégats αS. Comme indiqué dans la session de résultats, il est essentiel optimiser le ratio de µg de microsomes-associated αS agrégats/nombre de neurones puisque travaillant dans des conditions sous-optimales peut conduire à la mort prématurée des cellules ou les trop rare agrégation intracellulaire (voir le Section résultats représentatifs). Pour cette raison, il est très important d’évaluer la densité de la culture neuronale à 7 DIV (illustré à la Figure 1) avant de commencer le traitement. En outre, agrégats αS doivent être purifiés de souris de Tg αS malades, c’est à dire. des modèles animaux qui s’accumulent inclusions LB-comme caractérisent par phosphorylées et détergent αS insolubles de fibrilles HMW.
Les modifications éventuelles au présent protocole considèrent le tissu, congelé ou fraîche, les microsomes peuvent être isolés et le montant de départ. Alors que nous avons utilisé des souris SpC de Tg en raison de la forte teneur des agrégats insolubles αS, le protocole est conçu pour isoler les microsomes associées à des agrégats de n’importe quel tissus, pourvu que la région a une teneur élevée en agrégats αS. Les échantillons congelés peuvent également servir comme gel n’affecte pas les étapes de purification des microsomes associées à des agrégats ou des agrégats en soi. Alors que le poids de départ recommandé pour tissus est environ 100-150 mg, ce protocole est convenable pour l’obtention de microsomes d’aussi faibles que 50 mg de matière première (pas de limite de poids maximum). Dans le cas de montant inférieur à 100 mg, cependant, le ratio approprié d’homogénéisation sera 01:20 (p/v) afin d’avoir au moins 1 mL du surnageant S10 à charger sur la bouteille en polycarbonate pour la précipitation ultracentrifugeuse. En fait, chargement des volumes inférieurs à 1 mL peut entraîner l’effondrement de la perte de tube et échantillon. Augmentation du volume d’homogénéisation conduira à un surnageant plus dilué, mais la concentration de la pastille microsomique restera inchangée.
Une limitation du présent protocole concerne l’ensemencement des croix inefficace dans la formation d’inclusions αS qui ont été récemment signalés dans l’administration des litiges de FFP αS d’origine humaine à des cultures de neurones murins par opposition aux souris αS FFP24. Étant donné que la hausse du montant des fibrilles exogène αS donné aux cultures murines peut contourner ce problème, nous vous recommandons de régler finement la quantité de microsomes associées à des agrégats dans le cas de l’administration de fibrilles issues d’autres variantes αS ou d’autre espèces de cultures de neurones de souris que ce que nous avons décrit.
Agrégats αS exogènes ajoutés pour les milieux de culture peuvent être de différentes sources. In vitro αS FFP ont été précédemment utilisés comme modèle de semis d’agrégats αS intracellulaire dans les cultures de cellules, neurones primaires et des modèles animaux3,7,8,15. Par rapport à notre méthode où les agrégats αS associées aux microsomes peuvent être isolés en quelques heures, la formation de FFP est longue et laborieuse, nécessitant plusieurs étapes de purifications, suivies d’essais supplémentaires pour vérifier αS agrégats confomations25 . En outre, FFP étant obtenu de homme exprimés par les bactéries ou les souris αS, c'est-à-dire sans modifications post-traductionnelles typiques des eucaryotes, peuvent présenter des conformations différentes, avec ensemencement sélectif et propriétés pathogènes, conformément à les protocoles de nucléation suivi (p. ex. rubans vs fibrilles)5,8 , conduisant à des conclusions et des résultats différents. Au lieu de cela, l’administration unique de in vivo purifiée αS agrégats garantit la transmission des modèles de pathogènes plus authentiques, imitant étroitement le processus de formation d’inclusions αS dans des modèles animaux et les patients Parkinsoniens.
Comme une application future de cette technique, nous croyons que ce protocole peut être avec succès utilisé pour isoler les graines pathogènes αS le cerveau de patients Parkinsoniens ou autres modèles animaux de la Tg αS, pourvu que les malade zone d'où les microsomes sont isolés sont riches en αS inclusions.
À notre connaissance, c’est la première méthode qui permet la purification des espèces toxiques indigènes de αS en vivo modèles PD pour servir de modèle pour obtenir la formation d’inclusions αS dans des neurones primaires de l’ensemencement.
Nous croyons que cette méthode est extrêmement polyvalente et peut fournir un modèle exceptionnel à base de cellules pour étudier les différents aspects de l’agrégation αS et son influence sur la physiopathologie de la cellule. Parce que la formation d’inclusions αS représentent un processus complexe qui a été difficile de reproduire dans les cellules cultivées, nous avons bon espoir que ce modèle offrira de grandes intuitions dans les mécanismes pathogéniques aiguës, difficiles à identifier dans les chroniques et plus élaborées les systèmes sont telles que les modèles animaux.

L’accumulation d’alpha-synucléine (αS) inclusions protéiques est une caractéristique importante et importante de Parkinson Disease (DP) et alpha-synulceinopathies1. Malheureusement, alors que les modèles animaux sont capables de fournir un environnement cellulaire et biochimique suffisant pour induire les étapes d’agrégation nécessaires pour la formation des fibrilles de protéine2, reproduisant la formation de corps de Lewy complexes (LB)-comme des agrégats dans des cultures cellulaires sont difficile et exigeante.
Nous décrivons ici une méthode pour induire la formation d’inclusions αS, semblables aux agrégats de protéines obtenus dans des modèles animaux et les patients Parkinsoniens, dans des cellules cultivées, à l’aide de neurones primaires de souris cerveau isolé. Notre protocole est basé sur l’administration exogène d’agrégats αS associées aux microsomes isolés de αS symptomatique transgéniques (Tg) souris à souris hippocampe ou cortical neurones primaires. Cette méthode tire parti de la capacité de diffusion et de propagation des αS espèces toxiques qui, une fois ajoutée au milieu de culture, sont capables de devenir intériorisé et induisent la formation de mature αS séropositifs agrégats3,4, 5,6,7,8.
A l’origine, les méthodes standard pour obtenir la formation de fibrilles αS dans des cultures cellulaires reposaient sur la surexpression de l’ADNc αS correspondant via les protocoles de transfection régulière ou infection virale véhiculée par9. Alors que dans le premier cas obtenir αS LB-comme agrégats ont été fortuites, a montré une efficacité faible et dépend du type de cellule, le deuxième protocole a conduit à la formation de fibrilles insolubles, y compris les espèces de poids moléculaire élevé (HMW) en 24-48 h de l’infection 10. dans ces méthodes, la formation d’agrégats est probablement due à une excessive et asymétrique en quantité de protéines αS qui devient insoluble plutôt qu’une conversion pathologique de la conformation αS qui dicte l’agrégation. Au lieu de cela, la technique que nous présentons ici ne modifie pas le niveau d’expression αS mais provoque l’agrégation des protéines très répandue en raison de l’internalisation des fibrilles exogènes. En outre, la formation d’agrégats αS en administrant des fibrilles exogènes est un long processus qui nécessite des jours ou des semaines pour devenir exhaustive nous permettant d’étudier les étapes intermédiaires et début de la formation d’inclusions αS dans un mode Time-lapse et pour elle en corrélation avec les changements biochimiques cellulaires. Ainsi, notre méthode est une application utile pour créer des modèles d’agrégation αS cellulaires qui sont utiles pour étudier la formation de fibrilles αS au microscope en ce qui concerne la physiopathologie cellulaire.
En outre bien qu’administration de cerveau brut extrait de souris transgéniques (Tg) malades αS11,12 ou humaine PD cerveaux6,13 est capable d’induire des dépôts αS Tg ou animaux de type sauvage (WT), application de la même façon pour les cultures de cellules n’a pas été prouvé d’être aussi franc succès, peut-être à cause de la faible quantité de granulats dans les échantillons utilisés et l’absence d’une procédure standard pour isoler αS native espèces toxiques14. Pour cette raison, en vitro préformé fibrilles (FFP) de αS ont été la source d’agrégats de choix jusqu'à maintenant pour l’induction des inclusions αS dans les cellules et modèles animaux3,4,6,7 ,15,16. Avec notre protocole, cependant, nous montrent que les espèces agrégées αS associées aux microsomes isolés de souris Tg αS peuvent induire efficacement accumulation intracellulaire inclusions de αS LB-comme dans des neurones primaires.
Dans notre laboratoire, les agrégés espèces associées aux microsomes αS sont isolés du tissu médullaire (SpC) des souris malades Tg exprimant le gène humain de αS A53T sous le contrôle du promoteur souris prion (PrP) de protéines [Prp humain A53T αS Tg souris, ligne G2-3,17]. Ces souris montrent un phénotype de neurodegenerative âge-dépendante qui inclut dysfonctionnement moteur robuste et formation d’inclusions dans le système nerveux central fait de phosphorylée, ubiquitinées et αS insoluble, commençant après 9 mois d’âge. Une fois que le dysfonctionnement moteur apparaît, le phénotype évolue rapidement dans la paralysie, à partir des membres postérieurs, qui mène à la mort en 2 à 3 semaines. Accumulation des agrégats αS parallels manifestation de la maladie. Souris sacrifiées à l’apparition du dysfonctionnement moteur présentent une agrégation αS robuste dans le CPS, le tronc cérébral et le cervelet. Il n’y a pas besoin d’attendre jusqu'à ce que la paralysie affecte à sacrifier la souris. Présymptomatiques souris sont prises à 9 mois-vieux animaux qui n’affichent pas de troubles moteurs.

<table><tbody><tr><td>Saccharose&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>1M pH=7-7,6</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0390-100ml</td><td>pH=8 0,5M</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>NAHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-6X1L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>PhosStop&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>inhibiteur de la phosphatase</td></tr><tr><td>BCA Kit de dosage des protéines</td><td>Euroclone</td><td>EMPO14500</td><td></td></tr><tr><td>Criterion TGX 4-20 % sans tache, 18 puits</td><td>Biorad</td><td>5678094</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique soutenue&nbsp ;</td><td>Biorad</td><td>1620097</td><td>0.2 &mu ; m</td></tr><tr><td>Bloqueur de qualité buvard&nbsp ;</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>Lait écrémé en poudre</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrat chimiluminescent</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Acide nitrique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004411000</td><td>65 %</td></tr> <tr><td>Couvre-glaces&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>1014355118NR1</td><td>18 mm x&nbsp ;</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hank</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>14170-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10 000 U/mL, 100 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>D5796-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td>0,50</td></tr> % <tr><td>Supplément B27&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>35050-038</td><td>100x</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Euroclone</td><td>EC50182L</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1446600-1G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>15710</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine arabinoside (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage anti-effacement VECTASHIELD&nbsp ;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>90 Ti rotor</td><td>Beckman</td><td>N/A</td><td>Rotor d’ultracentrifugeuse</td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 anticorps, clone 42&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td>anti-souris WB : anticorps 1:5000</td></tr><tr><td>Syn303</td><td>BioLegend</td><td>824301</td><td>anti-souris IF : anticorps Tau 1:1000</td></tr><tr><td></td><td>Systèmes synaptiques</td><td>314 002</td><td>anti-lapin IF : 1:10 000</td></tr><tr><td>pser129-&alpha ; Anticorps S&nbsp ;</td><td>Un cadeau de Fujiwara et al, référence 19</td><td></td><td>anti-lapin WB : 1:5000</td></tr><tr><td>pser129-&alpha ; S anticorps</td><td></td><td>Abcam ab51253</td><td>anti-lapin IF : 1:1000</td></tr><tr><td>Souris & alpha ; S (D37A6) XP&nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4179</td><td>anti-lapin IF 1:200</td></tr><tr><td>Alexa fluor 555-anticorps anti-lapin conjugué&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>A27039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-anticorps anti-souris conjugué&nbsp ;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Microson XL-2000&nbsp ;</td>Sonicateur <td>Misonix</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assemblage, Bouchon Noryl, Service scientifique de type Beckman</td><td>EU</td><td>S4484</td><td>Tubes ultracentrifuges</td></tr><tr><td>AXIO Observer Microscope à lumière inversée&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>N/D</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2 microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence inversée&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>Tensioactif non ionique&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

administration exogène d’alpha-synucléine microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la formation de fibrilles

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Pendant des années, l’incapacité de reproduire la formation d’inclusions insoluble alpha-synucléine (αS) dans des cultures cellulaires a été une grande limitation dans l’étude d’agrégation αS dans la maladie de Parkinson (MP). Récemment, le développement de nouveaux modèles animaux par le biais de l’inoculation exogène d’extraits de cerveau de souris transgéniques αS malades ou patients Parkinsoniens a donné de nouveaux espoirs à la possibilité de créer des modèles de cellules plus adéquats d’agrégation αS. Malheureusement, quand il s’agit de cellules en culture, administration d’extraits de cerveau raw n’a pas prouvé aussi bons souris et la source de choix d’agrégats exogènes est encore in vitro préformées des fibrilles αS.
Nous avons développé une méthode pour induire la formation d’inclusions intracellulaires αS dans des neurones primaires par l’intermédiaire de l’administration exogène d’agrégats native αS associées aux microsomes, une espèce hautement toxiques αS isolée des zones malades de souris transgéniques. Cette fraction des agrégats αS qui est associée avec les vésicules de microsomes, est internalisé efficacement et induit la formation d’inclusions intracellulaires positives pour αS agrégées et phosphorylée. Par rapport à in vitro-fibrilles préformées qui sont fabriqués à partir de recombinant αS, notre méthode est plus rapide et garantit que l’ensemencement pathogène est faite avec des agrégats αS authentique extraites des modèles animaux malades du Parkinson, imitant plus étroitement du type de inclusions obtient in vivo. En conséquence, la disponibilité des tissus riches en inclusions αS est obligatoire.
Nous croyons que cette méthode fournira un modèle polyvalent à base de cellules afin d’étudier les aspects microscopiques de αS agrégation et le connexe physiopathologie cellulaire in vivo et qu’il sera un point de départ pour la création d’une cellule plus précise et sophistiquée paradigme de PD.

Suivant le protocole décrit ci-dessus et résumées dans la Figure 2, nous avons purifié agrégats αS associées aux microsomes de trois malades A53T les souris αS Tg (Figure 3). Les microsomes sont des fractions de pellet membranaire brute qui contiennent le réticulum endoplasmique, appareil de Golgi et petites vésicules synaptiques. Le degré de pureté de la pastille microsomique par rapport aux autres fractions a été évalué précédemment à l’aide de marqueurs organite spécifique18.
Une fois isolés, caractérisation biochimique des agrégats αS est évaluée au moyen de dénaturant SDS-Page, suivie d’une incubation avec Syn-1 ou αS phosphorylés à sérine 129 (pSer129-αS) anticorps. Comparativement à présymptomatique (PreS) et appariés selon l’âge des souris-Tg (nTg), microsomes isolés de souris malades précipité Co avec des agrégats αS. Les espèces associées aux microsomes αS montrent les caractéristiques typiques des agrégats αS, tels que l’accumulation des espèces résistant aux détergents HMW, phosphorylation de sérine 12919 et C-N-terminal écimée fragments (pour une caractérisation complète de agrégats de microsomes-associated αS voir référence18,20,21). Ce sont des exigences fondamentales car αS monomère ne pas obtenir efficacement internalisé et n’induit pas de αS dépôt7,15,22. Il est important de ne pas utiliser n’importe quel détergent (ionique ou non ioniques) pour remettre en suspension les granulés P100 puisqu’il peut être nocif pour les cellules. Aussi, afin d’éviter la variabilité de l’échantillon, agrégats αS associées aux microsomes de trois différentes souris malades vont être regroupés pour traitement neuronal.
Administration de 1 µg d’agrégats communs associés aux microsomes αS des malades A53T souris au milieu de culture de neurones corticaux ou hippocampe induit la formation d’une dépendant du temps des inclusions αS, positives pour les anticorps αS agrégats spécifiques tels que Syn303 (Figure 4, 5) ou pser129-αS (Figure 5). Après deux jours (2d) de ces agrégats apparaissent comme des punctums petits, épars qui deviendront plus abondantes aux périodes ultérieures de traitement. Après deux semaines, inclusions αS ressemblent à longs et mûrissent structures ressemblant à des perles, largement répartis dans les cultures de neurones, suivant un modèle de neurites et partiellement co localisation avec présynaptique et marqueurs de neurites (Figure 5). Occasionnellement, αS nouvellement formé des inclusions sont visibles à localiser conjointement et tacher le soma de cellule ou couvrir l’ensemble du processus, ressemblant à des neurites nécrotiques.
Bien qu’associés aux microsomes αS agrégats fractions peuvent se propager efficacement dans les cultures de neurones, leur montant doit être finement réglé pour le nombre de neurones plaqué (Figure 1). Dépassant en fait, le ratio recommandé, µg de microsomes associées à des agrégats : nombre de neurones, va entraîner la mort prématurée des cellules dans les prochains jours (Figure 6), alors qu’une quantité insuffisante d’agrégats associées aux microsomes αS conduira à une rare et réduit nombre d’inclusions après deux semaines de traitement, similaire à ce qui a été obtenue aux périodes précédentes (Figure 4A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig1.jpg"> Figure 1 . Cultures de neurones corticaux. L’image représentative de densité DIV 7 des cultures de neurones corticaux. Des images ont été prises avec un microscope inversé léger, objectif 10 X. Echelle = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig2.jpg"> Figure 2 . Isolement des microsomes-associated αS agrège de souris SpC. Organigramme du protocole de purification des agrégats αS associées aux microsomes de SpC de souris malades. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig3.jpg"> Figure 3 . Isolement des fractions de microsomes de malades, présymptomatiques A53T αS Tg nTg souris et. Affichage de l’analyse par transfert Western purifiée agrégats αS associées aux microsomes isolés de trois malades (malade), présymptomatiques (PreS) et des souris nTg appariés selon l’âge. Les souris malades sont souris de Tg αS A53T qui montrent le dysfonctionnement moteur et neurologique, y compris l’accumulation des inclusions αS, tandis que présymptomatique animaux est en bonne santé A53T αS Tgs de 9 mois d’âge qui ne présentent pas encore de toute pathologie αS associés phénotype. nTg souris sont ceux des souris malades qui ne portent pas le transgène αS et donc ne se développent pas αS induits par la pathologie. 1 µg de chaque fractions purifiées ont été exécutées sur un dénaturant SDS-Page, transféré sur une membrane de nitrocellulose et effacé avec Syn-1 ou pSer129-αS anticorps. Seulement des fractions de microsomes isolement de souris malades des agrégats de détersif-résistante αS HMW confinées phosphorylés à sérine 129 et a montré C- et N-terminale troncation. Ce chiffre a été adapté de Colla et al. 18. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig4.jpg"> Figure 4 . Induction dépendant du temps des dépôts αS après administration d’agrégats αS microsomes-associés. (A) Immunofluorescence des neurones de l’hippocampe primaires traités avec 1 µg de microsomes-associated αS agrège les fractions regroupées à partir de trois différentes de souris malades. Les neurones ont été fixés à 2 jours (2d), 1 semaine (1w) ou 2 semaines (2w) de traitement et immunomarquage avec syn303 (S303, 1/1000), un anticorps spécifique pour oxydé et agrégées αS. Les cellules étaient Eosine au DAPI. Images confocales ont été prises à l’aide d’un laser scanning microscope confocal, 63 X, objectif. Echelle = 50 µm. (B) analyse Quantitative de la ﬂuorescence totale, après soustraction du fond, a été fait en utilisant le plugin de comptage de particules du logiciel Image J. Les valeurs ont été normalisées pour le nombre de noyaux par champ (DAPI count) et exprimées en pourcentage du signal de fluorescence S303 à 2D. Les valeurs sont indiquées comme la moyenne ± écart-type (n = 5). ** p &lt; 0,001, *** p &lt; 0,00001, unidirectionnel ANOVA, suivie de LSD posteriori Fisher. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig5.jpg"> Figure 5 . Des inclusions intracellulaires αS sont colocalisées avec réseau cortical neurites. Images confocales représentatifs des neurones corticaux traitement avec agrégats αS associées aux microsomes provenant de souris malades de Tg. Après que 2 semaines de neurones de traitement étaient fixes et double colorées avec des anticorps spécifiques agrégats [S303 (A, B) ou pser129-αS, 1 : 1 000 (C)] et marqueurs neurites [souris αS, 1 : 200 (A, B) ou Tau, 1/10 000 (C)]. Co, étiquetage des signaux fluorescents démontré co-localisation partielle des structures ressemblant à des perles αS nouvellement formé avec le réseau des neurites. Parfois des inclusions αS s’accumulent dans le soma neuronal (A, B, pointes de flèches). Images superposées ont été acquises avec un laser scanning microscope confocal, 63 X, objectif. Echelle = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par Colla et al. 20. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig6.jpg"> Figure 6 . Addition d’une quantité sous-optimal des agrégats αS associées aux microsomes est toxique pour les neurones. Coloration DAPI des neurones traités avec augmentation de la concentration des agrégats associées aux microsomes αS mène à la mort cellulaire. (A) les neurones corticaux ont été traités avec 1, 2 µg d’agrégats associées aux microsomes αS extraite de souris malades ou tampon seul qui ne contient-elle pas d’agrégats (B) et colorées au DAPI. Les images fluorescentes ont été acquises avec un microscope épifluorescente en utilisant un objectif 20 X. Echelle = 100 µm.()B) cellules DAPI-positives ont été dénombrées à l’aide du logiciel Image J. Le graphique montre une réduction du nombre des noyaux avec augmentation de la concentration des agrégats associées aux microsomes αS ajouté aux médias neuronales. Les valeurs sont exprimées en % de b et sont donnés comme la moyenne ± écart-type (n = 5), *** p &lt; 0,0001, unidirectionnel ANOVA, suivie de LSD posteriori Fisher. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Le but du présent protocole est de fournir un système de base de cellules qui réplique la formation d’alpha-synucléine aggregates in vivo. Des inclusions intracellulaires alpha-synucléine sont ensemencées dans des neurones primaires par l’internalisation et propagation d’exogène administrée natif associées aux microsomes alpha-synucléine agrégats isolés de souris transgénique alpha-synucléine malades.

Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’alpha-synucléine, telles que l’élucidation du mécanisme de propagation de l’agrégation et la toxicité de l’alpha-synucléine in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas la purification fastidieuse des fibrilles préformées d’alpha-synucléine. Lucia Rota, une étudiante diplômée du laboratoire COLA, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer la procédure, préparez le tampon d’homogénéisation et conservez-le sur de la glace. Ensuite, homogénéisez le tissu frais ou congelé dans un volume de un à 10 volumes de tampon d’homogénéisation glacé à l’aide d’un homogénéisateur à pilon en téflon avec 10 à 15 passages. Ensuite, transférez tout l’homogénat initial dans un tube de microcentrifugation et centrifugez à 1 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin d’éliminer les noyaux et les cellules intactes de la pastille résultante.Par la suite, jetez la pastille de résultat. Ensuite, transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre et centrifugez-le à 10 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée afin d’obtenir le deuxième surnageant et la pastille. Transférez ensuite ce surnageant dans une bouteille en polycarbonate et centrifugez-le à 100 000 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius à l’aide d’une ultracentrifugeuse et d’un rotor à angle fixe.Remettre en suspension la pastille de brut P100 avec 500 microlitres de tampon d’homogénéisation. Transférez la pastille de brut P100 dans un tube de microcentrifugation propre et centrifugez-la à 10 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse réfrigérée. Après 20 minutes, jetez le surnageant et remettez en suspension P100 avec 100 microlitres de tampon d’homogénéisation.Ensuite, sonisez l’échantillon pendant deux secondes sur de la glace et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour effectuer le Western Blot, couler un gel de polyacrylamide tris-glycine à gradient de quatre à 20 % sur un appareil d’électrophorèse vertical. Dissoudre un microgramme de fractions d’alpha-synucléine associées aux microsomes dans le tampon d’échantillon dénaturant et le charger sur le gel.Dans un autre puits, chargez cinq microlitres de marqueur protéique. Faites fonctionner le gel à 100 volts dans un tampon de tris-glycine SDS jusqu’à ce que le marqueur protéique atteigne la fin du gel. Ensuite, transférez les protéines dans une membrane de nitrocellulose à l’aide d’un tampon carbonaté basique.Conservez l’échantillon toute la nuit dans la chambre froide avec une puissance constante réglée à 200 milliampères. Le lendemain, bloquez la membrane avec du PBS-T avec 5 % de lait écrémé en poudre sur un agitateur orbital pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, rincez brièvement la membrane avec du PBS-T.Incuber la membrane avec SIN-1 à un à 5 000, ou l’anticorps alpha-synucléine P-Ser129 à un à 5 000 dans du lait écrémé en poudre à 2,5 % dans du PBS-T pendant la nuit dans la chambre froide ou au réfrigérateur à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital. Le lendemain, lavez la membrane pendant 10 minutes à température ambiante avec du PBS-T sur un agitateur orbital. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué HRP anti-souris ou anti-lapin à raison de un à 3 000 dans du lait écrémé en poudre à 2,5 % dans du PBS-T pendant une heure à température ambiante sur un agitateur orbital.Ensuite, lavez la membrane pendant 10 minutes à température ambiante avec du PBS-T sur un agitateur orbital pendant trois fois. Obtenez le signal à travers le kit de chimiluminescence régulier. Pour traiter les neurones, extrayez les agrégats d’alpha-synucléine associés aux microsomes obtenus à partir de la moelle épinière de trois souris transgéniques malades différentes afin d’obtenir une solution d’un microgramme par microlitre diluée avec le tampon d’homogénéisation d’origine.Ensuite, retirez un tiers du milieu et remplacez-le doucement par un milieu de neurones frais. Ajoutez un microgramme d’agrégats alpha-s associés à des microsomes regroupés dans le milieu cellulaire. Renvoyez les neurones dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.Ajoutez un tiers du milieu frais à l’échantillon sans remplacer le milieu une fois tous les trois jours pendant une semaine. Après une semaine de traitement, prélevez un tiers du milieu et remplacez-le doucement par un milieu frais contenant 2 % de B27, 10 microgrammes par millilitre de gentamicine et deux millimolaires de glutamine. Répétez l’opération tous les trois jours pendant une semaine avant de réparer les cellules.Pour effectuer l’immunofluorescence, dans une hotte chimique, fixez les neurones avec 2 % de paraformaldéhyde et PBS dans une solution de saccharose à 5 % pendant 15 minutes à température ambiante sans agiter. Après 15 minutes, retirez la solution fixatrice et lavez brièvement les neurones avec du PBS trois fois. Ensuite, perméabilisez les neurones avec 0,3 % de surfactine non ionique dans le PBS pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, lavez brièvement les neurones avec PBS trois fois. Incuber les neurones avec 3 %FBS et PBS pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Ensuite, incubez les neurones avec l’anticorps primaire approprié dissous dans 3 % FBS et PBS pendant la nuit dans la chambre froide ou au réfrigérateur pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital.Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et lavez brièvement les cellules avec du PBS pendant trois fois. Ensuite, incubez les neurones avec l’anticorps secondaire fluorescent approprié dissous dans 3 % FBS et PBS pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité sur un agitateur orbitaire. Retirez la solution d’anticorps et lavez-la brièvement avec du PBS pendant trois fois.Ensuite, colorez les neurones avec une solution de DAPI pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité sur un agitateur orbital. Après 15 minutes, retirez la solution d’anticorps et lavez-la brièvement avec du PBS pendant trois fois. Montez les lamelles sur la glissière à l’aide d’un support de montage anti-décoloration.Dans cette étude, l’administration d’un microgramme d’agrégats d’alpha-synucléine associés à des microsomes regroupés de souris transgéniques A53T malades dans le milieu de culture de neurones corticaux ou hippocampiques induit une formation dépendante du temps d’inclusions d’alpha-synucléine, positive pour les anticorps alpha-synucléine spécifiques aux agrégats. Après deux jours de traitement, ces agrégats apparaissent sous forme de petits points épars qui deviendront plus abondants à des moments ultérieurs. Après deux semaines, les inclusions d’alpha-synucléine ressemblent à des structures longues et matures ressemblant à des perles fortement réparties dans les cultures neuronales suivant un modèle de neurites et colocalisant partiellement avec des marqueurs présynaptiques et neurites.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’ajuster le rapport entre les microgrammes d’agrégats d’alpha-synucléine associés aux microsomes et la densité des neurones en plaques et d’isoler les agrégats d’alpha-synucléine associés aux microsomes des tissus riches en inclusions d’alpha-synucléine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les agrégats d’alpha-synucléine associés aux microsomes de souris transgéniques malades, à utiliser comme traitement des neurones primaires pour induire la formation d’inclusions d’alpha-synucléine.

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Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

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