Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’alpha-synucléine, telles que l’élucidation du mécanisme de propagation de l’agrégation et la toxicité de l’alpha-synucléine in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas la purification fastidieuse des fibrilles préformées d’alpha-synucléine. Lucia Rota, une étudiante diplômée du laboratoire COLA, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer la procédure, préparez le tampon d’homogénéisation et conservez-le sur de la glace. Ensuite, homogénéisez le tissu frais ou congelé dans un volume de un à 10 volumes de tampon d’homogénéisation glacé à l’aide d’un homogénéisateur à pilon en téflon avec 10 à 15 passages. Ensuite, transférez tout l’homogénat initial dans un tube de microcentrifugation et centrifugez à 1 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin d’éliminer les noyaux et les cellules intactes de la pastille résultante.

Par la suite, jetez la pastille de résultat. Ensuite, transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre et centrifugez-le à 10 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée afin d’obtenir le deuxième surnageant et la pastille. Transférez ensuite ce surnageant dans une bouteille en polycarbonate et centrifugez-le à 100 000 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius à l’aide d’une ultracentrifugeuse et d’un rotor à angle fixe.

Remettre en suspension la pastille de brut P100 avec 500 microlitres de tampon d’homogénéisation. Transférez la pastille de brut P100 dans un tube de microcentrifugation propre et centrifugez-la à 10 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse réfrigérée. Après 20 minutes, jetez le surnageant et remettez en suspension P100 avec 100 microlitres de tampon d’homogénéisation.

Ensuite, sonisez l’échantillon pendant deux secondes sur de la glace et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour effectuer le Western Blot, couler un gel de polyacrylamide tris-glycine à gradient de quatre à 20 % sur un appareil d’électrophorèse vertical. Dissoudre un microgramme de fractions d’alpha-synucléine associées aux microsomes dans le tampon d’échantillon dénaturant et le charger sur le gel.

Dans un autre puits, chargez cinq microlitres de marqueur protéique. Faites fonctionner le gel à 100 volts dans un tampon de tris-glycine SDS jusqu’à ce que le marqueur protéique atteigne la fin du gel. Ensuite, transférez les protéines dans une membrane de nitrocellulose à l’aide d’un tampon carbonaté basique.

Conservez l’échantillon toute la nuit dans la chambre froide avec une puissance constante réglée à 200 milliampères. Le lendemain, bloquez la membrane avec du PBS-T avec 5 % de lait écrémé en poudre sur un agitateur orbital pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, rincez brièvement la membrane avec du PBS-T.

Incuber la membrane avec SIN-1 à un à 5 000, ou l’anticorps alpha-synucléine P-Ser129 à un à 5 000 dans du lait écrémé en poudre à 2,5 % dans du PBS-T pendant la nuit dans la chambre froide ou au réfrigérateur à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital. Le lendemain, lavez la membrane pendant 10 minutes à température ambiante avec du PBS-T sur un agitateur orbital. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué HRP anti-souris ou anti-lapin à raison de un à 3 000 dans du lait écrémé en poudre à 2,5 % dans du PBS-T pendant une heure à température ambiante sur un agitateur orbital.

Ensuite, lavez la membrane pendant 10 minutes à température ambiante avec du PBS-T sur un agitateur orbital pendant trois fois. Obtenez le signal à travers le kit de chimiluminescence régulier. Pour traiter les neurones, extrayez les agrégats d’alpha-synucléine associés aux microsomes obtenus à partir de la moelle épinière de trois souris transgéniques malades différentes afin d’obtenir une solution d’un microgramme par microlitre diluée avec le tampon d’homogénéisation d’origine.

Ensuite, retirez un tiers du milieu et remplacez-le doucement par un milieu de neurones frais. Ajoutez un microgramme d’agrégats alpha-s associés à des microsomes regroupés dans le milieu cellulaire. Renvoyez les neurones dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Ajoutez un tiers du milieu frais à l’échantillon sans remplacer le milieu une fois tous les trois jours pendant une semaine. Après une semaine de traitement, prélevez un tiers du milieu et remplacez-le doucement par un milieu frais contenant 2 % de B27, 10 microgrammes par millilitre de gentamicine et deux millimolaires de glutamine. Répétez l’opération tous les trois jours pendant une semaine avant de réparer les cellules.

Pour effectuer l’immunofluorescence, dans une hotte chimique, fixez les neurones avec 2 % de paraformaldéhyde et PBS dans une solution de saccharose à 5 % pendant 15 minutes à température ambiante sans agiter. Après 15 minutes, retirez la solution fixatrice et lavez brièvement les neurones avec du PBS trois fois. Ensuite, perméabilisez les neurones avec 0,3 % de surfactine non ionique dans le PBS pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez brièvement les neurones avec PBS trois fois. Incuber les neurones avec 3 %FBS et PBS pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Ensuite, incubez les neurones avec l’anticorps primaire approprié dissous dans 3 % FBS et PBS pendant la nuit dans la chambre froide ou au réfrigérateur pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital.

Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et lavez brièvement les cellules avec du PBS pendant trois fois. Ensuite, incubez les neurones avec l’anticorps secondaire fluorescent approprié dissous dans 3 % FBS et PBS pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité sur un agitateur orbitaire. Retirez la solution d’anticorps et lavez-la brièvement avec du PBS pendant trois fois.

Ensuite, colorez les neurones avec une solution de DAPI pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité sur un agitateur orbital. Après 15 minutes, retirez la solution d’anticorps et lavez-la brièvement avec du PBS pendant trois fois. Montez les lamelles sur la glissière à l’aide d’un support de montage anti-décoloration.

Dans cette étude, l’administration d’un microgramme d’agrégats d’alpha-synucléine associés à des microsomes regroupés de souris transgéniques A53T malades dans le milieu de culture de neurones corticaux ou hippocampiques induit une formation dépendante du temps d’inclusions d’alpha-synucléine, positive pour les anticorps alpha-synucléine spécifiques aux agrégats. Après deux jours de traitement, ces agrégats apparaissent sous forme de petits points épars qui deviendront plus abondants à des moments ultérieurs. Après deux semaines, les inclusions d’alpha-synucléine ressemblent à des structures longues et matures ressemblant à des perles fortement réparties dans les cultures neuronales suivant un modèle de neurites et colocalisant partiellement avec des marqueurs présynaptiques et neurites.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’ajuster le rapport entre les microgrammes d’agrégats d’alpha-synucléine associés aux microsomes et la densité des neurones en plaques et d’isoler les agrégats d’alpha-synucléine associés aux microsomes des tissus riches en inclusions d’alpha-synucléine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les agrégats d’alpha-synucléine associés aux microsomes de souris transgéniques malades, à utiliser comme traitement des neurones primaires pour induire la formation d’inclusions d’alpha-synucléine.