Production et la visualisation des sphéroplastes bactériennes et de protoplastes de caractériser Peptide antimicrobien localisation

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des peptides antimicrobiens : est-ce que les peptides se localisent ou se translocalisent à travers la membrane cellulaire. L’utilisation de sphéroplastes et de protoplastes permet de visualiser et d’analyser la localisation des peptides dans un système modèle physiologiquement pertinent sans les problèmes de résolution rencontrés avec l’imagerie cellulaire bactérienne. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les peptides antimicrobiens, elle peut également être appliquée à d’autres agents actifs membranaires tels que les peptides pénétrant dans les cellules.

Les sphéroplastes à Gram négatif d’E. coli et les protoplastes à Gram positif à B. megaterium doivent être préparés dans une enceinte de sécurité biologique ou une hotte à flux laminaire en utilisant une technique stérile appropriée. Si vous le souhaitez, les souches bactériennes peuvent contenir un plasmide résistant aux antibiotiques, et les sphéroplastes et protoplastes peuvent être préparés sur une paillasse de laboratoire ouverte. Dans cette vidéo, des sphéroplastes et des protoplastes sont préparés sur une paillasse de laboratoire ouvert à l’aide de souches bactériennes résistantes aux antibiotiques.

Pour mettre en place une culture de nuit, utilisez une pointe de micropipette stérile pour transférer une seule colonie bactérienne d’une plaque de culture de gélose solide dans un tube de culture de 14 millilitres, contenant deux à trois millilitres de bouillon de soja à trois pour cent de trypticase, TSB, pour une incubation de 16 à 21 heures à 37 degrés Celsius avec agitation. Pour préparer des sphéroplastes à E. coli à Gram négatif, diluez la culture de nuit dans un rapport de un à 100, et 25 millilitres de TSB dans une fiole de 250 millilitres, et retournez les bactéries dans l’incubateur en secouant pendant encore 2,5 heures. Lorsque la solution a atteint une densité optique de 0,5 à 0,8 à 600 nanomètres, diluer la culture dans un rapport de un à dix dans du TSB frais dans un nouveau ballon de 250 millilitres pour une deuxième incubation de 2,5 heures avec une concentration effective finale de 60 microgrammes par millilitre de céphalexine.

Pour produire des filaments unicellulaires d’environ 50 à 150 micromètres de longueur, tels que visualisés au microscope optique à un grossissement de 1000x. Centrifuger la solution bactérienne pour récolter les filaments et décanter le surnageant. Lavez les filaments avec l’ajout doux d’un millilitre de saccharose 0,8 molaire, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.

Au bout d’une minute, jetez le surnageant sans déranger la pastille et ajoutez les réactifs indiqués dans leur ordre respectif aux filaments. Après dix minutes à température ambiante, ajoutez progressivement un millilitre de solution A sur une période d’une minute, tout en remuant doucement la solution à la main. Incuber la solution pendant quatre minutes à température ambiante, puis diviser la suspension du filament en deux aliquotes égales entre deux tubes coniques de 15 millilitres contenant sept millilitres de solution à quatre degrés Celsius. Ensuite, granulez les filaments par centrifugation et utilisez une pipette assyriologique pour retirer soigneusement tous les millilitres sauf un à deux millilitres de surnageant sans déranger les granules.

À l’aide d’une micropipette p1000, les granulés sont remis en suspension délicatement. Vérifiez une petite aliquote de l’échantillon pour la formation de sphéroplaste par microscopie optique. Le sphéroplaste peut ensuite être stocké à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine ou jusqu’à ce qu’il ait subi trois cycles de congélation et de dégel.

Pour préparer des protoplastes de B. megaterium à Gram positif, diluez la culture bactérienne de nuit dans un rapport de un à 1000 dans 100 millilitres de trois pour cent de TSB dans un ballon de 250 millilitres pour une incubation de 4,5 heures à 37 degrés Celsius avec agitation. Lorsque la culture liquide atteint une densité optique de 0,9 à 1,0 à 600 nanomètres, répartissez les bactéries entre deux tubes coniques de 50 millilitres pour leur centrifugation, et utilisez une pipette asyriologique pour aspérer les surnageants. Remettre les granulés en suspension dans 2,5 millilitres de milieu protoplast par tube, et tirer la suspension dans un seul tube conique pour la culture dans une fiole de 125 millilitres.

Ajouter un millilitre de lysozyme de cinq milligrammes par millilitre à la culture pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius en agitant. Surveiller la croissance du protoplaste au microscope optique et noter toute irrégularité, comme les bactéries qui apparaissent sous forme de bâtonnets gonflés au lieu de sphères. À la fin de l’incubation, transférez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation, et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu protoplaste.

Le protoplaste peut ensuite être stocké à moins 20 degrés Celsius jusqu’à une semaine ou jusqu’à ce qu’il ait subi trois cycles de congélation et de dégel. Pour visualiser le sphéroplaste ou le protoplaste, transférez cinq microlitres de la suspension d’intérêt sur une lame de verre revêtue de poly L Lysine, suivie de deux microlitres de fitc étiqueté 100 à 200 peptide antimicrobien micromolaire ou AMP. Après une incubation de trois minutes à l’abri de la lumière, ajoutez un microlitre d’une matrice de membrane appropriée à l’échantillon pour une autre incubation de trois minutes dans l’obscurité.

À la fin de l’incubation, couvrez le sphéroplaste ou le protoplaste étiqueté avec une lamelle en verre et scellez la lamelle avec le vernis à ongles. Pour imager les cellules, allumez le microscope confocal et le laser approprié et sélectionnez l’objectif 63x, puis utilisez le logiciel d’imagerie approprié pour obtenir des images composites Z de huit bits 512 par 512 composées de coupes de 0,5 micromètre de l’intégralité de chaque cellule bactérienne d’intérêt. Pour visualiser la localisation de l’AMP marqué par fluorescence, ouvrez les images de l’empilement Z composite dans un programme d’analyse d’imagerie approprié et localisez la tranche la plus centrale du premier sphéroplaste ou protoplaste d’intérêt.

Placez une région circulaire d’intérêt de 0,3 micromètre de diamètre sur la membrane, une au centre de la cellule, et une à l’écart de la cellule pour mesurer la fluorescence de fond, en prenant soin d’éviter les pixels saturés. L’intensité moyenne de fluorescence dans chaque région d’intérêt peut ensuite être calculée par le logiciel. Les limites de résolution des microscopes optiques conventionnels rendent difficile de distinguer si les signaux peptidiques marqués par fluorescence proviennent de la membrane ou de l’espace intracellulaire chez les bactéries normales.

Au fur et à mesure que les signaux se localisent à la membrane, ils semblent se chevaucher avec l’espace intracellulaire. En revanche, la taille plus grande du sphéroplaste et du protoplaste par rapport aux bactéries normales se traduit par une résolution claire entre le marqueur membranaire et l’espace intracellulaire. Faciliter la distinction de la localisation des peptides.

Par exemple, la localisation dans la membrane et la translocation à travers la membrane cellulaire d’un peptide marqué par fluorescence peuvent être visualisées à la fois dans le sphéroplaste d’E. coli et le protoplaste de B. megaterium, par microscopie confocale à fluorescence, comme nous venons de le démontrer. Le placement des régions d’intérêt sur la membrane et l’espace intracellulaire du sphéroplaste ou du protoplaste et en arrière-plan, permet de calculer le rapport entre l’intensité de fluorescence du peptide intracellulaire et l’intensité de fluorescence du peptide sur la membrane de chaque sphéroplaste ou protoplaste interagissant avec l’AMP. Par exemple, cette méthode peut être utilisée pour visualiser les interactions d’un mutant peptidique microbien dérivé d’une histones avec le sphéroplaste d’E. coli et les protoplastes de B. megaterium.

Dans cette expérience, l’AMP a démontré un modèle de localisation similaire dans les deux souches de bactéries. Mise en évidence de sa translocation réduite par rapport au peptide de type sauvage. En fin de compte, cette technique permet aux chercheurs d’explorer les modèles de localisation des peptides au niveau d’une seule cellule.

Offrir un aperçu du mécanisme d’action d’un peptide d’intérêt. En plus de permettre aux chercheurs de collecter un plus grand nombre d’images pour la caractérisation systématique des mécanismes peptidiques, les images de sphéroplastes et de protoplastes plus grands sont plus gérables pour l’analyse quantitative que celles de cellules bactériennes plus petites.